一种快速检测花椒果皮中总酰胺含量的电化学方法
阅读说明：本技术 一种快速检测花椒果皮中总酰胺含量的电化学方法 (The electrochemical method of total ceramide content in a kind of quick detection Chinese prickly ash pericarp ) 是由 邹小波 赵镭 张迪 史波林 孙晓霞 于 2019-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品检测领域,涉及一种快速检测花椒果皮中总酰胺含量的电化学方法；步骤为:将干燥花椒果皮粉碎过筛,干粉经无水乙醇提取、洗渣并液、稀释定容,得到花椒酰胺提取液；将提取液同电解质溶液混合配置成花椒酰胺检测工作液,其中解质溶液为含有乙醇的磷酸缓冲液；在多次加入标准物羟基-α-山椒素的过程中测定检测工作液的差分脉冲伏安曲线,绘制多次标准加入法工作曲线图,计算得出检测溶液中的总酰胺含量,换算得到花椒果皮样品中的总酰胺含量,即羟基-α-山椒素当量值；本发明解决了现有花椒总酰胺定量检测方法无法实现快速、低成本、准确性兼得的问题,本检测方法能够对花椒果皮中总酰胺含量进行快速、便携、准确检测。(The invention belongs to field of food detection, are related to a kind of electrochemical method for quickly detecting total ceramide content in Chinese prickly ash pericarp；Step are as follows: by the dry broken sieving of Chinese prickly ash fruit peel powder, dry powder obtains fagaramide extracting solution through dehydrated alcohol extraction, washery slag and liquid, dilution constant volume；Extracting solution is mixedly configured into fagaramide detection working solution with electrolyte solution, wherein electrolyte solution is the phosphate buffer containing ethyl alcohol；The differential pulse voltammetry curve of measurement detection working solution during reference substance hydroxyl-alpha-sanshool is repeatedly added, draw Multiple Standard Addition Method working curve diagram, the total ceramide content in detection solution is calculated, conversion obtains the total ceramide content in Chinese prickly ash peel sample, i.e. hydroxyl-alpha-sanshool equivalent value；The present invention solves the problems, such as that existing Chinese prickly ash total ceramide quantitative detecting method cannot achieve quick, inexpensive, accuracy and get both, this detection method can carry out quick, portable, accurate detection to total ceramide content in Chinese prickly ash pericarp.)
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及一种快速检测花椒中总酰胺含量的电化学方法。
背景技术
花椒是中国传统“八大调味品”之一，因其具有独特的麻味而深受国民喜爱。引起花椒麻味的主要成分是链状多不饱和脂肪酸酰胺，统称花椒酰胺，其中羟基-α-山椒素(Hydroxyl-α-sanshool，α-SOH)、羟基-β-山椒素(Hydroxyl-α-sanshool，α-SOH)、羟基-γ-山椒素(Hydroxyl-α-sanshool，α-SOH)、羟基-ε-山椒素(Hydroxyl-α-sanshool，α-SOH)是最具代表性的酰胺类物质，占总酰胺含量的98％以上。
花椒酰胺含量的高低是衡量花椒品质的一个重要指标，也是花椒质量分级的重要依据。目前能够准确测量花椒酰胺含量的仪器检测方法是高效液相色谱法(HPLC)或高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)；专利文献201711217038.4中公开了一种利用HPLC设备检测花椒样品中的花椒酰胺含量的方法，但高效液相色谱仪器价格昂贵、操作程序较复杂、检测环境要求高且无法便携使用，这些局限性阻碍了该方法在行业中的大规模应用。
现有文献公开了一种花椒麻味素类物质含量快速检测方法包括：总酰胺浸膏的提取；酰胺转变为铵态氮；铵态氮含量测定。该方法属于间接测定花椒酰胺的一种滴定方法，其中总酰胺提取和酰胺转变为铵态氮等前处理过程总耗时长达2-6小时；而且滴定操作程序繁杂，滴定终点易出现误判。目前，尚未有公开方法能够同时实现花椒酰胺含量的快速、便携、准确、低成本检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前检测花椒样品中花椒酰胺方法操作复杂，成本较高等问题，提供一种操作简单、方便快速、检测成本低，能够实现对花椒原料中总花椒酰胺含量进行快速、准确、便携检测的电化学方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：一种快速检测花椒中总酰胺含量的电化学方法，具体步骤如下：
(1)花椒果皮样品准备；
除去萎蔫或褐变的干燥花椒果皮，粉碎，经筛网筛选，得到花椒粉，-20℃条件下冷藏待检测；
(2)检测母液的制备；
称取步骤(1)所得的花椒粉，质量为W，加入无水乙醇A，震荡摇匀，常温条件下进行超声浸提，得到粗提液；将粗提液进行离心，收集上清液；收集滤渣另加入无水乙醇B，震荡后再次离心，收集上清液；如此重复，混合多次收集的上清液，即为检测母液，记录总体积V，冷藏待用；整个步骤在避光条件下操作；
(3)差分脉冲伏安法分析；
根据多次标准加入法的原理向样品检测溶液滴加一定体积的羟基-α-山椒素标准溶液(α-SOH)，随后利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
配置电解检测溶液，电解检测溶液的组成为无水乙醇和PBS缓冲液的混合溶液；吸取步骤(2)制备得到的检测母液，体积记为V1，用电解检测溶液稀释，获得样品检测溶液A，体积记为V2，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
第二次吸取检测母液，体积为V1，用电解溶液稀释至体积为V2，重新配制待检测溶液，然后加入α-SOH标准液，加入体积记为V3，得到混合溶液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
第三次吸取检测母液，体积为V1，用电解溶液稀释至体积为V2，重新配制待检测溶液，加入2倍V3体积的α-SOH标准液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
第四次吸取检测母液，体积为V1，用电解溶液稀释至体积为V2，重新配制待检测溶液，加入3倍V3体积的α-SOH标准液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；依此类推，重复操作；
最后以α-SOH标准液的质量浓度为横坐标，其对应的峰电流为纵坐标做线性回归，对应的差分脉冲伏安峰电流为纵坐标做线性回归曲线，线性回归曲线与横坐标交点的绝对值，即为样品检测溶液中的总酰胺含量，记为m；
(4)总酰胺含量计算；
根据步骤(3)得到的样品检测溶液中的总酰胺含量，进一步按下述公式换算得到检测母液中的的总酰胺含量，即α-SOH当量含量：
该公式中，M：花椒样品中总酰胺含量，μg/g；m：样品检测溶液中的总酰胺含量(依据多次标准加入法工作曲线计算)，μg α-SOH当量/mL；V1：配制样品检测溶液时使用的检测母液体积；V2：样品检测溶液的体积；V：检测母液总体积，mL；W：花椒粉质量，g；a：系统误差矫正系数。
优选的，步骤(1)中，所述筛网的目数为20～40目。
优选的，步骤(2)中，所述花椒粉与无水乙醇A的用量比为5-25g：25-100mL；所述超声浸提时间为20～40min。
优选的，步骤(2)中，所述离心条件均为：转速2000～3000r/min，时间为3～8min。
优选的，步骤(2)中，所述滤渣和无水乙醇B的用量比为1g：(1-6)mL。
优选的，步骤(3)中，电解检测溶液中无水乙醇和PBS缓冲液的体积比为1～3：7～9；PBS缓冲液的浓度为0.1M。
优选的，步骤(3)中，所述检测母液的体积V1与样品检测溶液的体积V2之比为(0.03-0.5)：10。
优选的，步骤(3)中，所述检测母液的体积V1与加入的α-SOH标准液的体积V3的之比为(3-12)：1；所述α-SOH标准溶液浓度为1.0～10.0g/L。
优选的，步骤(3)中，三电极体系组成为工作电极(玻碳电极)、参比电极(Ag/AgCl电极)、辅助电极(铂丝电极)；差分脉冲伏安法的检测条件参数为：正向扫描，+0.6V-+1.2V；电位阶跃4mV；振幅0.05V；脉宽0.05s；采样宽度0.0167s；脉冲周期0.5s。
优选的，步骤(3)中，所述重复操作的次数为4～6次。
有益效果：
(1)本发明首次建立了花椒果皮中总花椒酰胺含量的电化学检测方法，与目前国内外现有花椒酰胺检测方法相比，本方法所使用的仪器具有便携、低成本、操作简单的特点。
(2)本发明所述的电化学检测方法中所用的裸玻碳电极，无需对电极进行复杂的修饰处理，操作简便。
(3)本发明所述的电化学检测方法检测准确性高，与HPLC-MS法测定结果的误差率低于6％，检测速度快(差分脉冲伏安扫描均在2分钟内完成)，可用于对花椒总酰胺进行快速准确定量。
(4)本发明所述的电化学检测方法有望发展为HPLC-MS的替代方法，对花椒及其制品中花椒总酰胺的检测分析具有重要意义。
附图说明
图1为标准加入法检测花椒酰胺含量的差分脉冲伏安图。
图2为标准加入法工作曲线计算示意图。
图3为高效液相色谱法测定值与电化学法测定值拟合曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的内容,下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。
1、实验样品、主要试剂和仪器
样品：采用7种产地明确(均为当地采收)的干燥花椒作为检测对象，它们分别为：1号样，南椒一级(四川汉源)；2号样，江津青花椒(重庆江津)；3号样，金阳青花椒(四川金阳)；4号样，邵通青花椒(云南邵通)；5号样，伏椒一级(甘肃临夏)；6号样，一级红花椒(陕西富平)；7号样，一级红花椒(山东莱芜)。
试剂：羟基-α-山椒素(α-SOH)、羟基-β-山椒素(β-SOH)、羟基-γ-山椒素(γ-SOH)标准品购置于成都麦德生科技有限公司，纯度大于98％。实验过程所使用的水均为去离子水，实验试剂均为分析纯。
仪器：电化学工作站(CHI660E，上海辰华仪器有限公司)的三电极体系是：工作电极为3mm直径玻碳盘电极(型号CHI104)，参比电极为Ag/AgCl电极(型号CHI111)，辅助电极为铂丝电极(型号CHI115)。
实施例1：
(1)花椒果皮样品准备；
除去萎蔫或褐变的干燥花椒果皮(后面简称花椒)，粉碎过30目筛，得到花椒粉，-20℃条件下冷藏待检测；
(2)检测母液的制备；
准确称取步骤(1)得到的花椒粉(W)5g于50mL棕色具塞锥形瓶中，加入25mL无水乙醇，震荡摇匀，在恒温水浴协助下室温(25±2℃)超声浸提30min，得到粗提液，进一步将粗提液离心，2000r/min离心5min；上清液倒入200mL棕色容量瓶中(漏斗辅助)，收集滤渣另加入25mL无水乙醇，漩涡震荡1min，2000r/min下离心5min，收集上清液，如此重复3次，合并3次上清液，将3次合并上清液用无水乙醇定容至200mL，摇匀备用，作为检测母液，记录总体积V(200mL)；
(3)差分脉冲伏安法分析；
根据多次标准加入法的原理向样品检测溶液滴加一定体积的羟基-α-山椒素标准溶液(α-SOH)，随后利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
配置电解检测溶液，其组成为：乙醇：PBS(pH＝2)(1：9v/v)；PBS缓冲液的浓度为0.1M，吸取30μL步骤(2)制备得到的检测母液，体积记为V1(30μL)，用电解检测溶液稀释定容至10mL，获得样品检测溶液A，体积记为V2(10mL)，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；
第一次吸取检测母液和电解检测溶液混合，重新配制样品检测溶液B，加入10μLα-SOH标准液，加入体积记为V3(10μL)，加入的α-SOH标准液浓度为2.6g/L，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；第二次吸取检测母液和电解检测溶液混合，重新配制样品检测溶液C，加入20μL的α-SOH标准液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；第三次吸取检测母液和电解检测溶液混合，重新配制样品检测溶液D，加入30μL的α-SOH标准液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；第四次吸取检测母液和电解检测溶液混合，重新配制样品检测溶液E，加入40μL的α-SOH标准液，利用三电极体系检测混合溶液中花椒酰胺物质的差分脉冲伏安曲线；其中样品检测溶液A、样品检测溶液B、样品检测溶液C、样品检测溶液D和样品检测溶液E的体积和浓度均相同，均为吸取30μL步骤(2)制备得到的检测母液，用电解检测溶液稀释定容至10mL；叠加电解溶液对照、样品检测溶液以及四次加标的差分脉冲伏安曲线，得到标准加入法检测花椒总酰胺含量的差分脉冲伏安图，如图1所示，由图1可知，随着加标次数的增加，相应的峰电流也随之增加。
最后以α-SOH标准液的质量浓度为横坐标，对应的差分脉冲伏安峰电流为纵坐标做线性回归曲线，得到标准加入法的工作曲线，如图2所示，根据图中线性回归曲线与横坐标交点的绝对值，得到样品检测溶液中的总酰胺含量，记为m；
电化学分析仪采用三电极体系(工作电极(玻碳电极)、参比电极(Ag/AgCl电极)、辅助电极(铂丝电极))。差分脉冲伏安法的检测条件参数为：正向扫描，+0.6V-+1.2V；电位阶跃4mV；振幅0.05V；脉宽0.05s；采样宽度0.0167s；脉冲周期0.5s。
(4)总酰胺含量计算；
根据步骤(3)得到的样品检测溶液中的总酰胺含量，进一步按下述公式换算得到检测母液中的的总酰胺含量，即α-SOH当量含量：
该公式中，M：花椒样品中总酰胺含量，μg/g；m：样品检测溶液中总酰胺含量(依据多次标准加入法工作曲线计算)，μg α-SOH当量/mL；V1：配制样品检测溶液时使用的检测母液体积；V2：样品检测溶液的体积；V：检测母液总体积，mL；W：花椒粉质量，g；a：系统误差矫正系数。
(5)验证检测结果；
对七种花椒检测母液采用HPLC-MS法测定并计算花椒样品中的总酰胺含量，以验证本发明方法测定结果的准确性。
分别用外标法计算花椒样品中羟基-β-山椒素(β-SOH)、羟基-γ-山椒素(γ-SOH)含量；用内标法计算花椒样品中羟基-α-山椒素(α-SOH)、羟基-ε-山椒素(ε-SOH)含量，具体步骤为：首先分别将β-SOH以及γ-SOH标品用甲醇溶解，配置成一系列不同浓度的溶液并上机测试，所有溶液上机测试前均需要过0.22μm有机系滤膜；以标品浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线；其次取步骤(2)中得到的检测母液0.5mL，体积记为V4，用甲醇稀释定容至10mL，体积记为V5；吸取1mL过滤后上机测试，平行测定3次，取平均值。检测母液中β-SOH和γ-SOH物质浓度根据标准曲线计算得到，记为m1和m2，并通过公式(a1)和(a2)换算得到花椒样品中的β-SOH和γ-SOH含量。
式中：M：花椒样品中β-SOH含量，μg/g；m1：上机测试样品中β-SOH浓度(依据标准曲线计算得到)，μg/mL；(V5/V4)：检测母液稀释倍数，20；V：检测母液体积，20mL；W：样品质量，5g。
式中：M：花椒样品中γ-SOH含量，μg/g；m2：上机测试样品中γ-SOH浓度(依据标准曲线计算得到)，μg/mL；(V5/V4)：检测母液稀释倍数，20；V：检测母液体积，200mL；W：样品质量，5g。
准确称取步骤(1)得到的花椒粉(W)5g以及2mg β-SOH标准品于50mL棕色具塞锥形瓶中，加入β-SOH标准品质量记为n；加入25mL无水乙醇，震荡摇匀，在恒温水浴协助下室温(25±2℃)超声浸提30min，得到粗提液，进一步将粗提液离心，2000r/min离心5min；上清液倒入200mL棕色容量瓶中(漏斗辅助)，收集滤渣另加入25mL无水乙醇，漩涡震荡1min，2000r/min下离心5min，收集上清液，如此重复3次，合并3次上清液，将3次合并上清液用无水乙醇定容至200mL，摇匀备用，作为加内标检测母液；分别取0.5mL加内标检测母液和步骤(2)制得的检测母液，用甲醇稀释定容至10mL，各吸取1mL过滤后上机测试，记录检测母液中α-SOH的峰面积(A1)及ε-SOH峰面积(A2)，并分别记录检测母液以及加内标检测母液所测定的β-SOH峰面积，计算其差值为ΔA，检测母液通过公式(b1)计算得到花椒样品中的α-SOH含量，通过公式(b1)计算得到花椒样品中的ε-SOH含量；
式中：M：花椒样品中α-SOH含量，μg/g；n：添加β-SOH内标物的含量，2000μg；A1：α-SOH峰面积；ΔA：加入内标和不加内标所测定的β-SOH峰面积之差；W：样品质量，5g。
式中：M：花椒样品中ε-SOH含量，μg/g；n：添加β-SOH内标物的含量，2000μg；A2：ε-SOH峰面积；ΔA：加入内标和不加内标所测定的β-SOH峰面积之差；W：样品质量，5g。
计算出的花椒样品中α-SOH、β-SOH、γ-SOH和ε-SOH含量总和即为花椒样品中的总酰胺含量。
DPV法(差分脉冲伏安法)与HPLC-MS法测定的花椒总酰胺物质含量如表1所示。以电化学测定结果为横坐标，以HPLC-MS测定结果为纵坐标，进行线性拟合，得到HPLC-MS与电化学法测定值的拟合曲线，如图3所示，由图3可知，DPV法测定值与HPLC-MS法测定值之间存在系统误差，其线型关系符合y＝2.6385x(R2＝0.9955)，即采用DPV法检测花椒中总酰胺含量时，应使用矫正系数2.6385对其测定值进行校正，得到DPV结果校正值。HPLC-MS法与DPV法测定结果如表1所示；不同花椒样品的HPLC-MS测定值与DPV结果校正值之间的相对误差范围在0.02％-5.87％，均低于6％。结果表明：利用DPV法能够很好地得到花椒检测母液中的花椒总酰胺含量，其结果与HPLC-MS的结果高度近似。
表1 HPLC-MS法与DPV法测定结果比较
(6)花椒总酰胺回收率和精密度加标回收结果
选取1、4、7号花椒样品，在超声提取过程中加入α-SOH标品，加入α-SOH的含量分别为13.15mg、26.30mg、39.45mg，按实施方式中的步骤(2)、(3)制备含有花椒总酰胺的检测母液和含有α-SOH标品的检测母液。分别移取检测母液500μL，用电解检测溶液稀释定容至10mL，再按照实施方式中的步骤(4)计算出提取液中的总酰胺浓度，结果如表2所示：
表2加标回收实验结果
由表2结果可知，回收率为94％到108％之间，相对标准偏差均低于4.0％，数据结果表明本发明的检测方法可靠。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。