阅读说明：本技术 一种蛋白质除盐方法及其应用 (A kind of protein desalination method and its application ) 是由 赵海义 华权高 李立 陈亚运 赵慧芳 陶亦楠 舒芹 张雪娇 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及涉及一种蛋白质除盐方法及其应用。该蛋白质除盐方法包括以下步骤：(1)先用TFA溶解蛋白质样品,离心取上清；(2)用ACN润湿Zip Tip,再用TFA进行平衡；(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip数次吹吸使得步骤(1)中的样品至少通过吸附柱2次；再用冲洗液TFA进行冲洗；(4)再用洗脱液洗脱肽段；(5)SpeedVac抽干样品。本发明所提供的除盐方法,可以适用于经过磷酸化修饰富集处理的蛋白质中,克服了现有技术中除盐方法蛋白质损失大的问题,扩展了磷酸化修饰蛋白质组的应用范围,实现了磷酸化修饰蛋白质组从非标记到标记的跨越,将磷酸化修饰富集技术和标记技术更好地结合在了一起。(The present invention relates to be related to a kind of protein desalination method and its application.The protein desalination method is the following steps are included: (1) first uses TFA soluble protein quality sample, centrifuging and taking supernatant；(2) Zip Tip is soaked with ACN, then is balanced with TFA；(3) using wetting in step (2) and the Zip Tip after balance, pressure-vaccum makes the sample in step (1) at least through adsorption column 2 times for several times；It is rinsed again with flushing liquor TFA；(4) elution peptide fragment is used again；(5) SpeedVac drains sample.Desalination method provided by the present invention, it can be adapted for being enriched with by phosphorylation modification in the protein of processing, overcome the problem that desalination method protein losses are big in the prior art, extend the application range of phosphorylation modification protein group, leap of the phosphorylation modification protein group from non-marked to label is realized, phosphorylation modification beneficiation technologies and labelling technique are preferably combined togather.)

一种蛋白质除盐方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质除盐方法，具体涉及一种蛋白质除盐方法及其应用。

背景技术

同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and AbsoluteQuantitation，简称iTRAQ)和TMT(Tandem Mass Tag)是目前运用较为广泛的两种标记定量蛋白质组技术，通过与肽段N末端基团结合(还可以与赖氨酸侧链氨基进行结合，除了这两个结合位点，TMT不同类型试剂还有多种结合位点)，实现对多肽的标记，并通过不同分子量的试剂对不同来源样品进行标记的方法实现不同样品间蛋白质比较的目标，结合报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值，从而实现蛋白的定量比较。

磷酸化修饰是自然状态下，蛋白质发生的一种可逆修饰，常常伴随着蛋白激酶的作用，由于磷酸化修饰水平很低，所以从全蛋白中富集出发生磷酸化修饰的目的蛋白十分重要，基于磷酸根离子的性质，富集方法以金属离子和金属氧化物为主，例如TiO₂、Ti-IMAC、Fe-IMAC等。磷酸化肽段富集方法可便捷高效的将磷酸化修饰的肽段从全部肽段中分离出来，用于蛋白质组学分析。磷酸化修饰肽段富集技术中，样品经过裂解、还原烷基化、酶解处理之后，直接进行富集，在这个过程中，样品没有经过除盐处理，由于富集得到的样本量很少，常规组学中除盐方法并不适合这类样本，这是因为常规除盐方法有较大的损失，而经过富集之后的肽段是很微量的，然而，没有经过除盐处理的样品不能直接使用标记试剂标记，只能用于非标记蛋白质组学研究。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供了一种蛋白质除盐方法以及其应用。该除盐方法可以用于微量蛋白质的除盐，使其能够满足标记蛋白质组学的研究。

本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：

本发明提供了一种蛋白质除盐方法，包括以下步骤：

(1)先用TFA溶解蛋白质样品，离心取上清；

(2)用ACN润湿Zip Tip，再用TFA进行平衡；

(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip数次吹吸使得步骤(1)中的样品至少通过吸附柱2次；再用冲洗液TFA进行冲洗；

(4)再用洗脱液洗脱肽段；

(5)SpeedVac抽干样品。

其中，步骤(1)中TFA与蛋白质样品的用量比例为：每100μg蛋白质用40-60μl0.2％TFA溶液溶解。

其中，步骤(1)中TFA的终浓度为0.1％-1％，pH＜4。

其中，步骤(2)中的ACN的质量浓度为40-60％，TFA的质量浓度为0.05-0.15％。

其中，步骤(3)中冲洗液TFA的浓度为0.05-0.15％。

其中，步骤(4)中洗脱液为含有40-60％ACN和0.05-0.15％TFA的混合液。

优选地，本发明所提供的一种蛋白质除盐方法，包括以下步骤：

(1)用0.2％TFA溶液溶解样品，TFA的终浓度为0.1-1％，pH＜4，离心取上清；

(2)反复用50％ACN润湿液润湿Zip Tip，再用0.1％TFA平衡；

(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip数次吹吸使得步骤(1)中的样品至少通过吸附柱2次；再用0.1％TFA冲洗液进行冲洗；

(4)再用含有50％ACN和0.1％TFA的混合液洗脱肽段；

(5)SpeedVac抽干样品。

更优选地，本发明所提供的一种蛋白质除盐方法，包括以下步骤：

(1)用0.2％TFA溶液溶解样品，TFA的终浓度为0.1-1％，pH＜4，离心取上清；

(2)反复用50％ACN润湿液吹吸15次润湿Zip Tip，再用0.1％TFA洗吹10次平衡；

(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip数次吹吸使得步骤(1)中的样品至少通过吸附柱2次；再用0.1％TFA冲洗液吹打5次进行冲洗；

(4)再用含有50％ACN和0.1％TFA的混合液反复吹打15次洗脱肽段；

(5)SpeedVac抽干样品。

本发明还提供了一种上述蛋白质除盐方法的应用，蛋白质经过磷酸化修饰肽富集处理后，再经过除盐处理，用于标记蛋白质组学的研究技术中。

其中，标记蛋白质组学的研究技术为iTRAQ或TMT标记定量蛋白质组技术。

其中，TFA为三氟乙酸，ACN为乙腈。

本发明先将待除盐的样品肽段用0.1％TFA溶解、离心去除不溶解的杂质，再将ZipTip除盐柱用50％乙腈溶液活化，再用TFA溶液平衡达到能够更好的吸附肽段的目的，然后再将待除盐的肽段挂到Zip Tip除盐柱柱子上，通过0.1％的TFA溶液洗脱盐分和杂质，最后用50％的ACN、0.1％的TFA混合溶液洗脱肽段，收集肽段抽干，质谱上机检测。

本发明具有以下有益技术效果：

(1)本发明所提供的除盐方法，可以适用于经过磷酸化修饰富集处理的蛋白质中，克服了现有技术中除盐方法蛋白质损失大的问题，扩展了磷酸化修饰蛋白质组的应用范围，实现了磷酸化修饰蛋白质组从非标记到标记的跨越，将磷酸化修饰富集技术和标记技术更好地结合在了一起；

(2)经过流程的优化，磷酸化富集技术可以从非标记蛋白质组学扩展到标记蛋白质组学，从样本数量以及适用范围都有了很大的提升，扩展了此项技术的应用场景，为磷酸化修饰蛋白质组学更好地服务于科研或临床课题提供了技术保证；

(3)由于操作过程中存在实验误差和系统误差，微量除盐能够较好的减少系统误差，使除盐前后样品量的变化保持在误差允许范围内，可以将每个样本的量控制在同一水平；

(4)使用数次微量除盐达到除盐目的，经过除盐处理，再进行iTRAQ或TMT标记的蛋白质组学研究，使得多个样本可以在同一水平上进行分析和研究，在科研及临床样本中广泛应用。

附图说明

图1为对比例与实施例1中蛋白标记效率的结果；

图2为对比例与实施例1中磷酸化修饰蛋白鉴定数目的结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

取拟南芥叶片经过清洗、匀浆、裂解、超声等提取得到蛋白，下一步进行还原烷基化，通过蛋白质凝胶电泳对提取的蛋白进行评价，然后过夜酶解，次日进行磷酸化修饰肽富集和微量除盐，最后用于iTRAQ等标记，分级之后进行LC-MS/MS检测。

磷酸化修饰富集流程图如下：

其中微量除盐的步骤如下：

(1)先用50μl 0.2％pH＜4的TFA溶液溶解适量磷酸化富集后得到的蛋白质样品，12000rpm离心2min取上清；

(2)调整移液器的量程到10μl处，装好Zip Tip小柱，放入50％ACN溶液中，反复吹打15次润湿Zip Tip，再将润湿后的Zip Tip小柱放入到0.1％的TFA溶液中，反复吹打10次平衡Zip Tip小柱；

(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip吹吸7次使得步骤(1)中的样品完全通过吸附柱，即将平衡好的Zip Tip小柱放入离心后的上清样品中，反复吹打7次，让肽段能很好地吸附在Zip Tip小柱上；再用0.1％TFA冲洗液进行冲洗去除一些非磷酸化修饰的肽段，即用0.1％TFA冲洗液的吹打5次，为避免交叉污染，按每管400μl分装冲洗液，每个样品单独用一管，每个样本做4个重复。

(4)再用50％ACN和0.1％TFA混合溶液进行洗脱，即取50μl洗脱液到干净的EP管中，反复吹打15次进行洗脱，每个重复洗脱4次，即在4管洗脱液中各洗脱15次。

(5)SpeedVac抽干样品。

实施例2

取拟南芥叶片经过清洗、匀浆、裂解、超声等提取得到蛋白，下一步进行还原烷基化，通过蛋白质凝胶电泳对提取的蛋白进行评价，然后过夜酶解，次日进行磷酸化修饰肽富集和微量除盐，最后用于iTRAQ等标记，分级之后进行LC-MS/MS检测。

磷酸化修饰富集流程图如下：

其中微量除盐的步骤如下:

(1)先用先用40μl 0.7％pH＜4的TFA溶液溶解适量磷酸化富集后得到的蛋白质样品，10000rpm离心5min取上清；

(2)调整移液器的量程到10μl处，装好Zip Tip小柱，放入40％ACN溶液中，反复吹打12次润湿Zip Tip，再将润湿后的Zip Tip小柱放入到0.05％的TFA溶液中，反复吹打8次平衡Zip Tip小柱；

(3)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip吹吸5次使得步骤(1)中的样品完全通过吸附柱，即将平衡好的Zip Tip小柱放入离心后的上清样品中，反复吹打5次，让肽段能很好地吸附在Zip Tip小柱上；再用0.05％TFA冲洗液进行冲洗去除一些非磷酸化修饰的肽段，即用0.05％TFA冲洗液的吹打8次，为避免交叉污染，按每管400μl分装冲洗液，每个样品单独用一管，每个样本做4个重复；

(4)再用40％ACN和0.05％TFA混合溶液进行洗脱，即取50μl洗脱液到干净的EP管中，反复吹打15次进行洗脱，每个重复洗脱2次，即在4管洗脱液中各洗脱20次；

(5)SpeedVac抽干样品。

实施例3

取人肝癌组织经过清洗、匀浆、裂解、超声等提取得到蛋白，下一步进行还原烷基化，通过蛋白质凝胶电泳对提取的蛋白进行评价，然后过夜酶解，次日进行磷酸化修饰肽富集和微量除盐，最后用于iTRAQ等标记，分级之后进行LC-MS/MS检测。

磷酸化修饰富集流程图如下：

其中微量除盐的步骤如下：

(1)先用先用60μl 1％pH＜4的TFA溶液溶解适量磷酸化富集后得到的蛋白质样品，10000rpm离心8min取上清；

(2)调整移液器的量程到10μl处，装好Zip Tip小柱，放入60％ACN溶液中，反复吹打18次润湿Zip Tip，再将润湿后的Zip Tip小柱放入到0.15％的TFA溶液中，反复吹打12次平衡Zip Tip小柱；

(6)采用步骤(2)中润湿和平衡后的Zip Tip吹吸8次使得步骤(1)中的样品完全通过吸附柱，即将平衡好的Zip Tip小柱放入离心后的上清样品中，反复吹打8次，让肽段能很好地吸附在Zip Tip小柱上；再用0.15％TFA冲洗液进行冲洗去除一些非磷酸化修饰的肽段，即用0.15％TFA冲洗液的吹打4次，为避免交叉污染，按每管400μl分装冲洗液，每个样品单独用一管，每个样本做4个重复；

(7)再用60％ACN和0.15％TFA混合溶液进行洗脱，即取50μl洗脱液到干净的EP管中，反复吹打15次进行洗脱，每个重复洗脱7次，即在4管洗脱液中各洗脱10次；

(8)SpeedVac抽干样品。

对比例

取拟南芥叶片经过清洗、匀浆、裂解、超声等提取得到蛋白，下一步进行还原烷基化，通过蛋白质凝胶电泳对提取的蛋白进行评价，然后过夜酶解，次日进行磷酸化修饰肽富集，最后用于iTRAQ等标记，分级之后进行LC-MS/MS检测，对比例与实施例1的区别在于磷酸化富集后的样本未经过微量除盐处理直接进行标记检测。

对比例与实施例1中蛋白标记效率的结果如图1所示，对比例与实施例1中磷酸化修饰蛋白鉴定数目的结果如图2所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。