一种柑橘属中药的在线活性筛选方法
阅读说明：本技术 一种柑橘属中药的在线活性筛选方法 (On-line activity screening method of citrus traditional Chinese medicine ) 是由 曹君 闫天赐 乐紫璇 顾郁欣 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及酶抑制剂筛选领域,针对传统的酶抑制剂筛选方法效率低的问题,提供一种柑橘属中药的在线活性筛选方法,采用电泳介导的微量分析法EMMA,在毛细管中用脂肪酶催化水解底物的一步反应,然后在紫外400nm处直接测定产物峰面积实现脂肪酶抑制剂的在线筛选,最后利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行验证。本发明将酶抑制剂的筛选与毛细管电泳相结合,不仅实现了脂肪酶抑制剂的在线筛选,也极大地提高了酶抑制剂筛选的效率,与传统的酶抑制剂筛选方法相比,本方法具有更短的分析时间、更高的分离效率、更少的试剂消耗。(The invention relates to the field of enzyme inhibitor screening, and provides an on-line activity screening method of citrus traditional Chinese medicines aiming at the problem of low efficiency of the traditional enzyme inhibitor screening method. The method combines the screening of the enzyme inhibitor with capillary electrophoresis, not only realizes the on-line screening of the lipase inhibitor, but also greatly improves the screening efficiency of the enzyme inhibitor.)
技术领域
本发明涉及酶抑制剂筛选领域，尤其是涉及一种柑橘属中药的在线活性筛选方法。
背景技术
肥胖已被世界卫生组织(WHO)视为人类最大的流行病，它是导致一系列病理状况的重要危险因素，如高血压、肾脏疾病、糖尿病、高脂血症、冠心病、精神障碍和某些癌症。研究表明，肥胖是由脂肪过度或异常积累引起的。甘油三酯是体内含量最丰富的脂肪类型，主要储存在脂肪组织中。脂肪酶，也称为三酰甘油酰基水解酶，是一类酯酶，在甘油三酯的完全消化中起关键作用，能够将50％至70％的膳食脂肪水解为甘油和脂肪酸。因此，抑制脂肪酶的活性可以有效抑制脂肪的水解和吸收，从而达到减肥的效果。抑制脂肪酶活性是对抗肥胖及其相关疾病的热门话题。奥利司他是唯一被批准用于长期体重管理的脂肪酶抑制剂。然而，它经常表现出强烈的胃肠道副作用，例如胀气、恶心、腹泻和呕吐。因此，寻找安全、有效、新型的脂肪酶抑制剂来治疗肥胖症是非常紧迫和必要的。
天然产物因含有丰富的生物活性化合物而备受关注。柑橘属果实是世界各国的主要食用果实，也是我国的传统药用植物。它是黄酮类最重要的膳食来源之一。柑橘属黄酮，含有多个酚羟基，例如橙皮苷和柚皮苷等苷类。相关研究表明，柑橘类黄酮具有许多生物活性，例如抗氧化、抗病毒、抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等。研究表明，柑橘属黄酮通过直接或间接介导AMPK、PPAR和NF-κB信号通路来调节抗氧化的指标进而治疗肥胖，但其对脂肪酶活性的影响鲜有报道。因此，本实验选择从柑橘属黄酮类化合物中进行脂肪酶抑制剂的筛选。
传统的酶分析方法是将酶和底物离线孵育，然后用分光光度计或酶标仪测定结果。但是该方法自动化程度低、时间长、样品消耗大，不适合酶抑制剂的高通量筛选。近年来，一些新的酶学分析方法，如超滤、中空纤维固定和磁性纳米颗粒固定，已被用于酶抑制剂筛选实验。然而，这些方法也只能用于离线分析。如今，毛细管电泳(CE)作为一种在线酶分析工具已经引起了广泛的关注。研究表明，CE因分析时间短、易于自动化、分离效率高、试剂消耗少等优点，被广泛应用于酶抑制剂的筛选和酶动力学参数的测定。电泳介导的微量分析(EMMA)是CE中广泛使用的一种模式。在EMMA中，毛细管用作微反应器，其中反应物可以连续注入同一毛细管中进行酶促反应、分离和检测。Lilin Tang等人使用EMMA方法筛选中药中的酪氨酸酶抑制剂。Jing Han等人通过EMMA法从12种中药提取物中筛选出一种具有组织蛋白酶B抑制活性的中药。Hairong Wang等人开发了一种用于筛选氨肽酶N抑制剂的EMMA方法(王海荣.2015.氨肽酶N抑制剂毛细管电泳在线筛选方法的研究.Doctoraldissertation,山东大学.)。然而，由于脂肪酶底物难以溶解并且溶解后稳定性差，目前鲜有报道用EMMA方法筛选脂肪酶抑制剂。
发明内容
本发明为了克服传统的酶抑制剂筛选方法效率低的问题，提供一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，将酶抑制剂的筛选与毛细管电泳相结合，不仅实现了脂肪酶抑制剂的在线筛选，也极大地提高了酶抑制剂筛选的效率。与传统的酶抑制剂筛选方法相比，本方法具有更短的分析时间、更高的分离效率、更少的试剂消耗。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种柑橘属中药的在线活性筛选方法，采用电泳介导的微量分析法EMMA，在毛细管中用脂肪酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外400nm处直接测定产物峰面积实现脂肪酶抑制剂的在线筛选，最后利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行验证；
所述电泳介导的微量分析法包括以下步骤：
(1)预处理：将背景电解质溶液BGE预先注入毛细管；
(2)注射：先将脂肪酶溶液注入毛细管，再注入含或不含抑制剂的底物溶液；
(3)混合：施加+1.0kV电压使脂肪酶和底物溶液充分混合；
(4)孵化：毛细管在没有外部压力和电压的情况下静置；
(5)分离：恒定电压下将产物与未反应的底物分离。
本发明开发了一种毛细管电泳介导的在线筛选脂肪酶抑制剂的方法(EMMA方法)，并结合分子对接技术评估柑橘属中药材的抑制活性。通过测量脂肪酶的米氏常数(Km)来评估EMMA方法的有效性，并测量了一种市售的脂肪酶抑制剂奥利司他的半数最大抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki)。同时，用该发明评价了柑橘属中药材提取物和几种黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用，筛选出了具有脂肪酶抑制潜力的化合物。此外，用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)对提取物中黄酮类化合物的类型和含量进行分析。最后，利用分子对接研究从理论上验证了黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用。
作为优选，步骤(1)所述BGE选自：硼砂、磷酸氢二钠、乙酸钠和Tris-HCl缓冲液中的一种。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE为硼砂
作为优选，步骤(1)所述BGE的浓度为10-40mM。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE的浓度为20mM。
作为优选，步骤(1)所述BGE的pH为6.4-9.0。作为进一步优选，步骤(1)所述BGE的pH为8.8。
作为优选，步骤(2)所述底物溶液的制备方法为：将0.1％-0.2％(w/v)的4-硝基苯基月桂酸酯溶解在含有1％-2％Triton X-100的5-10mM醋酸钠中，并在沸水中加热帮助溶解，然后将溶液冷却至室温，制得底物溶液。
作为优选，步骤(2)中毛细管每次进样后，进样端都要浸入去离子水中清洗。以防止相互污染。
作为优选，步骤(3)所述混合的条件为：施加+1.0kV电压混合5-35s。作为进一步优选，步骤(3)所述混合的时间为25s。
作为优选，步骤(4)所述静置的时间为1-5min。作为进一步优选，步骤(4)所述静置的时间为3min。
作为优选，步骤(5)所述恒定电压为20-25kV。
因此，本发明的有益效果为：(1)建立了一种基于毛细管电泳的脂肪酶抑制剂在线筛选方法；(2)利用分子对接技术对脂肪酶抑制剂的筛选结果进行了验证；(3)本方法快速、高效、成本低，适用于酶抑制剂的高通量筛选。
附图说明
图1是实施例1-4不同种类的背景缓冲液在线反应后的电泳图；
图2是实施例5-8不同硼砂浓度下产物的表观迁移率和峰面积图；
图3是实施例9-13硼砂不同pH值下产物的表观迁移率和峰面积图；
图4是实施例14-18不同混合时间下产物的峰面积图；
图5是实施例19-23不同孵育时间下产物的峰面积图；
图6是不同底物浓度(0.2～4mM)下脂肪酶酶促反应的米氏方程图(a)和双倒数曲线图(b)；
图7是奥利司他的抑制曲线图；
图8是脂肪酶与桔皮素(A)、川陈皮素(B)、橙皮素(C)、柚皮素(D)的分子对接图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一、试剂准备
1、背景电解质溶液(BGE)：将硼砂溶解于超纯水中，使其终浓度为20mM，并用1.0M硼酸和1.0M NaOH溶液调节pH值。
2、酶溶液：将脂肪酶溶解在20mM硼砂溶液中使最终浓度为50mg/mL，酶溶液置于1.5mL离心管中，于冰箱中4℃保存。
3、底物溶液：将0.1％(w/v)的4-硝基苯基月桂酸酯溶解在含有1％Triton X-100的5mM醋酸钠中，并在沸水中加热2min以帮助溶解，然后将溶液冷却至室温以备进一步使用。
4、目标分析物溶液：将八种黄酮类化合物溶解在甲醇中，并用50％的甲醇(甲醇:DMSO＝1:1)稀释至合适的浓度。所有溶液在使用前用0.22μm尼龙膜过滤。
5、药材提取液制备：干燥的柑橘属药材用高速粉碎机粉碎，过40目筛。将500mg果实粉末和50mL甲醇加入带盖锥形瓶中，然后将混合物以40kHz超声处理40分钟。超声提取后，将混合物过滤。滤液在75℃下水浴蒸干，残渣用4mL的50％的DMSO(甲醇:DMSO＝1:1)溶解。完全溶解后，将溶液以13,000rpm的速度离心5分钟，并将上清液收集到离心管中备用。
二、使用仪器
1、EMMA方法是在配备二极管阵列检测器和安捷伦化学工作站软件的安捷伦7100HP3D CE系统上进行。用于CE分离的裸露熔融石英毛细管(50μm内径；48.5cm全长；40cm有效长度)购自永年瑞丰色谱设备有限公司(中国河北)。毛细管恒温25℃，检测器设置UV波长400nm。使用购自上海仪电科学仪器有限公司(中国上海)的PHS-3C pH计测量和调节溶液的pH值。新毛细管使用前分别用1M NaOH和0.1M NaOH冲洗10分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。实验开始前，用运行缓冲液冲洗毛细管3到5分钟，以使毛细管稳定。在两次运行之间，毛细管依次用0.1M NaOH冲洗2分钟、水冲洗2分钟和BGE溶液冲洗3分钟。每天实验结束时，用去离子水清洗毛细管3分钟，以确保其内表面清洁。
2、用于定性分析的UHPLC-Q-TOF/MS系统配备有自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、二元泵、在线脱气机和配备有ESI源的Agilent 6560QTOF MS系统。目标分析物的色谱分离在Agilent SB-C18色谱柱(50mm×2.1mm×1.8μm)上进行。流动相为0.1％甲酸水(A相)和乙腈(B相)。洗脱梯度的步骤如下：0-2分钟，5-20％的B相；在2-4分钟，20-30％的B相；4-6分钟，30％的B相；6-8分钟，30-100％的B相；8-9分钟时，100％的B相；9-10分钟时100％–5％的B相。流速为0.4mL/min，进样量为2μL。负离子模式用于QTOF-MS分析，质荷比范围记录为100至1000Da。最佳电离参数为：毛细管电压，3.5kV；雾化器，35psig；碎片电压，175V；干燥气体温度，300℃；鞘气温度，350℃；干燥气流速和鞘气流速分别为10L/min和11L/min。
三、筛选方法的建立
1、实施例1-4BGE种类的选择
实施例1-4研究了四种常用的运行缓冲液对产物的峰面积、峰的对称性和迁移时间的影响，分别为20mM的硼酸钠、磷酸氢二钠、乙酸钠和Tris-HCl缓冲液。其他实验条件相同，均为：50mbar压力下进样6s；样品混合，1.0kV×25s；孵育时间，3分钟；分离电压：25kV；脂肪酶浓度：50mg/mL；底物浓度：1mg/mL；检测波长：400nm；柱温25℃。
如图1所示，产物在这四种缓冲溶液中的迁移时间差别不大。并且与另外两种缓冲液相比，乙酸钠缓冲液和硼砂缓冲液中产物的峰面积更大，这可能是由于缓冲液会影响酶与底物的相互作用。另外，醋酸钠缓冲液中有一个杂质峰，可能是反应过程中的副产物。并且，在硼砂缓冲液中，产物峰的对称性最好。综合以上所有因素，发现硼砂缓冲溶液是所有四种缓冲溶液中最好的。
2、实施例5-8BGE浓度的优化
实施例5-8研究了四种浓度的硼砂溶液下产物的峰面积，分别为10mM、20mM、30mM和40mM。其他实验条件相同，均为：50mbar压力下进样6s；样品混合，1.0kV×25s；孵育时间，3分钟；分离电压：25kV；脂肪酶浓度：50mg/mL；底物浓度：1mg/mL；检测波长：400nm；柱温25℃。
如图2所示，随着硼砂浓度的增加，产物的峰面积先增大后减小，当浓度为20mM时峰面积达到最大值。原因可能为低浓度的硼砂(10mM)不足使反应产物有效电离，而高浓度的硼酸钠(40mM)会抑制脂肪酶的活性。此外，结果表明产物的表观迁移率随着硼砂浓度的增加而降低。这是由于高浓度缓冲液会产生过多的焦耳热并增加其粘度以降低EOF，从而延长迁移时间。表观迁移率(μa)可以通过公式计算(2)
其中U为电压，tp为产物的迁移时间，La为毛细管全长，Le为有效毛细管长度。综上可得，浓度为20mM的硼酸钠缓冲溶液最适合分离并且具有最大目标分析物响应和较低焦耳热产生。
3、实施例9-13BGE溶液pH的优化
实施例9-13研究了BGE溶液pH对样品分离的影响，pH通过影响EOF和酶的活性在样品分离中起着至关重要的作用，分别对具有相同浓度(20mM)但pH值分别为6.4、7.0、8.0、8.8和9.0的硼砂缓冲溶液进行测定。其他实验条件相同，均为：50mbar压力下进样6s；样品混合，1.0kV×25s；孵育时间，3分钟；分离电压：25kV；脂肪酶浓度：50mg/mL；底物浓度：1mg/mL；检测波长：400nm；柱温25℃。
从图3结果可以看出，产物的峰面积在pH为8.8时最大，说明当缓冲液pH为8.8时脂肪酶的活性达到最大。同时，产物的表观流动性没有显着变化，表明pH值对EOF的影响很小。综上，选择pH为8.8的缓冲液进行后续实验。
4、实施例14-18反应时间对反应产物收率的影响
反应时间对在线酶促反应有很大影响。在EMMA程序中，将酶和底物充分混合是很重要的。因此，实施例14-18通过施加+1.0kV的混合电压来研究混合时间(5、10、15、20、25、30、35s)对反应产物4-硝基苯酚(pNP)产率的影响。其他实验条件相同，均为：50mbar压力下进样6s；分离电压：25kV；脂肪酶浓度：50mg/mL；底物浓度：1mg/mL；检测波长：400nm；柱温25℃。
图4展示了混合时间与产物峰面积之间的关系。可以看出，产品的峰面积随着混合时间的增加而增加，混合时间为25s时峰面积达到最大。当混合时间超过25s时，产物的峰面积减小。因此，选择25s的混合时间用于后续实验。
5、实施例19-23孵育时间对反应产物收率的影响
实施例19-23在实施例14-18筛选出25s的混合时间基础上研究了孵育时间(1、2、3、4、5分钟)的影响。如图5所示，产物的形成在3分钟内几乎是线性的，而在3分钟后观察到产物生成速率下降，这可能是由于底物的量不够。因此，选择3分钟的孵育时间作为最优时间。
四、结果验证及在柑橘属中药的在线活性筛选中的应用
1、脂肪酶动力学参数的测定
Km取决于反应条件和酶的类型，它可以大致表示酶与底物之间的亲和力。如图6a和6b所示，通过测量6种不同底物浓度(0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM)下的产物峰面积，构建Lineweaver-Burk非线性曲线和双倒数图。根据等式(3)：
得到的双倒数线性回归方程为y＝0.02830x+0.02103，R2＝0.9900，计算出脂肪酶的Km值为1.345mM。与文献报道的EMMA法测定的值(1.28mM-3.44mM)基本一致。
为了验证该方法，使用已知抑制剂奥利司他通过在0.001μg/mL至2000μg/mL范围内改变其浓度来建立抑制曲线图(图7)。奥利司他的IC50为0.01512μg/mL，这比离线法低，表明本研究开发的EMMA方法适于筛选脂肪酶抑制剂。另一方面，由公式(4)计算的Ki值为0.0087μg/mL。
2、从柑橘属黄酮中筛选脂肪酶抑制剂
选择柑橘中的八种常见黄酮类化合物(浓度为150μg/mL)进行脂肪酶抑制剂的筛选。与未添加抑制剂的空白对照组比较，测定抑制率，列于表1。结果表明，八种黄酮类化合物均表现出抑制潜力，抑制率范围为30％～46％，与前人研究结果一致。此外，四种黄酮苷元的抑制率均在40％以上，而四种黄酮苷的抑制率均低于40％。原因可能是糖基的存在会降低化合物的抑制活性。此外，还比较了四种黄酮苷元的抑制活性，发现羟基在7'位时抑制活性最高。另外，通过比较川陈皮素和桔皮素发现，苯环上的甲氧基越多，其抑制活性越差。
表1黄酮类化合物的抑制率
化合物
抑制率
化合物
抑制率
橙皮苷
30.53％
橙皮素
43.42％
芸香柚皮苷
38.66％
柚皮素
45.66％
新橙皮苷
35.01％
川陈皮素
41.17％
柚皮苷
33.05％
桔皮素
43.69％
3、分子对接研究
为进一步验证抑制实验的结果，采用分子对接研究模拟桔皮素、川陈皮素、橙皮素和柚皮素与脂肪酶晶体结构的结合模式。最佳结合构象见于图8，脂肪酶与四种化合物形成氢键的氨基酸残基列于表2。对接结果显示柚皮苷的结合能最低，表明其抑制活性最高，与抑制实验结果一致。此外，柚皮苷与TRY-115、ASP-80、HIS-152和TRP-86形成氢键，说明TRY-115、ASP-80、HIS-152和TRP-86与脂肪酶的催化活性密切相关。脂肪酶的催化活性。抑制剂与脂肪酶的氨基酸残基形成氢键会影响酶与底物的相互作用。而且，结果表明苯环上的羟基越多，形成的氢键就越多，这表明抑制剂与脂肪酶的结合能力与苯环上取代基的类型和数量有关。
表2橘皮素、桂皮素、橙皮素、柚皮素与脂肪酶的对接结果
4、从柑橘属中药材中筛选脂肪酶抑制剂
采用本实验建立的抑制剂筛选方法研究了六种柑橘属植物提取物的抑制活性，抑制率结果见表3。此外，用八种黄酮类化合物混合标准品作为对照，采用UHPLC-Q-TOF/MS分析提取物中黄酮类化合物的种类和含量，结果见表4。在测定的柑橘类提取物中，橘络提取物的抑制活性最高，抑制率为40.67％。
表3柑橘药材甲醇提取物的抑制率
药材
抑制率
药材
抑制率
枳壳
34.29％
佛手
22.94％
陈皮
31.50％
枳实
21.10％
橘络
40.67％
化橘红
30.89％
表4柑橘属药材中目标分析物的含量
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。