阅读说明：本技术 一种藏羚羊绒成分的检测方法 (A kind of detection method of chiru cashmere ingredient ) 是由 费静 陈晓 刘敏华 蔡佳仕 吴娟 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种藏羚羊绒成分的检测方法,该方法包括：步骤一：提取羊绒制品样品中的蛋白,通过电泳对其进行分离纯化,回收位于约47KD的条带,然后进行酶解,获得酶解后的溶液；步骤二、使用MALDI-TOF-MS对酶解后的溶液进行特征峰检测,观察质谱图是否出现m/z 2606的特征峰,根据m/z 2606的特征峰的有无判定样品中是否含有藏羚羊绒成分。本发明的方法鉴别藏羚羊绒成分的特异性好,结果可靠客观,对于保护藏羚羊、打击违法走私活动具有非常积极的作用。(The invention discloses a kind of detection methods of chiru cashmere ingredient, this method comprises: step 1: extracting the albumen in cashmere product sample, isolated and purified by electrophoresis to it, recycling is located at the band of about 47KD, is then digested, the solution after being digested；Step 2: carrying out feature blob detection to the solution after enzymatic hydrolysis using MALDI-TOF-MS, whether observation mass spectrogram there is the characteristic peak of m/z 2606, determines whether contain chiru cashmere ingredient in sample according to the presence or absence of characteristic peak of m/z 2606.The specificity that method of the invention identifies chiru cashmere ingredient is good, as a result reliable objective, has the function of for protection Tibetan antelope, the illegal smuggling activity of strike very positive.)

一种藏羚羊绒成分的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地说，是关于一种藏羚羊绒成分的检测方法。

背景技术

藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是我国特有的珍稀物种之一，生活在高寒的可可西里地区，被誉为“高原的精灵”。该物种为了抵御严寒，全身覆盖厚厚的毛，隐藏于长毛之下紧贴皮肤的底绒，非常的细软，直径只有10-12μm，是特种动物纤维中最细的。该绒保暖性能极佳，被称为“shahtoosh”，波斯语羊绒之王的意思。使用该绒制成的披肩，过去是印度有钱人家给女儿置办的嫁妆，现如今在西方是财富和地位的象征，在地下市场上售价达5000-20000美金一条。尽管藏羚羊被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》，也是我国的一级保护动物，在高额利益的驱使下，还是有不法分子铤而走险，猎杀藏羚羊取其皮毛。

一头成年的藏羚羊仅能提供150克左右的shahtoosh，而一条披肩，往往要消耗300－400克藏羚羊生绒，即3－4头藏羚羊的生命。正是国际市场的追捧和高额利益的驱使，藏羚羊的生命受到了严重的威胁。在鼎盛时期青藏高原上的藏羚羊数目达100万头左右，在20世纪最后20年遭大量偷猎，最低时仅剩余约7万头。经过这几年中国政府和国际社会的共同努力，这个数字有所回升。但是按照每年海关缴获的shahtoosh披肩数目来看，粗略估计每年仍有20000头藏羚羊惨死在***之下。按国家野生动物保护法，猎杀和走私藏羚羊3头即属重大案件，应从重处理，追究刑事责任。近年来，不法分子已经不再将整张羊皮走私出境，而是采取瞒报夹带等更加隐蔽复杂的手法，将藏羚羊绒藏在其他物品中，或混在羊绒、羊毛制品中，将藏羚羊绒运至印度、尼泊尔等地区进行加工，再卖到欧美市场。

目前，藏羚羊绒的鉴别，主要依靠显微镜放大后对外观形态的观察。一般来说，藏羚羊绒的直径比羊绒、细羊毛要细，鳞片呈环状，比较稀疏，与羊绒的表观较为相似。

因此，需要有一种更客观的方法，能够准确地鉴别藏羚羊绒成分，从而对保护藏羚羊、打击违法走私活动起到积极的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种藏羚羊绒成分的检测方法，以解决现有的藏羚羊绒成分的检测方法存在主观问题、准确性低的问题。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种藏羚羊绒成分的检测方法，该方法包括：

步骤一：提取羊绒制品样品中的蛋白，通过电泳对其进行分离纯化，回收位于约47KD的条带，然后进行酶解，获得酶解后的溶液；

步骤二、使用MALDI-TOF-MS对酶解后的溶液进行特征峰检测，观察质谱图是否出现m/z 2606的特征峰，根据m/z 2606的特征峰的有无判定样品中是否含有藏羚羊绒成分。

根据本发明，步骤一的提取羊绒制品样品的蛋白，包括如下步骤：

A、先将羊绒制品样品磨碎，放入离心管中；

B、往离心管中加入提取液，并混匀；

C、将离心管置入热盖温控装置于95℃30min；

D、取出待室温后，加入碘乙酰胺使溶液浓度调整至100mM；

E、加入DTT溶液终止反应，离心，取上清，备用。

进一步的，所述提取液包括50mM十二烷基硫酸钠，4％二硫苏糖醇和0.1M磷酸缓冲液，pH值为7.8。

根据本发明，所述的藏羚羊绒成分的检测方法，还包括如下步骤：

步骤三、定量检测藏羚羊绒和山羊绒混合绒中的藏羚羊绒的含量：以y＝1.0204x+0.0009为标准曲线公式，其中，X轴坐标为m/z2606的峰强度与m/z2606和m/z2691的峰强度之和的比值的平均值，Y轴坐标为藏羚羊绒所占含量，检测时，通过测得的峰强度与m/z2606和m/z2691的峰强度之和的比值的平均值，利用y＝1.0204x+0.0009的标准曲线公式计算藏羚羊绒和羊绒混合样品中的藏羚羊绒的含量。

本发明的有益效果是：

1、鉴别藏羚羊绒成分的特异性好，结果可靠客观，对于保护藏羚羊、打击违法走私活动具有非常积极的作用；

2、可以定量检测藏羚羊绒和山羊绒混合绒中的藏羚羊绒的含量。

附图说明

图1为山羊绒的特征峰m/z2691。

图2为绵羊毛的特征峰m/z2664。

图3为藏羚羊绒的特征峰m/z2606。

图4为不同比例的藏羚羊绒和山羊绒特征峰高度变化。

图5为藏羚羊绒含量与两种纤维特征峰强度的对应关系。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。以下为本发明的具体实施方式的举例，其中的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按本领域已知方法制备。

本发明的试验材料如下：

1、DTT：二硫苏糖醇

2、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳

3、SDS：十二烷基硫酸钠

4、IAA：碘乙酰胺

5、HCCA：α-氰基-4-羟基肉桂酸

6、TFA：三氟乙酸

实施例1、藏羚羊绒成分的MALDI-TOF-MS定性检测方法，包括如下步骤：

步骤A、样品的预处理：取0.4g藏羚羊绒样品，先用剪刀粗略剪碎，再放入spex6870冷冻研磨仪进行研磨，将样品磨成粉末状；

步骤B、蛋白的提取：称取10-20mg藏羚羊绒粉末样品放于离心管中，并在离心管中加入0.5mL的提取液(50mM DTT；质量分数为4％的SDS；0.1M磷酸缓冲液pH7.8)，使用旋涡振荡器混均匀；将离心管置入恒温孵育器于95℃30min。取出待室温后，加入碘乙酰胺(IAA)使溶液浓度调整至100mM。室温反应15分钟后，加入10μl 25mM的DTT溶液终止反应。室温离心7500g离心5min。将上清液转移置另一个离心管，备用。

步骤C、蛋白的分离纯化：使用SDS-PAGE对步骤B提取的蛋白进行分离纯化。恒压120V，20分钟。考马斯亮蓝染色，蛋白条带集中在上部、中部、下部三个区域，切割回收中间约47KD左右条带条带。

步骤D、胶条的酶解：使用体积比为50％的乙腈/50mM碳酸氢胺溶液洗涤胶套以除去考马斯亮蓝。将凝胶置于96孔微孔，等凝胶干了以后，加入30ul的胰蛋白酶溶液(含约150ng胰蛋白酶trypsin)，在50℃水浴孵育1h。

步骤E、取1uL步骤D酶解后的溶液点于MALDI-TOF-MS的耙板上。待溶液干后再点上1uL HCCA基质溶液(25mg HCCA溶于5mL的乙腈/0.1％TFA(7:3))。

步骤F：质谱检测：使用MALDI-TOF-MS的反射模式分析多肽。设置激光置阈值水平以产生信号，加速电压20kV。质谱扫描频率至少50次，每个样品在不同的部位重复测三次以保证重复性。

结果显示：动物物种特征峰出现在m/e＝2450-2750处(如图1-3所示)。其中，藏羚羊的特征峰出现在m/z 2606。

实施例2特异性检测

分别对藏羚羊m/z 2606、山羊m/z 2691和绵羊m/z 2664进行二级质谱分析，二级质谱数据使用Proteome Discoverer 1.3进行检索。检索参数设置如下：数据库设置为NCBIPantholops hodgsonii(32332条序列)。M/Z为2606的目的肽段序列为YSCQLAQVQSLIGNVESQLAEIR(2价)，同时该肽段第三位C上发生烷基化的固定修饰。归属XP_005964895.1蛋白(keratin,type I cuticular Ha4)。M/Z为2691和2664的目的肽段序列如表1所示。

表1藏羚羊、山羊和绵羊的特征蛋白序列

结果显示：氨基酸序列的差异与藏羚羊、山羊和绵羊是对应的。

结论：M/Z为2606的特征峰具有物种特异性，可以用来检测羊绒制品样品中是否含有藏羚羊绒成分。

实施例3定量标准曲线的建立

(1)将藏羚羊绒和山羊绒以不同的比例混合，其中藏羚羊绒的重量比为90％，70％，50％，30％，10％。对这些混合样品采用实施例1的方法进行蛋白的溶解和分离纯化，对目的条件进行酶解后使用MALDI-TOF-MS对其特征峰进行检测。结果如图4所示。其中，从前往后看，图4中的5个样品的藏羚羊绒含量分别为90％，70％，50％，30％，10％。

结果显示，随着藏羚羊绒的含量的减少，m/z 2606的高度越来越低，而羊绒峰的高度逐步上升。

(2)每个含量三个独立样品。将m/z2606与(m/z2606+m/z2691)的峰强度比值平均值作为X轴坐标，藏羚羊绒所占含量作为Y轴坐标，对5个点进行曲线拟合，得一直线，如图5所示，线性方程为y＝1.0204x+0.0009，R²＝0.997；即R²>0.99。对于需要定量的样品，可使用该曲线公式对混合样进行定量检测。

实施例4定量标准曲线的应用

取藏羚羊绒与山羊绒，按一定比例混合，并对混合后的藏羚羊绒与山羊绒混合物进行染色，使用了毛类常用的酸性染料和活性染料对混合毛进行染色，并使用实施例3的方法对其中的藏羚羊绒进行定量检测，结果见表2。

表2-染色样品的定量检测

结果显示，GB/T29862有明确规定，允差在5％以内。因此从检测数据来看，该方法同样适用于染色样品，且定量检测的结果可以回溯到初始配比。

结论：采用本实施例的方法在一定动态范围内具有精确定量的能力。从而证明本发明的方法实际测得值与理论值相符，重复性好。

综上所述，采用本发明的藏羚羊绒成分的检测方法，研究发现m/z2606可作为珍惜物种藏羚羊绒的特征峰，因此，可通过寻找物种特异的特征峰对动物纤维进行种属鉴别，为快速准确地鉴别藏羚羊绒成分提供了一种很好的方法。同时，本发明的方法，可以进行定量检测藏羚羊绒和山羊绒混合绒中的藏羚羊绒和山羊绒的含量，比起传统的显微镜的定性检测方法，该方法不受检测人员的主观判断及经验影响，具有更高可靠度和准确性。这对于保护藏羚羊、打击违法走私活动具有非常积极的作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。