阅读说明：本技术 Alpha突触核蛋白抗体及其应用 (ALPHA synapse nucleoprotein antibody and its application ) 是由 M·K·阿里亚尼安 小杰瑞·E·梅雷迪思 N·德维泽 J·D·格雷夫 E·L·霍尔克 于 2018-02-16 设计创作，主要内容包括：本申请公开了相比于单体α-突触核蛋白优先结合寡聚体α-突触核蛋白的抗α-突触核蛋白抗体,包含所述抗体的治疗组合物,和使用这些抗体治疗突触核蛋白病的方法。(This application discloses the anti-alpha-synapse nucleoprotein antibody for preferentially combining oligomer alpha-synapse nucleoprotein compared to monomer alpha-synapse nucleoprotein, the therapeutic combination comprising the antibody, and the method using these Antybody therapy synucleinopathies.)

具体实施方式

公开于例如WO 97/34631及WO 96/32478中。

在一个实施方案中，Fc的铰链区经修饰以改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基数。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。改变Fc的铰链区中的半胱氨酸残基数以(例如)有利于轻链及重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，抗体的Fc铰链区经突变以缩短抗体的生物半衰期。更特定而言，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，以使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合相对于具有天然Fc-铰链结构域的抗体与SpA的结合削弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。

在再一些实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应器功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，使得抗体具有改变的对效应器配体的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应器配体可为(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利第5,624,821号及第5,648,260号中。

在另一实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331及322的氨基酸可被不同氨基酸残基置换，以使抗体具有经改变的C1q结合及/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。

在另一实例中，改变氨基酸位置231及239内的一个或多个氨基酸残基以藉此改变抗体结合补体的能力。此方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公布号WO 94/29351中。

可对Fc进行的其他Fc修饰是用于降低或除去与FcγR及/或补体蛋白的结合，藉此降低或除去Fc介导的效应器功能(例如ADCC、ADCP及CDC)的修饰。示例性修饰包括(但不限于)位置234、235、236、237、267、269、325及328处的取代、***及缺失，其中编号是根据EU索引。示例性取代包括(但不限于)234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于降低FcyR及补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V、以及通过突变或酶方式或通过在不糖基化蛋白的生物体(例如细菌)中产生去除位置297处的糖基化。这些及其他修饰参阅Strohl,2009,Current Opinion inBiotechnology 20:685-691。

任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的额外及/或替代位置处包含非天然氨基酸残基(例如，参见美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号；PCT专利公开案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。

Fc区对其配体的亲和力及结合性质可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，这些方法包括(但不限于)平衡方法(例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，BIACORE分析)及其他方法，例如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳及层析(例如，凝胶过滤)。这些及其他方法可在一个或多个被检查组分的上利用标记物，及/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力及动力学的详细说明可参见Paul,W.E.编辑，Fundamental Immunology,第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。

在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方式是可行的。举例而言，这可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来进行。举例而言，可使以下残基中的一或多者突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375号中所述。具体示例性取代包括以下中的一或多者：T252L、T254S及/或T256F。或者，为延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内经改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。增加与FcRn的结合及/或改良药物动力学性质的其他示例性变体包括位置259、308、428及434处的取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加与FcRn的Fc结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of BiologicalChemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010,J Immunol,182:7663-7671中。在某些实施方案中，可使用具有特定生物特征的杂合IgG同型。举例而言，IgG1/IgG3杂合变体可以这样构建：将IgG1的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG3中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F。在本文所述其他实施方案中，可将IgG2的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG1中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸，来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中的一或多者：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处***甘氨酸)及327A。

在某些实施方案中，选择具有降低的与FcγR的结合的Fc。具有降低的FcγR结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E及G237A。这种三重突变体IgG1 Fc在本文中称为“IgG1.3f”。

在某些实施方案中，选择具有降低的补体结合的Fc。具有降低的补体结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)具有以下两个氨基酸取代：A330S及P331S。

在某些实施方案中，选择基本上无效应器功能，即，具有降低的与FcγR的结合及降低的补体结合，的Fc。无效应器的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。

在使用IgG4恒定结构域时，其通常优选包括取代S228P，该取代模拟IgG1中的铰链序列且藉此稳定IgG4分子。

在另一实施方案中，抗体的糖基化是经修饰的。举例而言，可制备无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。这些糖修饰可通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。举例而言，可制备一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，以藉此消除该位点处的糖基化。该无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。

可通过将N297残基突变成另一残基(例如N297A)及/或通过突变毗邻氨基酸(例如298)以藉此降低上N297的糖基化，来防止恒定区N297上的糖基化。

另外/或者，可制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已展示，这些改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。这些糖修饰可通过(例如)在具有经改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体来完成。具有经改变糖基化机构的细胞已于本领域有所描述，且可用作其中表达本文所述重组抗体的宿主细胞，以藉此产生具有改变的糖基化的抗体。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195描述具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述功能被破坏的FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得该细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述变体CHO细胞系Lec13细胞，该细胞将岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖的能力降低，亦导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO99/54342描述一种细胞系，该细胞系经过工程化而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在经改造细胞系中表达的抗体展现增加的二等分GlcNac结构，从而增强抗体的ADCC活性(亦参见Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。

本文所述抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化是通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文所用术语“聚乙二醇”意欲涵盖PEG的已用于衍生其他蛋白质的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，欲聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域已知且可适用于本文所述抗体。参见(例如)Nishimura等人的EP 0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。

VII.核酸分子

本文所述另一方面涉及编码本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的核酸分子。这些核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除了其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如连接至自然界中分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述核酸可为(例如)DNA或RNA且可含有或不含有内含子序列。在某些实施方案中，核酸为cDNA分子。

本文所述核酸可使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤(例如自携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可自文库回收编码抗体的核酸。

本文中的优选核酸分子是编码7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH和VL序列(参见例如表22)的核酸分子。

用于制备抗α-突触核蛋白抗体的方法可包括使重链及轻链在包含分别编码重链及轻链核苷酸序列的细胞系中表达。本文中涵盖包含这些核苷酸序列(例如，或包含这些核苷酸序列的载体)的宿主细胞。

一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，以(例如)将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段(例如抗体恒定区或柔性接头)。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”欲指两个DNA片段接合，使得由该两个DNA片段编码的氨基酸序列保持合框。

可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2及/或CH3)的另一DNA分子，将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。

可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。

为产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃)的另一片段，使得VH及VL序列可表达为邻接单链蛋白，其中VL及VH区通过柔性接头接合(例如，参见Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-554)。

本文亦提供编码与7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH及VL序列(例如，表22中所示者)同源的VH及VL序列的核酸分子。示例性核酸分子编码与编码7A10、7A10-T93A、11H11-1、11H11-2、15A5、21A3、36A3、44B11、2E2、23H8-1、23H8-2、23H8-3和1E8单克隆抗体的VH及VL序列(例如，表22中所示者)的核酸分子至少70％相同(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同)的VH及VL序列。本文亦提供了编码所述核酸的载体，例如表达载体，以及包含如上所述的载体或核酸的宿主细胞。本文亦提供具有沉默取代(即，在核酸分子翻译时不改变所得氨基酸序列的取代)的核酸分子，例如用于密码子优化。

XI.抗体产生

本文所述单克隆抗体可使用多种已知技术(例如由Kohler及Milstein,Nature256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术)来产生。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上亦可采用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。

制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已充分建立的程序。本领域已知分离融合用免疫脾细胞的免疫方案及技术。亦已知融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)及融合程序。

本文所述的嵌合或人源化抗体可基于如上文所述制备的鼠类单克隆抗体的序列而制备。可自所关注鼠类杂交瘤获得编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术工程化，以使之含有非鼠类(例如，人)免疫球蛋白序列。举例而言，为产生嵌合抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)将鼠类可变区连接至人恒定区。为产生人源化抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Winter的美国专利第5,225,539号及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)将鼠类CDR区***人框架中。

在一个实施方案中，本文所述抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对α-突触核蛋白的这些人单克隆抗体。这些转基因及转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠及KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“人Ig小鼠”。

HuMAb(Medarex公司)含有编码非重排人重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ及κ链基因座不活化的靶突变的人免疫球蛋白基因迷你基因座(例如，参见Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或κ表达，且响应于免疫，所引入的人重链及轻链转基因经历类别切换及体细胞突变而生成高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994),上文文献；参阅Lonberg,N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备及使用及由这些小鼠携带的基因体修饰进一步描述于以下中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容系全文以引用方式明确并入本文中。进一步参见颁予Lonberg及Kay的美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号及第5,770,429号；颁予Surani等人的美国专利第5,545,807号；所有皆颁予Lonberg及Kay的PCT公开案第WO 92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO97/13852号、第WO 98/24884号及第WO 99/45962号；及颁予Korman等人的PCT公开案第WO01/14424号。

在某些实施方案中，本文所述抗体是使用在转基因及转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因及人轻链转染色体的小鼠)产生的。这些小鼠(在本文中称作“KM小鼠”)详细描述于颁予Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。

此外，本领域可获得其他表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统，且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。举例而言，可使用称作Xenomouse(Abgenix公司)的替代性转基因系统；这些小鼠描述于(例如)颁予Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号及第6,162,963号中。

此外，本领域可获得表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。举例而言，可使用携带人重链转染色体及人轻链转染色体的小鼠，称作“TC小鼠”；这些小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中。此外，携带人重链及轻链转染色体的牛已在本领域有描述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)且可使用其来产生本文所述抗α-突触核蛋白抗体。

本领域描述的用于产生人抗体的其他小鼠系统包括(i)小鼠(Regeneron Pharmaceuticals公司)，其中内源性小鼠重链及轻链可变区已经由同源重组经人重链及轻链可变区置换，可操作地连接至内源小鼠恒定区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，且随后使用标准重组DNA技术转化成完全人抗体；及(ii)小鼠(Merus Biopharmaceuticals公司)，其中小鼠含有非重排人重链可变区而非单一重排人常见轻链可变区。这些小鼠及其产生抗体的用途描述于(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。

本文所述人单克隆抗体亦可使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的这些噬菌体展示方法已于本领域确立。参见(例如)：颁予Ladner等人的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号及第5,571,698号；颁予Dower等人的美国专利第5,427,908号及第5,580,717号；颁予McCafferty等人的美国专利第5,969,108号及第6,172,197号；及颁予Griffiths等人的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号及第6,593,081号。

本文所述人单克隆抗体亦可使用SCID小鼠来制备，其中已经重建了人免疫细胞，使得一旦免疫后能产生人抗体反应。此类小鼠描述于(例如)颁予Wilson等人的美国专利第5,476,996号及第5,698,767号中。

免疫

为生成α-突触核蛋白的完全人抗体，可利用α-突触核蛋白抗原及/或表达α-突触核蛋白或其片段的细胞的纯化或富集制剂免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)，如针对其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851及WO 98/24884所述。例如，在一个实施方案中，用重组人αSyn WT免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn A53T-PFF突变蛋白免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn WT-PFF免疫小鼠。在另一个实施方案中，用交联的αSyn WT免疫小鼠。在另一个实施方案中，用交联的A53T PFF免疫小鼠。在另一个实施方案中，用αSyn WT-PFF、αSyn A53T-PFF、交联的αSyn WT-PFF、和交联的αSyn A53T PFF的混合物免疫小鼠。或者，可以用编码人α-突触核蛋白或其片段的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠在首次输注时为6-16周龄。举例而言，可使用重组α-突触核蛋白抗原的纯化或富集制剂(5-50μg)对HuMAb小鼠实施腹膜内免疫。倘若使用α-突触核蛋白抗原的纯化或富集制剂的免疫不产生抗体，亦可利用表达α-突触核蛋白的细胞(例如细胞系)对小鼠实施免疫以促进免疫应答。示例性细胞系包括过表达α-突触核蛋白的稳定CHO及Raji细胞系。

利用各种抗原的累积经验已显示，在最初用Ribi的佐剂中的抗原经腹膜内(IP)或皮下(SC)实施免疫、而后用Ribi的佐剂中的抗原每隔一周IP/SC免疫(直至总共10次)时，HuMAb转基因小鼠反应最佳。可在免疫方案过程中利用血浆样品监测免疫应答，这些血浆样品系通过眶后取血获得。通过ELISA及FACS(如下文所述)筛选血浆，且可使用具有抗α-突触核蛋白人免疫球蛋白的足够效价的小鼠进行融合。可在处死及去除脾及***之前3天将小鼠用抗原静脉内加强免疫。预计对于每次免疫可需要实施2-3次融合。通常对于每一抗原对介于6只与24只之间的小鼠实施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另外，可将HCo7及HCo12转基因一起配种成具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。

产生α-突触核蛋白的单克隆抗体的杂交瘤的生成

为生成产生本文所述人单克隆抗体的杂交瘤，可自免疫小鼠分离脾细胞及/或***细胞并融合至适当永生细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得的杂交瘤可筛选是否产生抗原特异性抗体。举例而言，使用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约2×10⁵平铺于平底微量滴定板中，而后在含有10％胎牛克隆血清、18％“653”条件化培养基、5％奥瑞金(origen，IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)的选择性培养基中温育两周。约两周后，可在HAT更换为HT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA针对人单克隆IgM及IgG抗体筛选个别孔。一旦出现杂交瘤广泛生长，通常即可在10-14天后观察培养基。可将分泌抗体的杂交瘤再平铺，再次筛选，且若对人IgG仍呈阳性，则可通过限制性稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD₂₈₀来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。

产生α-突触核蛋白的单克隆抗体的转染瘤的生成

抗体可在宿主细胞转染瘤中使用(例如)如本领域所熟知的重组DNA技术及基因转染方法的组合产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。

举例而言，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链及重链的DNA，且可将DNA***表达载体中，使得这些基因可操作地连接至转录及翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接”欲指使抗体基因接合至载体中，使得该载体内的转录及翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录及翻译的预期功能。表达载体及表达控制序列经选择与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因***单独载体中，或将两种基因***同一表达载体中。通过标准方法(例如将抗体基因片段上的互补限制位点与载体接合，或若不存在限制位点，则利用平端接合)将抗体基因***表达载体中。可使用本文所述抗体的轻链及重链可变区通过将其***已编码期望同型的重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同型的全长抗体基因，使得V_H区段可操作地连接至载体内的C_H区段，且使V_L区段可操作地连接至载体内的C_L区段。

另外/或者，重组表达载体可编码有利于自宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，使得信号肽在框架内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于(例如)Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可依赖于诸如欲转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达程度等因素而定。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导较高蛋白质表达程度的病毒元件，例如源自以下各项的启动子及/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源(例如SRα启动子系统)的序列构成，该SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列及人T细胞1型白血病病毒的长末端重复(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。

除抗体链基因及调控序列外，重组表达载体亦可携带额外序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)及选择标记物基因。选择标记物基因有利于选择其中已引入载体的宿主细胞(例如，参见所有皆由Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号及第5,179,017号)。举例而言，通常选择标记物基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤)的抗性。优选选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(针对dhfr-宿主细胞用于甲氨蝶呤选择/扩增)及neo基因(针对G418选择)。

对于轻链及重链的表达，通过标准技术将编码重链及轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲涵盖常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染，等等。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本文所述抗体，但在真核细胞(且优选哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是优选的，这是因为真核细胞，具体而言，哺乳动物细胞，较原核细胞更有可能装配并分泌经适当折叠且具有免疫活性的抗体。已报导抗体基因的原核表达对高产率从的活性抗体的产生无效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。

用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择标记物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。具体而言，对于与NSO骨髓瘤细胞的使用，另一优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中公开的GS基因表达系统。在将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，将宿主细胞培养足够的时间，足以容许抗体在宿主细胞中表达(或更优选地，使抗体分泌至生长宿主细胞的培养基)，来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。

IX.测定法

可以通过，例如，标准ELISA，使用标准技术，例如实施例部分描述的那些，测试本文中描述的抗体对α-突触核蛋白的结合。。

如上文所述的ELISA测定法可用于筛选显示与α-突触核蛋白免疫原的阳性反应性的抗体，且由此筛选产生这样的抗体的杂交瘤。对于产生结合α-突触核蛋白、优选以高亲和力结合α-突触核蛋白的抗体的杂交瘤，随后可亚克隆并进一步表征。随后可选择来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲本细胞的反应性(通过ELISA))用于制备细胞库并用于抗体纯化。

为确定所选的抗α-突触核蛋白单克隆抗体是否结合独特表位，可使用市售试剂(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗体。可利用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测生物素化MAb结合。可使用如上文所述α-突触核蛋白包被的ELISA板实施使用未经标记的单克隆抗体及生物素化单克隆抗体的竞争研究。

用于评估抗体之间竞争的技术包括，例如，免疫测定，其显示一种抗体阻断(或不阻断)另一种抗体与靶抗原的结合的能力，即竞争性结合测定。在这样的测定法中确定竞争性结合：在测定中，所测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(例如α-突触核蛋白)的特异性结合。已知的竞争性结合测定法有许多类型，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定；固相直接¹²⁵I标记的RIA；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA；和直接标记的RIA。表面等离子体共振也可用于此目的。通常，这种测定法涉及下述者的使用：结合于固体表面的纯化抗原或者携带这些抗原细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。测试免疫球蛋白典型地过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，它会抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或更多。

用于确定本文公开的抗体结合的表位的其他筛选技术包括，例如，抗原晶体的X射线分析：抗体复合物，其提供表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变体变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。此外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。然后将这些肽视为前导物，用来定义筛选肽文库的抗体所对应的表位。对于表位定位，也已经开发出证明可定位构象不连续表位的计算算法。

为测定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂实施同型ELISA。

可通过Western印迹法针对与α-突触核蛋白抗原的反应性进一步测试抗α-突触核蛋白抗体。简言之，可自表达α-突触核蛋白的细胞制备细胞提取物，对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离抗原转移至硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用欲测试的单克隆抗体探测。可使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.公司St.Louis,MO)对其显色。

用于分析各种抗α-突触核蛋白抗体的结合亲和力、交叉反应性及结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如使用Biacore^TM 2000 SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的Biacore^TM表面等离子体共振(SPR)分析。

还可以测试抗α-突触核蛋白抗体与对α-突触核蛋白单体相比对α-突触核蛋白寡聚体的优先结合。“单体/PFF结合比”在本文中用作描述抗α-突触核蛋白抗体与PFF和α-突触核蛋白单体的结合行为的指标。大于1的比率表明与α-突触核蛋白单体相比更优先于结合PFF。例如，如果抗体通过ELISA与单体α-突触核蛋白结合的EC50为291nM，而与PFF结合的EC50为0.16nM，例如如实施例3中所述，则该抗体的单体/PFF结合比率将为291/0.16＝1819。在一些实施方案中，根据实施例3中描述的方法制备PFF。

可以使用例如实施例11中描述的测定法或实施例12中描述的寡聚体ELISA来测试抗α-突触核蛋白抗体清除脑中α-突触核蛋白寡聚体聚集体的能力。也可以使用例如实施例10和11中描述的方法，测试抗体减少或抑制α-突触核蛋白寡聚体(PFF)诱导的α-突触核蛋白S129磷酸化的能力，或者测试抗体从PFF和/或从脑中具有α-突触核蛋白的病理聚集体的患者制备的脑裂解物(例如，由具有突触核蛋白病，例如MSA的患者制备的脑裂解物)耗竭产生不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸-129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类的能力。

X.免疫缀合物、抗体衍生物及诊断

本文所述抗体可用于诊断目的，包括样品测试及体内成像，且为此目的，抗体(或其结合片段)可缀合至适当可检测的试剂，以形成免疫缀合物。为诊断目的，适当试剂是可检测的标记，其包括用于全身成像的放射性同位素、及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记及其他适宜抗体标记。

可检测标记可为体外诊断领域中当前所用的各种类型中的任一者，包括包括金属溶胶(例如胶状金)的颗粒标记、提供有(例如)N₂S₂、N₃S或N₄类型的肽螯合剂的同位素(例如I¹²⁵或Tc⁹⁹)、发色团(包括荧光标记物、发光标记物、磷光标记物、诸如此类)、以及将给定底物转化成可检测标记物的酶标记及在通过(例如)聚合酶链式反应扩增后显示的多核苷酸标记。适宜酶标记包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、诸如此类。举例而言，标记可为酶碱性磷酸酶，其系在1,2二氧杂环丁烷底物(例如金刚烷基甲氧基磷酰基氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)、以及CDP及或本领域技术人员熟知的其他发光底物(例如适宜镧系元素(例如铽(III)及铕(III))的螯合物)转化后通过测量化学发光的存在或形成来检测。通过所选标记测定检测方式。在标记为颗粒且以适当程度累积的情况下，标记或其反应产物可使用裸眼看到，或使用仪器(例如分光光度计、发光仪、荧光计，等等)显现，均根据标准实践来进行。

优选地，缀合方法产生实质上(或几乎)非免疫原性的联接，例如肽-(即酰胺-)、硫化-(立体阻碍)、二硫化物-、腙-及醚联接。这些联接几乎是非免疫原性的，且在血清内显示合理的稳定性(例如，参见Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO2009/059278；WO 95/17886)。

可利用不同缀合策略，视部分及抗体的生物化学性质而定。在所述部分是50至500个天然或重组氨基酸的情况下，在描述蛋白缀合物之合成的化学法的教科书中有标准程序，本领域技术人员容易地遵循这些标准程序(例如，参见Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用抗体或部分内的马来酰亚胺基部分与半胱氨酸残基的反应。在使用抗体的Fab或Fab'-片段的情况下，这是非常适宜的一种缀合化学。或者，在一个实施方案中，缀合至抗体或部分的C-末端。蛋白质(例如Fab-片段)的C-末端修饰可如(例如)所述实施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)。

一般而言，位点特异性反应及共价缀合是基于将天然氨基酸转变成具有与存在的其他官能基的反应性正交的反应性的氨基酸。举例而言，处于稀有序列背景中的特定半胱氨酸可经酶转化成醛(参见Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸特异性酶反应性来获得期望氨基酸修饰(例如，参见Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；及Protease-catalyzed formation of C--N bonds isused by Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403)。

亦可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应实现位点特异性反应及共价缀合。

N-末端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价缀合。

天然化学接合亦可依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。

EP 1 074 563描述缀合方法，其是基于一段带负电荷氨基酸内的半胱氨酸与位于一段带正电氨基酸中的半胱氨酸的较快反应。

所述部分亦可为合成肽或肽模拟物。在多肽为化学合成的情况下，合成期间可纳入具有正交化学反应性的氨基酸(例如，参见de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于有许多正交官能基可用且可引入合成肽中，故该肽与接头的缀合是一种标准化学。

为获得单标记的多肽，可通过层析分离具有1:1化学计量的缀合物与其他缀合副产物。可通过使用染料标记的结合对成员及带电荷的接头易化此程序。通过使用此类经标记且带高负电荷的结合对成员，容易将单缀合的多肽与未经标记的多肽及携带一个以上接头的多肽分离开来，这是因为电荷及分子量的差异可以被用于进行分离。荧光染料可用于纯化复合物与未结合的组分，如经标记的单价结合物。

在一个实施方案中，附接至抗α-突触核蛋白抗体的部分选自下组：结合部分、标记部分及生物活性部分。

本文所述抗体亦可缀合至治疗剂以形成免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。适宜治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组织蛋白去乙酰酶抑制剂、出核转运抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝***剂。在ADC中，抗体及治疗剂优选经由可裂解接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合。更优选地，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:128)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如下文中所述：美国专利第7,087,600号、第6,989,452号及第7,129,261号；PCT公开案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美国专利公开案20060024317、20060004081及20060247295；其公开内容通过提述并入本文中。

抗α-突触核蛋白抗体(例如那些本文所述者)亦可用于检测α-突触核蛋白，例如人α-突触核蛋白，例如组织或组织样品中的人α-突触核蛋白。这些抗体可用于(例如)ELISA测定或流式细胞术中。在某些实施方案中，使抗α-突触核蛋白抗体与细胞(例如组织中的细胞)接触对于发生特异性结合适宜的一段时间，且随后添加试剂(例如检测抗α-突触核蛋白抗体的抗体)。抗α-突触核蛋白抗体可为完全人抗体，或其可为嵌合抗体，例如具有人可变区及鼠类恒定区或其部分的抗体。用于检测样品(细胞或组织样品)中的α-突触核蛋白(例如人α-突触核蛋白)的示例性方法包含(i)使样品与抗α-突触核蛋白抗体接触足以容许抗α-突触核蛋白抗体与样品中的α-突触核蛋白特异性结合的一段时间，及(2)使样品与特异性结合抗α-突触核蛋白抗体(例如结合抗α-突触核蛋白抗体的Fc区)的检测试剂(例如抗体)接触，藉此检测由抗α-突触核蛋白抗体结合的α-突触核蛋白。在与抗体及/或检测试剂一起温育后，可包括洗涤步骤。用于这些方法中的抗α-突触核蛋白抗体不必连接至标记或检测试剂，因为可以使用单独的检测试剂。

XIV.双特异性分子

本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。举例而言，抗α-突触核蛋白抗体可连接至特异性结合可用作组合治疗的潜在靶标的任何蛋白质(例如本文所述蛋白质)的抗体或scFv。本文所述抗体事实上可衍生或连接至一个以上的其他功能分子，以生成结合两个以上不同结合位点及/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子亦欲涵盖于如本文所用的术语“双特异性分子”中。为产生本文所述双特异性分子，本文所述抗体可以有功能地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。

因此，本文提供包含至少一种对α-突触核蛋白的第一结合特异性及对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在一个本文所述的实施方案中，双特异性分子是多特异性的，分子可进一步包括第三结合特异性。

在一个实施方案中，本文所述双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv或单链Fv(scFv))作为结合特异性。抗体亦可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如Fv或单链构建物，如Ladner等人，美国专利第4,946,778号中所述，其内容通过提述明确并入。

尽管人单克隆抗体是优选的，但本文所述双特异性分子中可采用的其他抗体为鼠类的、嵌合的、及人源化的单克隆抗体。

本文所述的双特异性分子可使用本领域已知的方法通过偶联各组成部分的结合特异性来制备。举例而言，双特异性分子的每一结合特异性可单独生成，随后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的实施例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻伸苯基二马来酰亚胺(oPDM)、丙酸N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括那些描述于以下中者：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.编号78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)，及Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)。优选偶联剂是SATA及磺基-SMCC，其皆可自PierceChemical公司(Rockford,IL)购得。

在一些实施方案中，本文中描述的双特异性抗体具有可增加分子向脑中的转运，例如跨越血脑屏障转运的第二结合特异性。

当结合特异性是抗体时，其可经由两条重链的C-末端铰链区的巯基键结来偶联。在特别优选的实施方案中，铰链区经修饰在偶联之前含有奇数个(优选一个)巯基残基。

或者，两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并装配。此方法在双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)₂、Fab×F(ab')₂或配体×Fab融合蛋白时尤其有用。双特异性抗体可包含在每一重链的C-末端处包含scFv的抗体。本文所述双特异性分子可为包含一种单链抗体及结合决定簇的单链分子、或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两种单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于(例如)美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；及美国专利第5,482,858号中。

双特异性分子与其特异性靶的结合可使用本领域公认的方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western印迹测定)来确认。这些分析测定通常都采用对受特别关注的蛋白质-抗体复合物特异性的标记试剂(例如抗体)来检测该受关注的复合物的存在。

XII.组合物

进一步提供组合物，例如药物组合物，其含有一种本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的组合，或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体与针对其他靶标的抗体的组合，或本文所述的抗α-突触核蛋白抗体的抗原结合部分，与医药上可接受的载体配制在一起。这些组合物可包括本文所述抗体或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合(例如两种或更多种不同者)。举例而言，本文所述的药物组合物可包含抗体(或免疫缀合物或双特异性物)的组合，其中各抗体结合靶抗原上的不同表位或具有互补的活性。

在某些实施方案中，组合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的浓度的抗α-突触核蛋白抗体。

本文所述药物组合物亦可以组合疗法、即与其他药剂组合施用(在同一组合物中或分别的组合物中)。可以用于联合疗法的治疗剂的例子包括，例如左旋多巴，金刚烷胺(Symmetrel)，抗胆碱能药(三己芬迪，苯甲磺酸甲磺酸盐，环丙啶，安坦(artane)，苯扎托品(cogentin))，溴隐亭(Parlodel)，培高利特(Permax)，罗匹尼罗(Requip)，普拉克索(Mirapex)，单胺氧化酶B抑制剂(MAO)如司来吉兰(Diprenyl或Eldepryl)，儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂(COMT)如恩他卡朋(entocapone)，Tasmar或托卡朋，胆碱酯酶抑制剂，D2受体拮抗剂，DA激动剂，反义寡核苷酸(例如，针对α-突触核蛋白的反义寡核苷酸)，激酶抑制剂和富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)抑制剂。另外的试剂包括，例如，靶向已知与突触核蛋白病的病理学有关的分子的治疗剂，例如PINK，PARKIN，DJ1，葡萄糖脑苷脂酶(GBA)，以及靶向活性氧种类的作用剂。

如本文所使用，“医药上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及生理上相容的类似试剂。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。依赖于施用途径而定，可于材料中对活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)进行包衣以保护化合物免受酸及其他可使化合物失活的天然条件的作用。

本文所述医药化合物可包括一种或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”指保留亲本化合物的期望生物活性且不赋予任何不期望毒理学效应的盐(例如，参见Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实施例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括那些源自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸，等等)以及源自无毒有机酸(例如脂肪族单及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸，等等)者。碱加成盐包括那些源自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙，等等)以及源自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)，等等)者。

本文所述药物组合物亦可包括医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、氢氯酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠，等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚，等等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。

可用于本文所述药物组合物中的适宜水性及非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可(例如)通过使用诸如卵磷脂等包衣材料、通过维持所需粒径(在分散剂的情形下)及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。

这些组合物亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过上述灭菌程序并通过纳入各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，等等)二者可确保阻止微生物的存在。这些组合物中亦可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠，等等。另外，可通过引入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射医药形式的长效吸收。

医药上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。本领域已知用于医药活性物质的这些介质及药剂的使用。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则亦涵盖常规介质或药剂在所述药物组合物中的使用。药物组合物可包含防腐剂或可不含防腐剂。这些组合物中亦可纳入附加活性化合物。

治疗组合物通常必须无菌且在制造及储存条件下稳定。可将组合物调配成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇，等等)及其适宜混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液情形下)且通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，优选可将等渗剂(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠)纳入组合物中。可通过向组合物中纳入延迟吸收剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)实现可注射组合物的长效吸收。

无菌可注射溶液可通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所列举成分中的一者或组合(视需要)的适宜溶剂中，而后进行无菌微滤。通常，可通过将活性化合物纳入含有基本分散介质及来自那些上文所列举者的所需其他成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻-干燥(冻干)，其可自其预先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任一所期望额外成分的粉末。

可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将依赖于所治疗受试者及特定施用方式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常可为产生治疗效应的组合物的量。通常，在100％中，此量将在与医药上可接受的载体组合的约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最佳约1％至约30％活性成分范围内。

可对剂量方案进行调节以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单次推注，可随时间施用若干个分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。尤其有利地将非经肠组合物调配成剂量单位形式以便于剂量的施用及均匀性。如本文所使用的剂量单元形式指适于作为单位剂量供欲治疗受试者使用的物理离散单元；各单元含有预定量的活性化合物，此预定量经计算与所需医药载体一起产生期望治疗效应。本文所述剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)活性化合物的独特特性及欲实现的特定治疗效应，及(b)复合此活性化合物以治疗受试者敏感性的技术中的固有限制条件。

对于抗体的施用，剂量将在约0.0001mg/kg至100mg/kg且更通常0.01mg/kg至5mg/kg或10mg/kg宿主体重的范围内。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg至10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。在一些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体可以固定剂量(固定剂量方案)施用。

在一些方法中，同时施用两种或更多种经由不同结合特异性的单克隆抗体，在该情形下，所施用的每一抗体的剂量均在所指示的范围内。抗体通常在多个时机施用。单一剂量之间的间隔可为(例如)每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可如通过测量患者的针对靶抗原的抗体血液含量所指示而不规则。在一些方法中，对剂量进行调节以实现约1-1000μg/ml、且在一些方法中为约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。

抗体可以持续释放配制剂的形式施用，在该情形下需要频率较低的施用。剂量及频率依赖于抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人抗体显示最长的半衰期，其后为人源化抗体、嵌合抗体及非人抗体。施用剂量及频率可依赖于治疗为预防性抑或或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对较不频繁之间隔经较长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔的相对较高的剂量直至减轻或终止疾病进展且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。

本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量可有所变化，以便获得对于特定患者、组合物及施用方式有效达到期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成分量。所选剂量量将依赖于多种药物代谢动力学因素而定，这些因素包括所用本文所述特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物及/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康情况及先前病史及已为医学技术中所熟知的类似因素。

本文所述组合物可使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种、经由一个或多个施用途径施用。如本领域技术人员应了解，施用途径及/或方式应视所期望结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径，例如通过注射或输注。本文所用短语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用方式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、腹膜腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。

或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经***、经直肠、经舌下或经局部。

活性化合物可利用保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控制释放配制剂，包括植入体、经皮贴剂及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备此等配制剂的许多方法已获得专利权或通常已为本领域技术人员所知。参见(例如)Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。

治疗组合物可利用本领域已知的医学器件施用。举例而言，在优选实施方案中，本文所述治疗组合物可利用无针皮下注射(例如器件公开于美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中的器件)来施用。与本文所述抗α-突触核蛋白抗体一起使用的熟知植入体及模组的实施例包括：美国专利第4,487,603号，其公开用于以控制速率分配用药的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开用于经由皮肤施用药物的治疗器件；美国专利第4,447,233号，其公开用于以精确输注速率递送用药的用药输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开经由多室隔间的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其公开渗透药物递送系统。此等专利皆以引用方式并入本文中。许多其他植入体、递送系统及模块是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，本文所述抗α-突触核蛋白抗体可经配制以确保体内的适当分布。举例而言，血脑障壁(BBB)可排除许多高度亲水性化合物。为确保本文所述治疗化合物跨越BBB(视期望，例如，针对脑癌)，则其可以例如配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见(例如)美国专利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性运输至特定细胞或器官中、由此增强靶向药物递送的部分(例如，参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(例如，参见颁予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；亦参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。

XIII.试剂盒

还提供了试剂盒，其包含本文公开的抗α-突触核蛋白抗体、双特异性抗体或免疫缀合物的，任选包含在单个小瓶或容器中，且包括例如用于治疗或诊断与脑中路易体或α-突触核蛋白聚集体的存在有关的疾病的说明。试剂盒可包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。标签一词包括附于试剂盒上或者与试剂盒一并提供的、或者其他方式随附于试剂盒的任何文字，营销材料或记录材料。此类试剂盒可以包含单位剂型(例如单剂量药瓶或单剂量预装注射器)的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。

XIV.用途和方法

本文提供了治疗患有以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的受试者(例如人患者)的方法，以及用于预防这些疾病的方法。

因此，在一个方面，本文提供了治疗以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本文提供了减轻以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的严重性的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本文提供了延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的进展的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本文提供了减少发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的风险的方法，包括对具有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本文提供了延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的发作的方法，包括对具有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，待治疗的受试者表现出突触核蛋白病的症状(体征)，例如神经精神病学表现(抑郁，痴呆，幻觉，焦虑，麻木，***低下)，自主神经变化(***性低血压，膀胱紊乱，便秘，大便失禁，流涎，吞咽困难，性功能障碍，脑血流变化)，感觉变化(嗅觉，痛觉，辨色异常感觉)，睡眠障碍(REM睡眠行为障碍(RBD)，不安腿综合征/周期性肢体运动，嗜睡症，失眠)和其他体征和症状(疲劳，复视，视力模糊，皮脂溢，体重减轻/增加)。

在一些实施方案中，要治疗的受试者可能不表现疾病的症状，但已知其具有发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的遗传风险。例如，这样的个体可能有患有该疾病的亲属，或者通过遗传或生化标志物的分析确定了他们的风险。例如，SCNA(PARK1，编码α-突触核蛋白)中的突变，包括A30P、E46K、H50Q、G51D和A53T，以及整个SNCA基因的重复和三次重复，可导致PD的常染色体显性形式。LRRK2(PARK8，富亮氨酸重复激酶2)中的突变，以及VPS35(PARK17，液泡蛋白分选35)中的突变也会导致PD的常染色体显性形式(Hernandez et al.、(2016)Genetics in Parkinson disease:Mendelialversus non-Medndelian inheritance.Journal of Neurochemistry 10.1111/jnc.13593)。PINK1(PARK6、PTEN-诱导的激酶1)、DJ-1(PARK7)、Parkin(PARK2)、ATP13A2(PARK9、ATP酶13A2型)、FBXO7(PARK15、仅F-框蛋白7)和PLA2GB(PARK14，磷酸脂肪酶A2、组VI)中的突变已经被证明可导致常染色体隐性PD/帕金森综合征。此外，已经鉴定了28种不同的与PD以及相关的突触核蛋白病关联的遗传风险座位，包括SNCA、LRRK2、GBA/SYT11、MAPT、HLA-DRB5、GAK、GCH1、NUCKS1/RAB7L1、SLC41A1、BST1、SIPA1L2、ACMSD/TMEM163、STK39、MCCC1、TMEM175/GAK/DGKQ、FAM47E/SCARB2、GPNMB、FGF20、INPP5F、MIR4697、CCDC62、GCH1、VPS13C、BCKDK/STX1B、SREBF/RAI1、RIT2和DDRGK1(Nalls et al.(2014)Large-scalemeta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk locifor Parkinson’s disease.Nature Genetics 46(9):989-993)。因此，在预防性应用中，将本文所述的抗体或包含该抗体的药物组合物以一定的方案(剂量、施用频率和施用途径)施用于易患疾病或具有该疾病风险的患者，该方案可有效降低该疾病的风险、减轻该疾病的严重程度或延缓该疾病的至少一种体征或症状的发作。在某些预防性应用中，该方案可有效抑制或延缓脑内α-突触核蛋白在脑中的积累，和/或抑制或延缓其毒性作用和/或抑制或延缓患者行为缺陷的发展。

在一些实施方案中，上述方法在患者中产生有益的治疗反应(例如，受试者的脑中α-突触核蛋白聚集减少，认知功能改善，和/或逆转、治疗或防止认知下降)。因此，在一些实施方案中，将本文所述的抗体以一定的方案(剂量、施用频率和施用途径)施用于怀疑患有或已经患有以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的患者，该方案可有效改善疾病的至少一种体征或症状或至少抑制疾病的至少一种体征或症状的进一步恶化。在某些治疗应用中，该方案可有效减少α-突触核蛋白水平、相关的毒性和/或行为缺陷，或至少抑制α-突触核蛋白水平、相关的毒性和/或行为缺陷的进一步增高。在某些实施方案中，相对于治疗开始前，或与未经治疗的对照患者的群体相比，所述治疗可导致，例如，脑中的α-突触核蛋白聚集减少10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，60％，更多，70％或更多，80％或更多或90％或更多。

在一些实施方案中，以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病是帕金森病(包括特发性帕金森病)、DLB、DLBD、LBVAD、单纯性自主神经衰竭、路易体吞咽困难(Lewy body dysphagia)、偶发性LBD，遗传的LBD(例如，SNCA(PARK1)、LRRK2(PARK8)、VPS35(PARK17)，PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、Parkin(PARK2)、ATP13A2(PARK9)、FBXO7(PARK15)和PLA2GB(PARK14)的突变)或多系统萎缩症(MSA；例如，少脑桥小脑萎缩症，纹状体黑质变性和Shy-Drageri综合征)。

还提供了抑制细胞(体外或体内)中不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)产生的方法，包括使细胞与有效量的本文所述的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分接触。在一些实施方案中，丝氨酸129的磷酸化是被α-突触核蛋白低聚物(例如，PFF)诱导的。

还提供了用于维持或增加突触密度和/或树突密度的方法，所述突触密度和/或树突密度使用突触形成标记(突触素)和/或树突(MAP2)进行测量。因此，在一些实施方案中，相对于开始治疗前，或与未经治疗的对照患者群体相比，用本文所述的抗体治疗的受试者的突触或树突密度可显示10％或更多，20％或更多，30％或更多，40％或更多或50％或更多的升高。

本文公开的抗体还可以用于诊断或预后以脑中存在路易体或α-突触核蛋白的病理聚集体为特征的疾病，例如，通过使本文公开的抗体与来自受试者的细胞接触(例如离体或体内)，并测量细胞上与α-突触核蛋白的结合水平，其中与α-突触核蛋白的异常高结合水平表明该受试者患有脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病。为了诊断或预后目的，本文所述的抗体可以通过静脉内注射至患者体内或通过颅内注射或通过在颅骨上钻孔而直接注射至脑内来施用。试剂的剂量应在与治疗方法相同的范围内。合适的标记包括，例如，荧光标记(例如，用于光学检测)，顺磁标记(例如，用于无手术介入的断层摄影检测)和放射性标记(例如，用于使用PET或SPECT进行检测)。通过将被标记的基因座的数量、大小和/或强度与相应的基线值进行比较来进行诊断。基线值可以代表一群未患病个体的平均水平。基线值也可以代表同一患者中以前确定的水平。例如，可以在开始治疗之前测定患者的基线值，然后再将测量值与基线值进行比较。值相对于基线信号的降低表示对治疗的积极反应。

在一个实施方案中，本文提供了一种用于诊断以受试者中的路易体或α-突触核蛋白的病理聚集体的存在为特征的疾病的方法，其包括：

(a)使来自受试者的样品与本文所述的抗体或其抗原结合部分接触，从而形成抗体-抗原复合物；

(b)测量形成的复合物的量；和

(c)将样品中复合物的量与对照中的量进行比较，其中样品中复合物的水平相对于对照升高表明受试者患有以路易体或α-突触核蛋白的病理性聚集体的存在为特征的疾病。在一些实施方案中，样品是脑脊液、脑组织提取物、尿液或血液。在一些实施方案中，对照是一群健康受试者，这些受试者没有表现出该疾病(例如，突触核神经病)的症状，也不具有该疾病的遗传倾向。

在优选的实施方案中，本文所述的抗α-突触核蛋白抗体没有显著毒性。例如，抗α-突触核蛋白抗体对人体，例如肝脏、肾脏、脑，肺和心脏中的一个或多个器官没有明显毒性(例如在临床试验中确定的)。在某些实施方案中，抗α-突触核蛋白抗体不会显著触发不良的免疫反应，例如自身免疫或炎症。

该抗体可以单独施用，也可以与另一种与该抗体联合作用或协同作用的治疗剂一起施用，以治疗与路易体或脑中α-突触核蛋白聚集体有关的疾病(例如，多系统萎缩症)。

适合与本文所述抗体结合使用的示例性治疗剂包括，例如，左旋多巴，金刚烷胺(Symmetrel)，抗胆碱能药(三己芬迪，苯甲磺酸甲磺酸盐，环丙啶，安坦(artane)，苯扎托品(cogentin))，溴隐亭(Parlodel)，培高利特(Permax)，罗匹尼罗(Requip)，普拉克索(Mirapex)，单胺氧化酶B抑制剂(MAO)如司来吉兰(Diprenyl或Eldepryl)，儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂(COMT)如恩他卡朋(entocapone)，Tasmar或托卡朋，胆碱酯酶抑制剂，D2受体拮抗剂，DA激动剂，反义寡核苷酸(例如，针对α-突触核蛋白的反义寡核苷酸)，激酶抑制剂和富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)抑制剂。另外的试剂包括，例如，靶向已知与突触核蛋白病的病理学有关的分子的治疗剂，例如PINK，PARKIN，DJ1，葡萄糖脑苷脂酶(GBA)，以及靶向活性氧种类的作用剂。

其他治疗剂可与本文所述抗体一起(例如，同时或依次)或分开(例如，相隔数小时或数天)一起施用。

还涵盖了检测样品中人α-突触核蛋白抗原的存在或测量人α-突触核蛋白抗原的量的方法，包括使样品和对照样品与特异性结合人α-突触核蛋白的单克隆抗体(例如人单克隆抗体)或其抗原结合部分在容许该抗体或其部分与人α-突触核蛋白之间形成复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的差异表明样品中存在人α-突触核蛋白抗原。在一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人α-突触核蛋白。在另一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于检测生物样品(例如活检)中α-突触核蛋白蛋白的量。在又一个实施方案中，本文中描述的抗α-突触核蛋白抗体可用于体外测定法(例如，诸如Western印迹的免疫测定，放射免疫测定，ELISA)以检测α-突触核蛋白。

XV.示例性实施方案

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并展示下述的一种或多种性质：

(a)结合小鼠和大鼠α-突触核蛋白；

(b)结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白；

(c)对α-突触核蛋白寡聚体的亲和力大于对α-突触核蛋白单体的亲和力；

(d)抑制α-突触核蛋白寡聚体诱导的不溶性丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的生成；

(e)耗竭从脑中含有α-突触核蛋白病理性聚集体的患者制备的PFF和/或脑裂解物来源的、产生可溶性或不溶性α-突触核蛋白聚集体(例如，丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白聚集体)的分子种类；

(f)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分；

(g)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分；

(h)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分；

(i)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分；和

(j)结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。

2.实施方案1的抗体或其抗原结合部分，其中所述α-突触核蛋白寡聚体是PFF。

3.实施方案2的抗体或其抗原结合部分，其中PFF是如实施例3中所述地制备的。

4.实施方案1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中α-突触核蛋白寡聚体是可溶性α-突触核蛋白寡聚体。

5.实施方案1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中α-突触核蛋白寡聚体是不溶性α-突触核蛋白寡聚体。

6.实施方案1-5中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中对α-突触核蛋白PFF相比于对α-突触核蛋白单体更大的亲和力是用α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比来度量的，α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比通过基于荧光的测定法(例如如实施例3所述)而测定的。

7.实施方案6的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有100或更大的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比。

8.实施方案7的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为500或更大。

9.实施方案8的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为700或更大。

10.实施方案9的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为1500或更大。

11.实施方案10的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为3000或更大。

12.实施方案11的抗体或其抗原结合部分，其中单体/PFF结合比为5000或更大。

13.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过ELISA测量，所述抗体或其抗原结合部分以100nM或更大的EC₅₀结合单体α-突触核蛋白，且以2nM或更小的EC₅₀结合PFF。

14.实施方案13的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以500nM或更大的EC₅₀结合单体α-突触核蛋白，且以0.5nM或更小的EC₅₀结合PFF。

15.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过使用如实施例10所述的测定法评估，所述抗体或其抗原结合部分以0.1nM或更小的IC₅₀抑制PFF诱导的α-突触核蛋白丝氨酸129磷酸化。

16.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合α-突触核蛋白，并且包含选自下组的可变重链和可变轻链对中的三个可变重链CDR和三个可变轻链CDR：

(a)SEQ ID NO:8和9；

(b)SEQ ID NO:18和19；

(c)SEQ ID NO:20和21；

(d)SEQ ID NO:31和32；

(e)SEQ ID NO:31和33；

(f)SEQ ID NO:43和44；

(g)SEQ ID NO:53和54；

(h)SEQ ID NO:63和64；

(i)SEQ ID NO:73和74；

(j)SEQ ID NO:83和84；

(k)SEQ ID NO:99和100；

(l)SEQ ID NO:99和101；

(m)SEQ ID NO:99和102；和

(n)SEQ ID NO:113和114。

17.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白，且包含：

(a)分别包含SEQ ID NO:2-4的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:5-7的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(b)分别包含SEQ ID NO:12-14的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:15-17的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(c)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:25-27的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(d)分别包含SEQ ID NO:22-24的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:28-30的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(e)分别包含SEQ ID NO:37-39的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:40-42的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(f)分别包含SEQ ID NO:47-49的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:50-52的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(g)分别包含SEQ ID NO:57-59的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:60-62的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(h)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:70-72的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(i)分别包含SEQ ID NO:77-79的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:80-82的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(j)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:90-92的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(k)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:93-95的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；

(l)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQ IDNO:96-98的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3；or

(m)分别包含SEQ ID NO:107-109的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，和分别包含SEQID NO:110-112的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3.

18.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白且包含重链和轻链可变区，其中重链可变区包含与选自SEQ ID NO:8、18、31、43、53、63、73、83、99和113的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

19.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白且包含重链和轻链可变区，其中轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:9、19、32、33、44、54、64、74、84、100、101、102和114的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的重链和轻链可变区序列：

(a)SEQ ID NO:8和9；

(b)SEQ ID NO:18和19；

(c)SEQ ID NO:31和32；

(d)SEQ ID NO:31和33；

(e)SEQ ID NO:43和44；

(f)SEQ ID NO:53和54；

(g)SEQ ID NO:63和64；

(h)SEQ ID NO:73和74；

(i)SEQ ID NO:83和84；

(j)SEQ ID NO:99和100；

(k)SEQ ID NO:99和101；

(l)SEQ ID NO:99和102；和

(m)SEQ ID NO:113和114。

21.实施方案20的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链和轻链可变区包含与选自(a)-(m)的重链和轻链可变区至少95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

22.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合α-突触核蛋白并且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的重链和轻链序列：

SEQ ID NO:10和11，

SEQ ID NO:20和21，

SEQ ID NO:34和35，

SEQ ID NO:34和36，

SEQ ID NO:45和46，

SEQ ID NO:55和56，

SEQ ID NO:65和66，

SEQ ID NO:75和76，

SEQ ID NO:85和86，

SEQ ID NO:103和104，

SEQ ID NO:103和105，

SEQ ID NO:103和106，和

SEQ ID NO:115和116。

23.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第123-128位氨基酸的全部或一部分。

24.实施方案23的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第125-128位氨基酸的全部或一部分。

25.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-139位氨基酸的全部或一部分。

26.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第119-126位氨基酸的全部或一部分。

27.实施方案1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中通过肽作图(例如，如实施例1所述地)，所述抗体结合人α-突触核蛋白(SEQ ID NO:1)的第130-138位氨基酸的全部或一部分。

28.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合大鼠和小鼠α-突触核蛋白。

29.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白。

30.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中，以通过基于发光的结合测定法(例如实施例3所述的)确定的α-突触核蛋白单体/α-突触核蛋白PFF结合比(单体:PFF结合比)评估，所述抗体对α-突触核蛋白PFF具有比对α-突触核蛋白单体更大的亲和力。

31.实施方案30的抗体或其抗原结合部分，其中单体:PFF结合比为100或更大、500或更大、700或更大、1500或更大、3000或更大、或5000或更大。

32.一种抗体或其抗原结合部分，其与实施方案21的抗体结合相同的表位。

33.一种抗体或其抗原结合部分，其与实施方案21的抗体竞争对人α-突触核蛋白的结合。

34.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自由下述者组成的群组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或它们的变体。

35.实施方案34的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是IgG1抗体。

36.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含具有降低的效应器功能或没有效应器功能的Fc区。

37.实施方案36的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含无效应器的IgG1 Fc，所述无效应器的IgG1 Fc包含下列突变：L234A、L235E和G257A。

38.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分为嵌合、人源化或人抗体。

39.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体被修饰以降低在人中的免疫原性。

40.实施方案39的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含分别在SEQ ID NO:18和19中列出的重链和轻链可变区。

41.前述任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其是单克隆抗体。

42.一种双特异性分子，其包含任一前述实施方案的抗体以及与之连接的具有第二结合特异性的分子。

43.实施方案42所述的双特异性分子，其中所述第二结合特异性增加该分子向脑中的转运。

44.一种核酸，其编码实施方案1-43中任一项的抗体或其抗原结合部分或双特异性抗体的重链和/或轻链可变区。

45.一种表达载体，其包含实施方案44的核酸分子。

46.一种细胞，其转化有实施方案45的表达载体。

47.一种免疫缀合物，其包含实施方案1-43中任一项所述的抗体或双特异性抗体，以及与之连接的部分。

48.实施方案47的免疫缀合物，其中所述部分是结合部分、标记部分、生物活性部分、或治疗剂。

49.一种组合物，其包含：实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物，以及医药上可接受的载体。

50.一种试剂盒，其包含：实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物，以及使用说明。

51.一种制备抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合部分的方法，包括在实施方案46的细胞中表达该抗体或其抗原结合部分，并从该细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。

52.一种抑制细胞中不溶性丝氨酸129磷酸化α-突触核蛋白聚集体的生成的方法，包括使细胞与有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物接触。

53.实施方案52的方法，其中丝氨酸129的磷酸化是被α-突触核蛋白寡聚体诱导的。

54.实施方案53的方法，其中所述α-突触核蛋白寡聚体是预形成的α-突触核蛋白纤丝。

55.实施方案53的方法，其中所述α-突触核蛋白寡聚体衍生自来自具有突触核蛋白病的患者的脑样品。

56.一种治疗以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。

57.一种减轻以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的严重性的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。

58.一种延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的进展的方法，包括对患有该疾病的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。

59.一种降低发生以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的风险的方法，包括对有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。

60.一种延迟以脑中路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的发作的方法，包括对有发生该疾病的风险的受试者施用有效量的实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物。

61.一种诊断受试者中以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病的方法，该方法包括：

(a)使来自受试者的样品与实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物接触，使得形成抗体-抗原复合物；

(b)测量所形成的复合物的量；和

(c)比较样品中复合物的量与对照中的量，其中样品中复合物相对于对照水平升高表明患者具有以路易体或α-突触核蛋白病理性聚集体的存在为特征的疾病。

62.实施方案61的方法，其中所述样品是脑脊液、脑组织提取物、尿或血。

63.实施方案56-62中任一项的方法，其中所述疾病是帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、路易体病、多系统萎缩、或单纯性自主神经衰竭。

64.实施方案56-63中任一项的方法，包括使用一种或多种额外的治疗手段(therapeutics)。

65.一种检测样品中的α-突触核蛋白的方法，包括使样品与实施方案1-43、47和48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或免疫缀合物在容许所述抗体或其抗原结合部分和α-突触核蛋白形成复合物的条件下接触，并检测所述复合物的形成。

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通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献，Genbank序列，专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。尤其是PCT公布案WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546、WO 09/054863和PCT/US2013/072918和美国的公开案2011/0150892通过提述明确地并入本文。

实施例

下面的实施例中提到的可商购的试剂，除了另有说明之外，是按照制造商的说明使用的。除了另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，例如本文前述部分和下面的教科书中描述的那些：Sambrook et al.,同上；Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,1989)；Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(AcademicPress,Inc.:N.Y.,1990)；Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press:Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press:Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,1991。

实施例1:抗α-突触核蛋白(抗-αSyn)抗体的生成

本实施例描述全人抗α-突触核蛋白单克隆抗体(mAb)的生成，所述抗体相比于αSyn单体优先结合由人重组野生型αSyn组成的预形成的纤丝(PFF)。

在转基因小鼠的HCo42株(“HuMAb”是Medarex，Inc.，Princeton，NewJersey的商标)和KM小鼠(KM品系含有如PCT申请号中所述的WO 02/43478SC20转染色体)中产生人抗αSyn单克隆抗体。

用重组人αSynWT或αSynA53T-PFF突变蛋白、以及和交联的αSynWT或A53T PFF来免疫重组人转基因小鼠。Fusion 5448中使用的小鼠通过在通过腹膜内(IP)和皮下(SC)注射每只小鼠25μg的αSyn A53T-PFF(于Ribi佐剂中)来免疫。Fusion 5450中使用的HCo42小鼠用αSynWT-PFF、αSynA53T-PFF、交联αSynWT-PFF和交联αSyn A53T-PFF的混合物(1:1:1:1)，每只小鼠25μg进行腹膜内+皮下+跗关节(IP+Sc+Hock)免疫。通过将每种1mg/mL PFF储液(WT、A53T和交联的WT、A53T)各200μL混合，制成PFF抗原混合物储液。将抗原悬浮在Ribi佐剂中。被选择用于融合和杂交瘤的小鼠在融合前3天进一步接受抗原的静脉内/腹膜内(IV/IP)增强免疫，所述抗原溶于Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)中。

脾细胞或***与P3x63Ag8.653细胞融合后，通过检测人γ/人κmAb的存在，筛选融合板中的抗原特异性抗体。测试来自融合板的细胞对αSynPFF或天然αSyn单体的结合特异性。从功能筛选中筛选出的αSynPFF阳性杂交瘤通过单细胞亚克隆进行亚克隆，以确保细胞系稳定性和杂交瘤单克隆性。再次通过ELISA测试每个亚克隆的抗原特异性结合(即αSynPFF结合)，产生以下亚克隆：11H11-1、11H11-2、15A5、7A10、36A3、44B11和21A3。通过ELISA，同种型分析显示所有6种抗体均为人IgG1/κ。表22提供了重链和轻链、重链和轻链可变区、以及重链和轻链CDR1-3的氨基酸和核苷酸序列。

7A10的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列8和9组成。11H11-1的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列28和29组成。11H11-2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列28和29组成。15A5的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列38和39组成。21A3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列48和49组成。36A3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列58和59组成。44B11的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列68和69组成。2E2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列78和79组成。23H8-1的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和95组成。23H8-2的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和96组成。23H8-3的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列94和97组成。1E8的重链和轻链可变区分别由氨基酸序列106和107组成。

还产生了上述抗αSyn抗体的无效应器功能版本。如本文所用的，hIgG1f是指IgG1的具有SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的同种异型，而hIgG1.3f是指hIgG1f的三重突变体版本(L234A，L235E，G237A)，其缺乏Fcγ受体结合且缺乏效应器功能。hIgG1.3f具有在SEQID NO:119中列出的氨基酸序列。

实施例2：抗αSyn抗体的表位作图

通过使用一系列重叠的αSyn肽来确定实施例1中描述的抗αSyn抗体的表位结合位点。

产生了一系列重叠肽，这些肽具有人αSyn序列的10个氨基酸，并具有N端生物素基团、PEG4接头以及C端CONH₂(表1)。将肽以1mg/ml溶解在DPBS中。为了作图研究，将100μL0.25μg/mlα-突触核蛋白肽(溶于D-PBS中)添加到NeutrAvidin包被的高容量96孔板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中，在室温温育2h(或在4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(0.05％Tween溶于DPBS中)将板洗涤3次。然后在室温下，用150μl 3％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，溶于DPBS中，封闭板约2h(或在4℃过夜)。将稀释在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/dPBS，2片蛋白酶抑制剂(Roche complete，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中的测试样品100μL在50ml缓冲液中在平板上室温温育2h。将板洗涤3次，加入在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/DPBS)中以1:1000稀释的二抗100μL，室温温育1hr。洗涤平板3次，每次洗涤5～10分钟。添加100μL AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-use，带Sapphire II，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)并在室温下显影30分钟。用PerkinElmer EnVision(2102Multilabel Reader，PerkinElmer，Waltham，MA)读取发光计数，在测定全过程中板保持恒定摇动(滴定板摇床)，使用的二抗包括：碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA))，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。将所有二抗稀释至甘油终浓度为50％。

初步实验确定，所有抗体均识别位于αSyn的C末端区域的表位。表1中显示的重叠肽被用来精细化每种抗体的表位结合位点。

表1:表位作图肽

^a生成了具有人αSyn序列的10个氨基酸的重叠肽，它们具有N末端生物素基团以及PEG4接头盒C末端CONH₂。

表位作图的结果如图1所示。数据显示7A10、21A3、15A5、36A3和1E8在αSyn的氨基酸123-128内结合，对应于氨基酸序列EAYEMP(SEQ IDNO:121)；11H11-1在αSyn的氨基酸125-128内结合，对应于氨基酸序列YEMP(SEQ ID NO:122)；44B11在αSyn的氨基酸130-139内结合，对应于氨基酸序列EEGYQDYEPE(SEQ ID NO:124)；2E2在αSyn的氨基酸119-126内结合，对应于氨基酸序列DPDNEAYE(SEQ ID NO:125)；而23H8结合在αSyn的氨基酸130-138中，对应于氨基酸序列EEGYQDYEP(SEQ ID NO:123)。

实施例3：抗αSyn抗体相比于αSyn单体对αSyn-PFF的选择性

该实施例表明，抗αSyn抗体相比于αSyn单体优先结合αSyn-PFF。

在20mM Tris/HCl，100mM NaCl，PH7.4中将重组的野生型人αSyn(rPeptide，Bogart，GA)和含有A53T突变的人αSyn(rPeptide，Bogart，GA)重构为1mg/ml。使用标准规程生成PFF(Luk等人，PNAS 2007；106:20051-6)。简而言之，将单体在2ml带安全帽的Eppendorf管(～1ml/管)中于37℃持续摇动下(滴定板摇床)温育4天，然后在100,000g的室温下离心20分钟。将离心沉淀重悬于PBS中以使最终PFF浓度为1mg/ml。

通过硫代黄素T结合测定法、变性(SDS-PAGE)和非变性(天然)凝胶电泳、以及尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)来监测αSyn的纤丝化。对于硫代黄素-T测定，将样品在PBS中稀释至0.5mg/ml，并添加至等体积的25μM硫代黄素-T中。然后使用Envision多标记酶标仪(PerkinElmer，Waltham，MA)测量样品，激发和发射波长分别设置为485和535nm。使用MicroBCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和Imperial ProteinStain(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)评估总蛋白质水平。

为了进行SDS-PAGE分析，将NuPAGE样品还原剂(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中的PFF样品在加热块(70℃)中温育10分钟，通过SDS-PAGE(1μg/10μl/泳道)分离，SDS-PAGE使用4-12％Bis-Tris凝胶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和MESSDS运行缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在200V恒压下进行，然后转移至硝酸纤维素膜(孔径为0.45um，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，转移使用含10％甲醇的Tris/甘氨酸缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)，恒压50V，1.5h。对于非变性PAGE(Native-PAGE)，PFF样品用NativePAGE分离(1μg/10μl/泳道)，NativePAGE使用3-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和NativePAGE运行缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在150V恒压下进行，然后使用NuPAGE转移缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)在50V，1.5h恒压下转移到PVDF膜(孔径为0.45um，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上。PVDF膜分别用甲醇预处理30sec，dH2O预处理2min和转移缓冲液预处理10min。在室温下，用5％脱脂奶粉(ThermoFisher Scientific，Waltham)(溶于0.1％Tween/TBS中)封闭膜2h，然后与一抗4B12(BioLegend，San Diego，CA，1％BSA/0.1％Tween/TBS中1:1000稀释)在4℃下温育过夜。然后将膜用0.1％Tween/TBS洗涤3次(每次洗涤5～10分钟)，然后与抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA，过氧化物酶缀合的亲和纯化Fab2，以1％BSA/0.1％Tween/TBS稀释1:10,000)在室温下温育1h。然后将膜如上洗涤3次，然后与SuperSignalWest Femto最大灵敏度底物(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)温育5分钟。使用GEAmersham成像仪600进行检测。SDS-PAGE使用MagicMark^TMXP Western蛋白标准品(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和SeeBlue plus 2(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。非变性凝胶则使用未染色蛋白标准品(Invitrogen)。洗涤缓冲液(TBST)由Tris缓冲盐水中的0.1％Tween-20组成。

对于结合测定法，将96孔板(高结合微孔板)用100μL的1μg/mlαSynWT PFF(溶于DPBS中)室温下包被2h(或在4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(溶于DPBS中的0.05％Tween)将板洗涤3次。在室温下将板用150μl 3％BSA/DPBS封闭2h(或在4℃过夜)。在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/DPBS，2片蛋白酶抑制剂(Roche complete，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，溶于50ml缓冲液)中制备了PFF(从2μg/ml开始)和α-synWT单体(从20μg/ml开始)的三倍系列稀释液。为了进行抗体温育，将等体积的2倍测定浓度的αSynPFF或单体与2倍测定浓度的抗体在BD falcon低结合平板中混合，并在室温下温育约2小时。将100μL抗体和PFF或单体的混合物添加到PFF包被的板，并在室温下温育10分钟。将板洗涤3次。加入100μL驴抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，含50％甘油，PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中1:1000稀释)，并将板在室温下温育1小时。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，含Sapphire II，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，在室温下显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102Multilabel Reader，PerkinElmer，Waltham，MA)读取发光计数。在包被或与抗体混合之前，以15次1秒脉冲对PFF进行超声处理。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床)。

如图2所示，评估了抗αSyn抗体对αSyn单体和对WT或A53T αSyn PFF的结合强度。对照抗体1的数据也显示在图3中。对于所有测试的抗体，观察到与WT PFF和A53T PFF的相似结合。除对照抗体1和2以外，所有六种抗-αSyn抗体均相比于αSyn单体优先与αSyn PFF结合，M/P比率至少为500。结合数据汇总如表2所示。

表2:结合测定结果汇总

^a M/P＝单体/PFF结合比(比值越低意味着对PFF的偏好越高)

^b抗体1和抗体2为对照抗体

实施例4:抗αSyn抗体的去免疫化

该实施例确定了将一部分抗αSyn抗体去免疫化对与αSyn单体和αSynPFF结合的影响。

为了通过人源化去除可能的免疫原性热点，分析了7A10的重链和轻链序列的免疫原性。分析了7A10与世界人群等位基因中27种常见HLA的结合，并鉴定了非种系区段，以确定可能的免疫原性热点。

同源肽(作为内吞作用和树突状细胞降解生物物质的副产物而产生)与MHC-II等位基因结合，然后呈递到树突状细胞的表面，对于适应性免疫应答是至关重要的。但是，除了与MHC-II等位基因结合外，所呈递的肽还必须是非固有的(非自身的)，CD4+ T细胞受体才能与其结合(T细胞识别)，从而导致活化和T细胞增殖。为了通过计算机模拟这些作用并模拟多种多样的供体的作用，首先将抗体分解为15-mer的肽，从N端起，一次一个氨基酸地系统性向C端移动。对于每个获得的15-mer肽，评价其(i)与世界人口中27种常见的HLA的结合，和(ii)与人免疫球蛋白种系序列的完美序列匹配。如果有种系完美匹配，则该15-mer肽被认为是“自身”的，因此不具有抗原性。另一方面，如果确定为“非自身的”(在不存在完美的种系匹配的情况下)，则如果它与27个等位基因中的某些具有足够的亲和力，则被认为具有潜在的抗原性。

肽/MHCII结合亲和力的预测是使用IEDB(Immune Epitope Database,免疫表位数据库)分析资源共识工具进行的。预测的亲和力以百分位数等级的形式报告，基于五种不同的肽MHC-II结合预测方法的共识。

图4显示了7A10重链和轻链的免疫原性分析。分析结果表明，轻链(VK)被预测为大体上是非免疫原性的，仅有的热点位于CDR3中——CDR3通常涉及与抗原决定簇的结合。重链(VH)具有两个显示热点分布在较大区域上的区域，即CDR2(残基49-65)和FW3-CDR3(残基90-98)。忽略长度小于8个延伸点的热点，仅考虑了对VH链中的两个区域(49-65、90-98)通过诱变来降低风险。

图4中每个氨基酸下方的数字表示结合以该氨基酸为中心的15-mer肽的等位基因的比例。例如，7A10_VH中Y52处的“5”是指以Y52为中心的15-mer肽，即LEWIGYIYYSGRTKY，且表示(i)该肽不具有人类种系匹配(因此是非自身的)，并且(ii)27个等位基因中有50-60％表现出对该肽的高结合亲和力。数字根据从浅灰色(最不可能具有免疫原性)到深灰色(最可能具有免疫原性的热点)的量表来指配。三个粗体箭头表示突变体选择的位置：R56S，K58N和T93A。

使用体外人PBMC增殖测定法评估了7A10和去免疫化的7A10-T93A的人免疫原性风险。Avastin和αIL-21RmAb用作阴性和阳性测定对照，因为它们的临床免疫原性与体外免疫原性测定结果呈正相关。通过Ficoll(GEHealthcare)梯度离心从健康志愿者中分离出PBMC，并利用聚合酶链反应扩增以及与寡核苷酸探针(ProImmune)的杂交来表征II类人白细胞抗原(HLA)。每次测定均使用由40名PBMC供体组成的小组，该小组的II类HLA组成与世界人口频率紧密相符。用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，Invitrogen)标记PBMC以监测增殖，并以200,000个细胞/孔的形式以96个孔板铺板在RPMI(Lonza)中，其中含有10％人源AB血清(Bioreclamation)，非必需氨基酸(Gibco)和青链霉素(Gibco)。将1μM的α突触核蛋白抗体和对照蛋白与PBMC培养7天，然后洗去培养基，并用缀合APC(别藻蓝蛋白，BDBiosciences)的抗人CD4 mAb标记细胞。用洗涤步骤除去未结合的抗CD4 mAb之后，将剩余细胞用3.7％***(Sigma)的PBS固定，并通过流式细胞仪分析以确定增殖的CD4+ T细胞的百分比。当特定抗体的CD4+ T细胞增殖百分比大于仅含培养基的CD4+ T细胞增殖百分比加两个标准偏差时，则认为供体是阳性的。将显示阳性增殖信号的40个供体的百分比作为数据呈现。

与这些抗体温育后显示出显著CD4+ T细胞增殖反应的供体的百分比如图5所示。7A10在40个PBMC供体中21个(52.5％)中产生了增殖反应，而7A10-T93A在40个供体中的5个(12.5％)中显示出增殖反应。

实施例5：去免疫化的抗αSyn抗体与αSyn单体和αSynPFF的结合

该实施例通过ELISA评估了实施例4中所述的去免疫化版本7A10、和21A3的去免疫化版本即21A3-V82L与αSyn单体和αSynPFF的结合。ELISA如实施例3所述进行。

如表3所示，在7A10-T93A和21A3-V82L版本展示的PFF结合强度在亲本抗体测得的强度的2倍以内；而单体结合值的可变性更大，这是由于对于这些相对较弱的强度，难以生成准确的浓度-反应曲线。与7A10亲本相比，K58Y-T93A的PFF结合弱>10倍，而R56S-T93A和R56S-K58N-T93A的PFF结合强度在7A10的2倍以内。

表3:去免疫化的α-突触核蛋白变体的结合汇总

^a如标明的，显示的数据是Fc惰性人同种型IgG1.3的数据

^b为产生可接受的对照信号所需的抗体浓度

实施例6：抗-Syn抗体与大鼠、小鼠和人αSyn的种间反应性

为了评估物种的交叉反应性，测试了抗αSyn抗体与代表大鼠、小鼠和人αSyn中氨基酸111-140的肽的结合(表4)。人、大鼠和小鼠的αSyn序列之间在121-122位不同。结合测定如实施例3中所述进行。

表4:人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽

*小鼠111-140(SEQ ID NO:156)、大鼠111-140(SEQ ID NO:157)、人111-140(SEQID NO:158)

与相应的人肽相比，抗αSyn抗体对大鼠和小鼠的/Syn-111-140肽具有相似的结合(图6)。肽结合结果的汇总示于表5中。总体而言，抗αSyn抗体与啮齿动物111-140肽的结合强度比对相应的人肽弱2-3倍。

表5:对人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽结合的汇总

表5:对人、大鼠和小鼠αSyn 111-140肽结合的汇总

实施例7：抗αSyn抗体与人αSyn、βSyn和γSyn的交叉反应性

在该实施例中，如实施例3中所述，通过ELISA测试了抗αSyn抗体与人βSyn和人γSyn的结合和交叉反应性。

如图7所示，抗体未区分人αSyn、βSyn或γSyn。包括了与PFF的结合作为阳性对照。

实施例8：抗-Syn抗体的生物物理表征

该实施例描述了使用各种方法表征抗αSyn抗体的生物物理特性。表6总结了热稳定性、分子量、pI、疏水性分析的结果。

表6:生物物理性质

对于差示扫描量热法(DSC)，以1mg/ml的抗体以60℃/hr升温对样品进行扫描。如表6所示，所有7A10抗体均表现出良好的折叠稳定性。

表6中显示的所有三种7A10抗体均通过完整质谱(MS)分析评估了身份。分析使用ACQUITY UPLC/Waters Synapt G2质谱仪。样品用1mg/mL的DTT(100mM)还原。UPLC/MS条件：1μg样品注射到BEH C4 RP柱上，2.1x 150mm，1.7mm粒度，60℃，20分钟梯度：10min内10％至38％(流动相B)，LC流速200μL/min，正MS离子模式。该方法也用于糖基化谱分析。

通过完整质谱(MS)分析，根据测得的质量与根据氨基酸序列理论预测的质量之间的一致性，确认了所有三种7A10抗体的身份。此外，测定了糖基化谱，发现是N297位糖基化的mAb的典型谱。

接下来，用iCIEF在以下条件下测量电荷均质性：ProteinSimple iCE3仪器；1分钟1500V预聚焦，10分钟3000V聚焦，样品在0.2mg/mL的0.35％甲基纤维素，2.0M尿素，1％v/vPharmalyte 5-8和3％v/v Pharmalyte 8-10.5。pI标记物5.8和10.10的条件下运行。表6列出了测得的pI值接近9，84-87％的主峰，11-13％的酸性变体，及其余的碱性变体。

还通过疏水相互作用色谱法(HIC)检测抗体的均质性，使用以下条件：TosohTSKgel丁基NPR柱，流动相A：0.1M磷酸钠pH 7.0、2M硫酸铵；流动相B：0.1M磷酸钠pH 7.0；流速：1.0mL/min。如表6所示，所有三种抗体均100％显示为主峰。

为了评估抗体是否聚集或被截短，在以下条件下进行了SEC分析：Shodex K403-4F柱，缓冲液＝100mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.3，流速＝0.3mL/min。如表6所示，所有版本的7A10均未检测到HMW种类。

还在受迫稳定条件下，包括高浓度和高温条件下，对7A10-IgG1f、7A10-IgG1.3f和7A10-T93A-IgG1.3f的稳定性进行了测试。将抗体在20mM组氨酸，250mM蔗糖，pH 6.0中浓缩至100mg/ml以上，并在4℃下保存4周。然后分析抗体中HMW或LMW种类的增加。如表7所示，上述两个种类几乎没有增加，表明7A10具有很好的可浓缩行为。

还将抗体以10mg/ml的最终抗体浓度对相同的组氨酸缓冲液透析，并在40℃下温育4周，以迫使任何潜在的化学或物理降解发生。如表7所示，所检测的三种7A10抗体中的HMW种类均未增加。出现少量的LMW种类(2.5-5％)。

还通过CIEF测量了抗体的电荷谱。抗体表现出典型的峰分布，其中大部分是主峰，酸性种类是第二大的群体，而碱性种类是最小的群体。这些带电种类在暴露于40℃4周后的比例变化也是抗体的典型现象。

表7:受迫下的稳定性

实施例9：抗-αSyn抗体与预形成的-αSyn原纤维的结合亲和力

该实施例描述了使用表面等离子体共振(SPR)的7A10的αSyn结合行为。

图8显示了与捕获在表面的抗体和溶液中的野生型单体αSyn的结合行为。这种格式可以测量单价亲和力。野生型αSyn显示出非常低和弱的结合。相比之下，当将PFF作为溶液分析物进行测试时，观察到质量大得多的αSyn的结合。这与由于多价PFF的二价亲合力导致的紧密度增加是一致的。还测试了对照抗人αSyn抗体1。如图8所示，抗体1以相似的缔合和解离速率结合单体和PFFαSyn，提示对于该抗体，二价/亲合力没有带来可检测到的结合增强。

接下来，对SPR分析的格式进行了优化，以方便估计结合亲合力。注意，PFF是多聚体，而7A10是正常的二价单克隆抗体。因此，结合数据反映了由于亲合力效应所致的结合亲和力的增强(参见图8)。

如图9所示，7A10和7A10-T93A与固定在表面的PFF具有相似的亲合力(7A10：ka(1/Ms)：5.811E+7，kd(1/s)：0.009834，K_D：1.692E-10M；7A10-T93A：ka(1/Ms)：8.946E+7，kd(1/s)：0.03873，K_D：4.329E-10M)。发现两者的缔合动力学都非常快。尽管如此，还是以1:1结合模型对这两个数据集进行了尽可能精确的分析，以确定在这种测定形式中亲合力是否存在可辨别的差异。根据曲线拟合，似乎两种抗体结合固定在表面上的PFF的亲合力相差4倍以内。

实施例10：体外抗αSyn抗体阻断不溶、聚集的αSyn的诱导

该实施例描述了抗αSyn抗体能够在体外阻断PFF或MSA脑裂解物诱导αSyn的细胞内、去污剂不溶性的磷酸化(pS129)聚集体的产生。

用PFF或MSA脑裂解液处理后，可在培养细胞中诱导αSyn的胞内、去污剂不溶性的磷酸化(pS129)聚集体(Prusiner等人，PNAS 2015：112：E5308-17；Luk等人，PNAS 2007；106:20051-6)。开发了类似的系统，其中使用大鼠海马神经元过表达人A53T αSyn，将细胞暴露于PFF或MSA脑裂解物样品11天后，测量不溶性pS129αSyn的诱导。

方法

a.PFF的制备和纤丝化(fibrillization)分析

使用实施例3中所述的方法制备和分析PFF。

b.人脑裂解物的制备

大脑皮层样本取自Banner Health Research Institute(Sun City，AZ)。将来自12-18、01-03和04-51号患者的MSA脑组织用于免疫耗竭实验。对脑样本进行超声处理，其中超声处理用KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(输出40，调谐50)在经过滤的PBS(1ml PBS/100mg组织湿重)中进行2x 10秒。将样品置于2ml Eppendorf管中，管在超声处理期间将置于湿冰上。将脑溶解液在3,000g，4℃下离心5分钟。将上清液的等分试样在液氮中冷冻并保存在-80℃。进行了包括αSyn ELISA(总的，以及pS129)在内的QC测定。为了分离高速旋转离心沉淀，将先前在PBS中以100mg/ml制备的脑匀浆物在冰冷PBS中稀释3倍至33.3mg/ml，然后在100,000x g下于4℃离心30分钟。除去上清液并丢弃。将离心沉淀以与起始样品相同的体积重悬于冰冷的PBS中。

c.原代细胞培养分离

使用木瓜蛋白酶解离系统(Worthington Biochemical)，按照制造商的说明，在胚胎第19天(E19)每周从约7窝幼鼠制备原代大鼠海马神经元培养物。将大鼠海马细胞在神经元培养基中以30,000/孔接种到PDL包被的96孔BD成像板上(每周约16个板)，其中，神经元培养基含有神经基础培养基(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)和0.5mM GlutaMax(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，且补充有1X B-27(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)。

d.免疫沉淀

将先前制备的脑匀浆(100mg/ml)在完全神经基础培养基(NBM)(含有青链霉素、Glutamax和B-27补充剂的神经基础培养基)(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中稀释150倍。通过将抗体的测试浓度添加到一个等分试样的稀释的脑匀浆中用于测试突触核蛋白抗体的浓度响应函数。将样品在4℃下温育，并连续颠倒温育2小时，然后以1:10的稀释度向样品中添加经洗涤和封闭的Protein A/G琼脂糖珠浆，然后在4℃下连续颠倒温育过夜。Protein A/G琼脂糖珠(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)用PBS+0.05％吐温20洗涤一次、用PBS洗涤3次、然后在PBS+1％BSA中于4℃封闭2小时；每个步骤2倍珠体积；最终珠样品浆液的PBS:珠离心沉淀的比例为1：1。温育后，将样品以1500g离心2分钟，使珠粒沉淀。移出经过耗竭的上清液用于免疫荧光测定法中的处理。

e.免疫荧光测定

在体外培养(DIV)第4日，用含有人αSyn(含A53T突变)的cDNA的腺伴随病毒载体AAV1(GeneDetect，Bradenton，Florida)转导大鼠海马神经元，转导的MOI为3,000。在DIV第7日，用测试样品处理细胞(每个处理6个孔)。所有处理均通过半量更换培养基来完成。每块板均包含阴性对照(无处理条件)、阳性对照(10nM PFF)和无耗竭诱导剂对照。在DIV第18日(处理后11日)，将细胞固定并染色检测不溶性αSyn。为了固定，加入含有4％多聚甲醛、4％蔗糖和1％Triton的溶液15分钟。固定后，将细胞用含DPBS+0.05％吐温的洗涤缓冲液洗涤3次。然后将细胞用DPBS中的3％BSA和0.3％Triton阻断1-2小时以阻断非特异性信号。封闭步骤后，将细胞在封闭缓冲液中用一抗处理过夜。使用的一抗为抗αSyn和β突触核蛋白(EP1646Y，Millipore/Abcam；Cambridge,UK；N末端兔单克隆抗体，1:100稀释液)，抗S129磷酸化αSyn(81A，Covance/Biolegend，Bogart，GA小鼠单克隆，1:1000稀释)和抗MAP2(ab5392，Abcam；Cambridge，UK；鸡多克隆，1:10,000稀释)。第二天，将板用含0.05％吐温的DPBS洗涤3次，然后与荧光偶联的二抗温育1小时。使用的二抗为：Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG，1:500稀释；Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG，1:500稀释；Alexa Fluor 568山羊抗鸡IgG，1:500稀释；和Hoechst，1:800稀释。所有第二抗体均获自Invitrogen。然后将板用DPBS加0.05％吐温洗涤3次，每次15分钟，最后一次洗涤仅用DPBS。

f.高含量免疫荧光分析

在ArrayScan^TMVTi自动显微镜和图像分析系统(Cellomics Inc.，Pittsburgh，PA)上以10倍物镜采集图像。成像的板使用High Content Studio 3.0软件包(Cellomics，USA)中的神经元分析应用程序分析。利用Hoechst荧光(其定义核区域)来鉴定细胞，而通过MAP2染色来鉴定神经突。通过将核染色和MAP2染色重叠来鉴定细胞体。通过另外两个通道中的荧光强度来鉴定总的不溶性αSyn和总的S129磷酸化的αSyn(pS129)。诱导通过共定位于神经突中的总pS129斑点强度来定量。通过对阴性对照孔的平均值归一化来确定诱导倍数。通过将归一化的核计数、归一化的神经元计数和归一化神经突长度相乘来计算毒性指数，然后将每个孔对阴性对照孔的各自平均值归一化。毒性得分低于0.6的孔排除出分析。将每种抗体测试浓度的诱导倍数对用未耗竭的诱导剂处理的孔的平均值归一化。通过Prism(GraphPad)中的最小二乘拟合生成浓度响应曲线，使用公式Y＝底+(顶-底)/(1+10^((X-LogIC50)))，并为每个实验计算IC50。

结果

如图10A所示，通过高含量免疫荧光分析测量，使用AAV-hA53T-αSyn过表达A53T αSyn导致PFF诱导的pS129信号的强劲增加。PFF诱导的pS129信号是剂量依赖性的，并且用高至300nM的各种浓度的hA53T-αSyn单体均无法引发该信号(图10B)。另外，用9种不同的MSA脑裂解液样品处理也诱导了pS129信号(图10C)；但是，对照脑裂解物未观察到诱导(图10D)。pS129信号的PFF依赖性增加与MAP2阳性神经元的分枝点减少相关(图10E)。MSA裂解物中的诱导活性可以通过高速离心分离(图10F)，提示这些样品中的诱导剂是高分子量的聚集体。另外，用MSA离心沉淀处理后，pS129信号随时间而增加(7d温育：10nM PFF的0.22±0.06，n＝6；14d温育：10nM PFF的0.32±0.05，n＝6；18d温育：10nM PFF的0.52±0.08，n＝6)(图10G)。最后，与用hA53T-aSyn PFF所致的病理相似，用MSA脑裂解液处理后，分支点也减少了(10nM PFF：0.50±0.16，n＝4300；MSA：0.58±0.17，n＝1842；图10H)。

然后使用高含量测定法评估了不同的αSyn抗体免疫耗竭PFF和MSA脑裂解物样品中的诱导活性(即PFF诱导的S129磷酸化)的能力。测试了来自3名MSA患者，12-18号、01-03号、04-51号患者的裂解物。为了进行免疫耗竭，将样品与一系列浓度的抗体温育过夜。然后去除免疫复合物，将经过耗竭的样品与神经元培养物一起温育11天。通过对未经耗竭的对照孔的平均值的pS129强度归一化来测量诱导。图11中显示了用基准抗αSyn抗体抗体1进行的免疫耗竭的示例性浓度响应曲线，表8-11中汇总了IC 50。抗体1对PFF和MSA脑裂解物均显示出强效而完全的诱导剂消耗。这些结果证实了MSA裂解物中的诱导活性是依赖αSyn的。与对MSA裂解物(5.47nM，2.48nM和0.43nM，表9-11)相比，抗体1对PFF的诱导活性的耗竭更强(0.032nM，表8)，这提示这些诱导性种类在水平或构型方面可能存在差异。

接下来，测试了抗体7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11对PFF和MSA脑裂解物的诱导活性的免疫耗竭作用。7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11的浓度响应曲线示例分别如图12-17所示。表8-11分别总结了PFF，MSA 12-18，MSA 01-03，MSA 04-51的平均IC50值。与抗体1相似，所有6种抗体均以浓度依赖的方式耗竭了PFF的诱导活性(图12-17)。平均IC50为0.018nM至0.066nM，与抗体1的IC50无显著差异(表8)。所有6种抗体也以浓度依赖的方式完全耗竭了MSA裂解物；但是，与PFF结果相反，一些抗体的效力明显强于抗体1(表9-11)。例如，7A10在3种MSA裂解物中的诱导活性的耗竭均显著强于抗体1：7A10对MSA 12-18的耗竭是抗体1的14倍强(p<0.001，表9)，对MSA 01-03为抗体1的9倍强(p<0.05，表10)，对MSA 04-51为抗体1的12倍强(p<0.01，表11)。同样，21A3对于MSA 12-18的效力是抗体1的34倍强(p<0.01，表9)，对于MSA 01-03的效力是抗体1的7倍强(无显著性，表10)，对于MSA 04-51的效力是抗体1的10倍强(p<0.01)。相关的抗体15A5和36A3表现出相似的趋势(表9-11)。11H11-1与抗体1相比，效能差异的鲁棒性较小(表9-11)。44B11，其结合不同的表位，对MSA裂解物12-18的免疫耗竭是9E4的3倍强(p<0.05，表9)，且对MSA裂解物01-03(表10)和MSA裂解物04-51的耗竭与抗体1效力相当(表11)。观察到的效力的相对差异可能与诱导物的构象或菌株的差异有关，此类差异可能影响抗体表位的暴露或可及性。

表8:PFF IC50数据汇总

^a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns

表9:MSA 12-18裂解物的IC50数据汇总

^a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns

表10:使用MSA 01-03裂解物时的IC50数据汇总

^a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验.ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns

表11:MSA 04-51裂解物的IC50数据汇总

^a统计数字相对于抗体1且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns

还测试了去免疫化变体7A10和21A3对MSA 12-18提取物的免疫耗竭，以评估氨基酸修饰对抗体活性的影响。如表12所示，7A10-T93A与7A10亲本抗体(0.52nM)相比，展示出相似的耗竭MSA 12-18的诱导活性(0.66nM)；相反，其他7A10变体与7A10亲本相比弱化10-100倍。21A3的V82L变体表现出与21A3亲本相似的效力(表12)。这些结果加在一起表明，7A10-T93A和21A3-V82L中的修饰不影响总体抗体活性。

表12:使用MSA12-18时的IC50数据汇总

表12:使用MSA12-18时的IC50数据汇总

^a统计数字相对于7A10或21A3亲本且基于配对t检验。ns:p>0.05；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001.除非另外标明，t检验结果为ns

结论是，7A10、21A3、36A3、15A5、11H11-1和44B11对PFF和3种不同的MSA裂解物的聚集诱导活性表现出强效而完全的耗竭作用。这些结果，与在先实施例的结果结合起来，提示这些抗体优先结合这些疾病脑提取物中发现的某种αSyn形式，这种形式可能与病理传播有关，因此这些抗体可能可以有效地阻止αSyn病理在小鼠体内的传播。

实施例11：抗αSyn抗体体内阻断αSyn病理

该实施例描述了抗αSyn抗体在小鼠模型中抑制αSyn病理的扩散和传播的能力。

方法

a.小鼠

该研究中使用的小鼠为2-3月龄的雄性和雌性[PAC-Tg(SNCA^A53T)^+/+；Snca^-/-](PAC-A53T)小鼠，其在小鼠Snca基因敲除背景下带有人A53T突变(Kuo等人，HumanMolecular Genetics 2010:19:1633-50)，用于体内功效研究。小鼠以四只一组的形式收容在温度受控的容纳室中，随意提供食物和水。

b.抗体处理和立体定位手术

通过眶后抽血从一个子群的雄性和雌性PAC-A53T小鼠中收集大约40μl血液，用于设定抗体和抗药物抗体(ADA)水平的基线。整个小鼠群组分为两组：对照组和处理组。对照组的小鼠先进行腹膜内(i.p)生理盐水注射，然后向纹状体中注射PBS，每周一次的生理盐水注射4次，直到实验完成(n＝8)。第二组小鼠分为9个亚处理组：生理盐水(n＝11)，抗体1(n＝12)，7A10(n＝12)，11AH11(n＝12)，15A5(n＝11)，21A3(n＝11)，36A3(n＝11)，44B11(n＝12)和抗体3(n＝5)。第二组的所有小鼠在第一次腹膜内注射给药盐水或所选的抗体后均接种重组A53T-PFF。与对照组相似，处理组另外每周一次腹腔注射盐水或选定的抗体共4次。所有处理组的抗体剂量均为10mg/kg。抗体剂量的选择是基于研究I的结果，在研究I中，抗体3抗体有效减轻了PAC-A53T小鼠的pSer129病理。每周进行抗体处理之前，先在小鼠亚组中进行眼眶后采血，以评估所有处理组中的药代动力学(PK)和可能的ADA水平。A53T-PFF接种后30天和最后一次抗体治疗后24h处死小鼠。

立体定向注射：对于单侧纹状体注射，通过吸入异氟烷(1-4％)麻醉小鼠，并将小鼠放置在带有附加鼻锥的立体定位框架中，以在整个过程中维持异氟烷诱导的麻醉。先后用甜菜碱和70％异丙醇准备手术部位，然后切开1-2厘米的皮肤切口以暴露颅骨和参考标志性部位。用无菌棉拭子轻轻擦干净头骨。使用无菌的硬质合金微钻头在颅骨表面钻出0.5-1mm的孔。小鼠单侧注射10ug A53T-PFFs或PBS(对照组)至外侧纹状体(AP 0.2，ML-2.0，DV-3.6)。通过汉密尔顿注射器以每分钟0.25μl(每只小鼠总共2.5μl)的速率注射材料，并将针头保持在目标位置≥10min。一旦小鼠从手术中完全康复，就转移到容纳室中。

c.免疫组织化学(IHC)

在A53T-PFF注射后30天，处死小鼠以评估病理。对于组织学研究，将脑在4％多聚甲醛(PFA)中固定48小时，然后在15％蔗糖中固定24小时，然后在30％蔗糖溶液中固定48小时(或直到使用)。在滑动切片机(Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL)上制备冠状、40μm系列脑切片，并放入冷冻保护剂中直至进行IHC分析。IHC程序包括以下步骤：将脑切片移入染色皿中，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中漂洗3次(5分钟/次)。然后将切片在3.7％甲醛(在PBS中)中后固定(postfix)10分钟。然后将它们在PBS中漂洗两次(10分钟/漂洗)。接下来，将切片在新鲜的含3％H2O2、10％甲醇的PBS中温育30分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。将切片在PBS中漂洗3次(10分钟/漂洗)，然后在室温下于10％正常血清(使用来自二抗物种的血清)加0.3％Triton X-100的PBS中封闭1小时。然后将切片在PBS中漂洗3次(10分钟/漂洗)。将脑切片在微量滴定板摇床中以4℃在一抗[抗-alpha-syn pSer129(Abcam，Cambridge，UK；ab51253)以1:100,000稀释)中温育过夜，其中摇床以轻柔但可均匀地搅动切片的速度运行。在IHC的第二天，将脑切片在PBS中漂洗4次(10分钟/漂洗)，然后在生物素化2°抗体(PBS中的1:500山羊抗兔抗体，Vector BA-1000)中温育60分钟。然后将切片在PBS中漂洗(4次，10分钟/漂洗)，然后在室温下在PBS中制成的ABC复合物中温育60分钟(Elite ABC试剂盒，Vector laboratories，Burlingame，CA)。在PBS中漂洗(4次，10分钟/漂洗)后，将切片在过氧化物酶底物(Vector目录号SK-4100，Vector实验室，Burlingame，CA)中温育10分钟。最后，将脑切片用PBS冲洗(4次，10分钟/冲洗)，并装载在Superfrost Plus Micro Slides(VWR，Randor，PA)上。将玻片风干，然后在苏木精和Scott的蓝色溶液中复染，然后进行一系列乙醇漂洗。最后使用Permount和微型盖玻片(VWR，Randor，PA)将玻片盖上盖玻片，然后干燥以进行扫描和IHC定量分析。

IHC定量：使用Aperio AT2玻片扫描仪对装载在玻片上的脑切片进行成像。每个研究中的所有玻片均使用相同的照明功率和相机曝光进行成像。对每只动物的大约2个玻片进行了分析，每个玻片载有约20个冠状脑切片。在图像采集之后，使用HALO图像分析软件为每只动物鉴定包含下述感兴趣区域(ROI)的切片：a)初级皮质以及扣带回区域(耳间5.48mm-2.96mm，前囟1.69mm-0.83mm，6-10个切片)；和b)杏仁核区域(耳间2.72mm-1.76mm，前囟1.07mm-2.03mm，4-6个切片)。对于这两个区域，在同侧(注射侧)和相应的对侧上pS129染色占据的总面积描画出ROI。然后使用算法(Indica Labs)-面积定量(AreaQuantification)对每只动物的所有ROI描画部分的平均染色进行定量。使用相同的阈值设置同时分析所有图像以识别阳性染色区域。分析了组织面积(μm²)、总染色面积(μm²)、弱染色面积和强染色面积(μm²)、％染色阳性组织、％染色弱组织和％染色强阳性组织。用单变量方差分析，随后Dunnett事后检验采来确定治疗效果。

d.测量血浆和脑中的抗体水平

ELISA板(Costar 3925)用100μl 1μg/ml PFF(由α-突触核蛋白WT制备，PROTEOS)室温(RT)下包被2小时，其中PFF是在PBS(GIBCO目录号14190)中稀释的。包被前，将PFF超声处理15秒，每秒暂停一次。将板用含0.05％Tween的Dulbecco PBS(Life Technologies，#14040-117)洗涤四次，并用150μl溶于DPBS的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V，RochDiagnostic#03117332001)封闭，室温2～3h或4℃过夜。将标准品、血浆和脑样品在含Roche蛋白酶抑制剂(Roche 11836145001、1片/25ml)的1％BSA/0.05％Tween/DPBS中稀释。一式两份加载100μL/孔的样品(3～4个稀释度)，并在室温下温育约2小时。用0.05％Tween/DPBS洗涤平板四次之后，加入100μl二抗(碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG，JacksonImmuno#709-055-149，含50％甘油；1％BSA/0.2％Tween/DPBS中1:1000稀释)，室温下温育1小时。洗涤四次后，用100μL碱性磷酸酶底物(Tropix CDP StarReady-to-Use，含Sapphire II，T-2214，Life Technologies)显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102MultilabelReader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。

e.抗药物抗体(ADAs)的测量

开发了一套非定量免疫原性测定法，用来检测在用抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11和抗体3处理的小鼠中抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A3抗体、抗36A3抗体、抗44B11抗体和抗体3的可能生成。在这种酶联免疫吸附测定中，将抗体1、7A10、11AH11、15A5、21A3、36A3、44B11和抗体3包被在Maxisorp平底96孔板上4℃过夜。将以1:100稀释的血清样品在室温下温育过夜，以捕获潜在的抗药物抗体(ADAs)。捕获的抗体用山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体来加以检测。使用山羊抗人免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体作为阳性对照。加入四甲基联苯胺(TMB)作为HRP的比色底物，其产生的光密度(OD450)与血清样品中存在的抗体1、抗7A10抗体、抗11AH11抗体、抗15A5抗体、抗21A抗体3、抗-36A3抗体、抗-44B11抗体和抗体3的量成正比。

f.脑组织中αSyn水平的测量

简而言之，将ELISA板(Costar 3925)用100μL的各种捕获抗体4℃包被过夜，其中捕获抗体是在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4(Thermo Fisher Scientific#28382)中稀释的。捕获抗体MJFR1(Abcam ab138501)的使用浓度为0.1μg/ml(总α-突触核蛋白测定)或0.35μg/ml(pS129测定)，MJFR14-6-4-2-2(Abcam ab209538)的浓度为0.1μg/ml，1E8(BMS 5446.1E8.10)的浓度为0.3μg/ml。将平板用Dulbecco氏PBS(Thermo FisherScientific，#14040-117)洗涤四次，并用DPBS中的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V，Thermo Fisher Scientific)封闭，室温(RT)下2～3h或在4℃过夜。将标准品、脑样品和质控样品用含有Roche蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific，1片/25ml)和磷酸酶抑制剂2&3(Sigma Aldrich，P5726和P0044、1：100)的1％BSA/0.05％Tween/DPBS稀释。标准品是：α-突触核蛋白WT(rSeptide S-1001)，pS129(aa89-140，AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHHH-CONH2；SEQ ID NO:129)或PFF(由α-突触核蛋白制备，PROTEOS)。将样品以50μL/孔一式两份上样，并在4℃下温育过夜。将板平衡至RT后，加入50μl检测抗体(在1％BSA/0.1％Tween/DPBS中1:4000稀释)，并在室温下与样品共温育约2小时。检测抗体(来自BioLegend SIG39730的4B12，来自Abcam ab168381的MBJR13、2E2和23H8)是与碱性磷酸酶(来自Novus Biologicals#702-0010的AP试剂盒)预缀合的。然后将板用0.05％Tween/PBS洗涤四次，并用100μL碱性磷酸酶底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，带Sapphire II，T-2214，Thermo Fisher Scientific)显影30分钟。用Perkin ElmerEnVision(2102Multilabel Reader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。

结果

PFF接种的小鼠每周一次通过IP注射PBS(n＝11)或抗体1(n＝12)，7A10(n＝12)，11AH11(n＝12)，15A5(n＝11)，21A3(n＝11)，36A3(n＝11)，44B11(n＝12)和抗体3(n＝5)。接种了PBS的小鼠通过IP注射给药PBS(n＝8)作为阴性对照。所有抗体的剂量为10mg/kg。在每周抗体处理之前，在一部分小鼠中进行眼眶后取血，以评估药代动力学(PK)和可能的ADA水平。接种后30天和最后一次抗体处理后24小时收获小鼠。测量了一部分小鼠脑组织中的抗体水平。通过免疫组织化学在选定的大脑区域中测量了pS129αSyn病理。

血浆抗体暴露总结在图18中。抗体之间的血浆暴露变异～100倍，范围为1μg/ml至100μg/ml。某些抗体(例如21A3和抗体1)的低暴露可能是由于ADAs所致。抗体3对照抗体的血浆浓度与首次治疗研究中观察到的浓度相似。脑组织提取物中的抗体水平如图19所示。在不同抗体之间，脑暴露的变异～10倍，范围为～25ng/ml至250ng/ml。在与注射部位同侧和对侧的脑半球中观察到相似的抗体水平。在血浆样品中测量了ADA(表13和14)。对于抗体3(n＝3)、抗体1(n＝6)、7A10(n＝1)、21A3(n＝7)、15A5(n＝1)、36A3(n＝1)和44B11(n＝1)，在某些动物中观察到ADA。抗体11H11-1未观察到ADA。对于抗体1和21A3处理，较低的血浆抗体水平与ADA相关(图20)。与之相反，抗体3、7A10、15A5和44B11的ADA的存在对血浆抗体水平没有不利影响。

表13:血浆样品^a中的抗药物抗体活性

^a仅显示了具有显著的ADA活性的样品。11H11-1未观察到ADA

^b ID#表示收集样品的周数(wk1、wk2、wk3或wk4)和动物ID#

^c比色底物在450nm的光密度测量值

^d截断值基于溶媒对照样品的平均OD的2X。截断以上的OD值认为是显著的。显示了每个测定板计算的截断值。

表14:抗体1和抗体3对照抗体的抗药物抗体活性^a

^a仅显示了具有显著的ADA活性的样品。11H11-1未观察到ADA

^b ID#表示收集样品的周数(wk1、wk2、wk3或wk4)和动物ID#

^c比色底物在450nm的光密度测量值

^d截断值基于溶媒对照样品的平均OD的2X。截断以上的OD值认为是显著的。显示了每个测定板计算的截断值。

为了评估被动免疫对病理的传播和扩散的影响，采用免疫组织化学方法检测了运动皮层和杏仁核中αSyn pS129的表达。代表性图片如图21所示，图形汇总如图22所示。与PBS对照相比(p<0.001)，注射A53T-PFF的PAC小鼠在运动皮层(单因素ANOVA，p<0.05)和杏仁核(单因素ANOVA，p<0.001)中均显示pS1292显著增加(图22)。对照抗体3的被动免疫导致同侧杏仁核中的病理显著减少(单因素ANOVA，p<0.001)，以及同侧运动皮层中有病理减少的趋势。除抗体3之外，杏仁核中的病理明显减少的其他抗体还有7A10(p<0.01)，11H11-1(p<0.001)，15A5(p<0.01)，21A3(p<0.05)，36A3(p<0.01)和44B11(p<0.05)。仅抗体1没有表现出杏仁核中病理的显著减少。在运动皮层中，只有44B11展现出病理的显著减少(p<0.05)，而其他抗体显示出减少的趋势。运动皮层中缺乏显著的效果可能是由于观察到的PFF介导的诱导的变异。

接下来，确定了被动免疫对脑提取物中αSyn可溶性水平的影响。用ELISA法测量了脑提取物中的aSyn寡聚体、pS129αSyn和总αSyn水平，如图23和24所示。与PBS(Veh)对照相比，接种A53T-PFF的动物中αSyn寡聚体显著增加；通过两个独立的αSyn寡聚体ELISA(1E8+2E2和MJFR14642+23H8，两者均在实施例12中进行了描述)获得了类似的结果(图23)。在所有抗体处理的动物中均观察到与A53T-PFF组相比寡聚体水平降低的趋势。与寡聚体的结果相反，pS129αSyn和总αSyn水平不受接种A53T-PFF或被动免疫的影响(图24)。由于提取物中存在高水平的背景pS129，因此用pS129 ELISA不太可能检测到通过IHC观察到的pS129信号变化。

在第二项为期90天的研究中，使用实施例11中所述的方法，每周以3、10和30mg/kg的剂量通过腹膜内注射给予7A10-Vh-T93A-IgG1.3f。为了清楚起见，实施例11中测试的抗体是7A10 hIgG1.3f。该第二项研究中，使用7A10-Vh-T93A-IgG1.3f，在44％的处理动物中检测到了抗药物抗体的存在。这项研究的结果是高度可变的，且没有观察到对病理的显著影响。

综上所述，抗αSyn抗体7A10、11H11-1、15A5、21A3、36A3和44B11可在体内有效阻断αSyn病理的传播。

实施例12：使用寡聚体特异性ELISA评估脑提取物和CSF中αSyn寡聚体的水平

该实施例描述了用以测量人脑裂解物和CSF中的αSyn寡聚体水平的寡聚体特异性ELISA的开发。

方法

a.表位作图

用于表位作图研究的αSyn肽购自InnoPep(San Diego，CA)。产生了两组人αSyn序列的重叠肽，这些肽都具有N-末端生物素基团和PEG4接头及C末端。将肽以1mg/ml溶解在PBS中。为了作图研究，将100μL的PBS中的0.25μg/mlα-突触核蛋白肽添加到NeutrAvidin包被的高容量96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，并在室温(RT)下温育2小时(或4℃过夜)(O/N))。用～300μL洗涤缓冲液(PBS中0.05％Tween)将板洗涤3次。然后在室温下用150μl的溶于PBS的3％BSA封闭板约2小时(或者对于O/N为4℃)。将100μL测试样品在室温下在板上温育2h，其中测试样品稀释于样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/PBS，2片Roche蛋白酶抑制剂，于50ml缓冲液中)中。然后将板洗涤3次。加入100μL二抗并在室温下温育1小时，所述二抗是在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中以1:1000稀释的。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL的AP底物(Tropix CDP Star Ready-to-Use，带有Sapphire II，Applied Biosystems；目录号T-2214)，在室温下显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)读取发光计数。在测定过程中，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。使用的二抗包括：碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗人IgG(JacksonImmuno#709-055-149)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗兔IgG(JacksonImmuno#711-055-152)，碱性磷酸酶-亲和纯化的驴抗小鼠IgG(JacksonImmuno#715-055-151)。将所有二抗稀释至甘油终浓度为50％。

b.PFF的制备和纤丝化分析

使用实施例3中所述的方法制备和分析PFF。

c.αSyn结合测定

测试了抗体与人αSyn单体、人βSyn单体、人γSyn单体、人αSyn产生的PFF、人A53TαSyn产生的PFF、和包含人、大鼠和小鼠的序列的αSyn肽氨基酸111-140的结合。含有人、大鼠和小鼠序列的αSyn肽氨基酸111-140购自InnoPep(San Diego，CA)。人αSyn单体、人βSyn单体和人γSyn单体购自rPeptide(Bogart，GA)。

为了进行结合测定，将96孔板(Costa#3925，高结合微孔板)用100μL的1μg/mlαSynWT PFF(在PBS中)室温下包被2h(或者4℃过夜)。用～300μL洗涤缓冲液(dPBS中的0.05％Tween)将板洗涤3次。在室温下用150μl的3％BSA/PBS封闭板2小时(或者4℃过夜)。在样品缓冲液(0.1％BSA/0.05％Tween/PBS，2片罗氏完全蛋白酶抑制剂-于50ml缓冲液中)中制备了PFF(从2μg/ml开始)和α-synWT单体(从20μg/ml开始)的3倍系列稀释液。为了进行抗体温育，将等体积的2倍测定浓度的αSynPFF或单体与2倍测定浓度的抗体在BD falcon低结合平板中混合，并在室温下温育～2小时。将抗体与PFF或单体的混合物100μL添加至PFF包被的板中，并在室温下温育10分钟。将板洗涤3次。加入100μL驴抗人IgG[JacksoImmuno#709-055-149，含50％甘油；在PBSTB(1％BSA/0.2％Tween/dPBS)中1:1000稀释]，并将板在室温下温育1小时。将板洗涤3次，每次洗涤5-10分钟。加入100μL的AP底物(Tropix CDPStar Ready-to-Use，带Sapphire II，Applied Biosystems)，并在室温下将平板显影30分钟。使用Perkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)测量发光计数。在包被或与抗体混合之前，以15次1秒脉冲对PFF进行超声处理。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。

d.ELISA

ELISA平板(Costar)用100μl的各种捕获抗体4℃过夜包被，其中抗体稀释在BupH碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4(Thermo Fisher Scientific)中。使用的捕获抗体MJFR1(Abcam)的浓度为0.1μg/ml(总α-突触核蛋白测定)或0.35μg/ml(pS129测定)；MJFR14642(Abcam)的浓度为0.1μg/ml；1E8的浓度为0.3μg/ml。将板用Dulbecco氏PBS(Thermo FisherScientific)洗涤4次，并用PBS中的3％BSA(牛血清白蛋白，无蛋白酶，级分V)室温2～3h或于4℃过夜封闭。标准品、脑样品和QC样品用含有罗氏完全蛋白酶抑制剂(1片/25ml)和磷酸酶抑制剂2和3(Sigma Aldrich，1:100)的1％BSA/0.05％Tween/PBS稀释。标准品为：α-突触核蛋白WT(rPeptide)，pS129(aa89-140，AATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMP-pS-EEGYQDYEPEAHHHHHHH-CONH2；SEQ ID NO:129)或PFF。使用KONTES Micro Ultrasonic CellDisrupter(输出40，调谐50)对PFF和单体进行超声处理。将样品超声处理15次1秒/脉冲。样品50μL/孔一式两份上样，并在4℃下温育过夜。在将板平衡至RT之后，加入50μl检测抗体(在1％BSA/0.1％Tween/DPBS中稀释1:4000)，并与样品在室温共温育2小时。检测抗体(Covance的4B12、Abcam的MBJR13、2E2和23H8)是与碱性磷酸酶(Novus Biologicals的AP试剂盒)预缀合的。然后将板用0.05％Tween/PBS洗涤4次，并用100μL碱性磷酸酶底物(TropixCDP Star Ready-to-Use，带Sapphire II，Thermo Fisher Scientific)显影30分钟。用Perkin Elmer EnVision(2102Multilabel Reader)测量发光计数。在测定期间，将板保持恒定摇动(滴定板摇床，速度3)。使用GraphPad Prism分析数据。

e.人脑裂解物的制备

用KONTES Micro Ultrasonic Cell Disrupter(输出40，调谐50)将脑样品在经过滤的PBS(Gibco，#70011，1ml PBS/100mg组织湿重)中超声处理2x 10秒/脉冲。将样品置于2ml Eppendorf管中，管在超声处理期间保持于湿冰上。将脑裂解物在3,000g，4℃下离心5分钟。将上清液等分试样在液氮中冷冻并保存在-80℃。实施了包括αSynELISA(总的，以及pS129)和BCA在内的QC测定。

为了分离高速离心沉淀，将先前在1XPBS中以100mg/ml制备的脑匀浆在冰冷的1XPBS中稀释3倍至33.3mg/ml，然后在100,000Xg在4℃下离心30分钟。除去上清液并丢弃。将离心沉淀以与起始样品相同的体积重悬于冰冷的1X PBS中。

f.脑提取物的免疫沉淀

通过将以下样品按等比例混池，制备混池的人脑提取物：PD(PD1、PD3和PD5)，MSA(12-18、01-03和14-49)和DLB(13-37、05-31和08-26)。将混池后的样品用PBSTB缓冲液(1％BSA+0.05％Tween+PBS)稀释100倍。为了进行免疫沉淀，将脑提取物与抗体在4℃反复颠倒下温育2小时。然后加入Protein A/G琼脂糖珠(Thermo Fisher Scientific)，将样品在4℃下温育过夜。为了制备Protein A/G珠，将1.2ml珠浆在4℃下1000×g离心2分钟。除去储存缓冲液，并将珠子用含0.05％tween-20的0.6ml PBS洗涤1次，如上离心，再用0.6ml PBS洗涤3次。最后一次离心后，加入0.6ml含1％BSA的PBS，4℃下温育2小时，以封闭珠子。封闭后，通过离心分离珠子，并重悬于0.6ml PBS中至终体积为1.2ml。将珠浆以1:10(体积:体积)的稀释度添加到每个脑提取物中。过夜免疫沉淀后，将样品离心以除去珠子，分离经耗竭的脑样品，并通过ELISA进行评估。以下抗体用于免疫沉淀：26D6(特异性针对人Abeta的小鼠IgG对照抗体(氨基酸1-12)、MJFR-14642(Abcam)、LB509(Covance)、克隆42(BD)、7A10和1E8。

g.原代细胞培养分离

如实施例10所述制备原代大鼠海马神经元。

h.免疫荧光测定

如实施例10所述进行免疫荧光。

i.高含量免疫荧光测定

如实施例10所述进行高含量免疫荧光测定。

j.SDS-PAGE/免疫印迹分析

如上所述产生了来自MSA和PD脑组织的脑匀浆。取每个脑匀浆200μl，通过添加PBS(Thermo Fisher Scientific)使达到总体积400μl。将稀释的样品在4℃下以100,000x g的速度离心30分钟以分离高分子量的聚集体。将离心沉淀重悬于200μl PBS中。将50μl 4XNuPAGE上样染料(Thermo Fisher Scientific)和20μl NuPAGE 10X还原剂(Thermo FisherScientific)添加到130μl离心沉淀匀浆中。通过在95℃下温育5分钟使样品变性，然后将10μl样品在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶上分级分离，使用1X MES运行缓冲液(ThermoFisher Scientific)。凝胶在200V下运行50分钟，然后在30V下历时1小时转移至0.4μm硝酸纤维素(Thermo Fisher Scientific)。然后将印迹溶于TBST[含0.1％Tween-20(Promega)的TBS]中5％牛奶中封闭。然后用在含1％BSA的TBST(BioRad)中1:5000稀释的以下抗体探查印迹，4℃下震荡过夜：4B12(BioLegend)，4D6(BioLegend)，Syn-303(BioLegend)，81A(BioLegend)，EP1536Y(Abcam)，LB509(BioLegend)，小鼠IgG(Thermo FisherScientific)，抗肌动蛋白(Sigma)。所有抗体均利用BioRad EZ-link缀合试剂盒与HRP缀合。过夜温育后，用TBST洗涤印迹。使用Supersignal West Femto Maximum(Thermo FisherScientific)检测试剂检测HRP标记的抗体，并使用GE AI600 CCD相机捕获图像。

k.SEC-HPLC分析

将100μl的MSA脑匀浆11-46和对照脑匀浆11-49添加到400μl PBS中，并将样品在100,000x g下于4℃离心30分钟。保存上清液(sup)，将剩余的离心沉淀重悬于120μl PBS中。对于尺寸排阻色谱，将100μl上清液或离心沉淀注入Agilent 1100 HPLC上的BioSec-5SEC色谱柱(直径7.8mm x 300mm，Agilent)。在整个20ml运行时间内收集1ml级分。使用的流动相是PBS。该柱以1ml/分钟、37℃柱温运行。为了浓缩SEC级分，使用Waters OasisSPE HLB柱对样品进行固相萃取(SPE)。将每个SEC级分1ml用1000μl 4％磷酸稀释。SPE色谱柱用1ml甲醇预处理，然后用1ml H2O平衡。然后加入酸化的样品。上完样的色谱柱用1ml5％甲醇洗涤，样品用1ml 100％甲醇洗脱。将洗脱物在真空旋转干燥器中干燥过夜。将SPE纯化的SEC-HPLC级分干燥保存在-20℃下，直到进行SDS-PAGE/免疫印迹分析为止。

结果

a.抗体表征

表15总结了该研究中使用的抗体。

表15:抗体汇总

^a表位按照与实施例2相似的方式作图。见图1。

^b表位由售货商提供

^c J Duda,et al.,Ann Neurol 2002 H Tran,et al.,Cell Reports,2014

^d M Baba,et al.,Am J Path 1998R Jakes,et al.,Neurosci Letts 1999

^e Waxman and B Giasson,J Neuropath Exp Neurol 2008

评价了上述抗体与αSyn单体和αSynPFF的结合强度。将抗体在溶液中与浓度递增的αSyn单体或PFF一起温育。将未结合的抗体捕获在包被有PFF的板上，并通过单侧ELISA测定抗体水平。如图25所示，抗体1E8、2E2、23H8和MJFR14642显示出与单体相比更强的与PFF的结合力，单体-PFF的结合强度比分别为902、236、3258和7234(表16)。相反，抗体MJFR1、4B12和Syn303与PFF相比，对单体的结合力更强(图26)，单体-PFF的结合强度比分别为0.27、0.24和0.47(表16)。抗体4D6和LB509的PFF选择性不高，单体与PFF的结合强度比分别为26和34。总的来看，这些结果表明，抗体1E8、2E2、23H8和MJFR14642具有高度的PFF/寡聚体选择性。

表16:抗体结合汇总

b.寡聚体特异性ELISA的开发

基于如上所述的单体和PFF结合数据，开发了多种抗体组合配对，并且在夹心式ELISA中评估了它们对αSyn单体和αSyn PFF/寡聚体的检测。

表17中显示了鉴定的最优ELISA对以及那些测定法的特异性的汇总。

表17:ELISA汇总

^a检测抗体与碱性磷酸酶(AP)缀合

^b LLQ(定量最低水平)定义为测定背景X2。单体LLQ基于超声处理单体的结果；非超声处理的单体观察到了类似的结果。PFF LLQ基于超声处理的PFF。pS129 ELISA(MJFR1+MJFR13)的LLQ为2pg/ml(pS129肽)。

1E8.10+2E2.2和MJFR14642+23H8.G3这两个ELISA配对表现出对PFF/寡聚体的灵敏而特异性的检测，但对αSyn单体却没有(表17；图27)。对PFF的超声处理在两种测定中均增强了总体信号，表明这些测定对聚集体大小敏感，并且超声处理可能会暴露其他抗体结合位点。相比之下，超声处理对抗体检测单体的能力没有任何影响。两种测定对于检测经超声的PFF显示出相似的灵敏度，约为30pg/ml。在高至10ng/ml的单体浓度——所测试的最高浓度下，仅观察到背景信号。总的来看，这些结果证明，采用了1E8+2E2和MJFR14642+23H8的ELISA是PFF/寡聚体特异性的。

还开发了另外的ELISA配对组合，其中纳入了相同的捕获抗体(MJFR1)与不同的检测抗体的搭配，包括对N末端域(Syn303)，中间域(4B12)，C末端(4D6)和αSyn的pS129(MJFR13)特异性的抗体。MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6这些ELISA配对均表现出对αSyn单体和αSynPFF二者的灵敏检测(表17；图28)。所有这三种测定法均以与寡聚体ELISA相似的灵敏度检测到经超声处理的PFF(表17)。与寡聚体测定法不同，MJFR1+Syn303和MJFR1+4B12对PFF的检测不受超声处理的影响，这提示这些表位的暴露对聚集体的大小较不敏感。有趣的是，超声处理确实增强了MJFR1+4D6对PFF的检测，这可能与这一事实有关：4D6结合与寡聚体选择性抗体相似，结合到C末端表位。与寡聚体特异性测定法相反，MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn单体表现出灵敏的检测，LLQ分别为23、8和27pg/ml。对单体的检测不受超声处理的影响。MJFR1+MJFR13 ELISA展示了对pS129αSyn肽的灵敏和特异性检测，仅确证了其pS129特异性。

为了进一步评估特异性，还检测了MJFR1+Syn303，MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn家族成员β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白检测。如图29所示，所有三种测定均与γ-突触核蛋白或γ-突触核蛋白几乎没有交叉反应，确证了它们的αSyn特异性。综上所述，这些结果表明，MJFR1+Syn303、MJFR1+4B12和MJFR1+4D6对αSyn具有特异性，并且可以检测单体和寡聚体，从而支持它们作为“总”αSyn测定法的效用。

c.脑提取物中αSyn水平的测定

使用ELISA来测量从对照和疾病组织(AD、PSP、MSA、PD、DLB)产生的脑提取物中的寡聚体、pS129和总αSyn水平。稀释度线性和免疫耗竭研究证实了脑提取物ELISA信号的特异性。如图30所示，与其他神经退行性疾病(AD，PSP)和对照组的提取物相比，在PD脑提取物中检出了稳健水平的αSyn寡聚体(1E8+2E2和MJFR14642+23H8)。PD提取物中的平均寡聚体水平在1E8+2E2 ELISA中为36ng/mg总蛋白，在MJFR14642+23H8.G2 ELISA中为40ng/mg总蛋白(表18)。在大部分AD、PSP和对照提取物中的寡聚体水平<LLQ。与寡聚体结果相反，使用MJFR1+4B12测定法测得的所有提取物中的总aSyn水平相似(图30；表18)。在所有提取物中均检测到了pS129αSyn，但与对照相比，PD中的水平升高并且显著更高(图30；表18)。

表18:对照、PD、AD和PSP脑提取物中αSyn水平的汇总

^a数据对总蛋白归一化，并且表示为单体当量(pg/mg总蛋白)或pS129肽当量(pg/mg总蛋白)。总蛋白水平表示为mg/ml

为了确定在来自其他突触核蛋白病患者的脑组织中是否也存在αSyn寡聚体，还生成了MSA和DLD的提取物，并使用这些寡聚体ELISA进行了分析。如图31所示，在所有三种突触核蛋白病脑提取物(MSA、DLB、PD)中均检测到相似的、稳健的寡聚体水平，而在对照提取物中水平则≤LLQ；在两种寡聚体测定法中观察到相似的结果。与之相反，利用MJFR1+4B12测得的总αSyn水平在所有提取物中都是类似的，包括对照(图31)。突触核蛋白病提取物中的pS129水平也有相似程度的提高，且显著高于(MSA、DLB)或者倾向于高于(PD)对照(图31)。还使用对N末端区敏感的ELISA(MJFR1+Syn303)和对C末端区敏感的ELISA(MJFR1+4D6)测量了总αSyn水平。如图32所示，没有观察到总αSyn水平的差异。ELISA结果汇总在表19中。

表19:对照、MSA、DLB和PD提取物中αSyn水平的汇总

^a数据对总蛋白归一化，并且表示为单体当量(pg/mg总蛋白)或pS129肽当量(pg/mg总蛋白)。总蛋白水平表示为mg/ml

全部不同的突触核蛋白病脑提取物(MSA、DLB、PD)在1E8+2E2和MJFR14642+23H8ELISA中测得的寡聚体水平均高度相关(图33、表20)。在两种寡聚体测定中的绝对寡聚体水平是可比较的。pS129(MJFR1+MJFR13)的水平也与寡聚体水平高度相关。与之相比，MJFR1+4B12测定法中测得的总αSyn水平与寡聚体水平或pS129水平都没有显著的相关性(图33，表20)。然而，MJFR1+4B12测定法中的总αSyn与MJFR1+4D6测定法中的水平显著相关，并且显示出与MJFR1+Syn303测定法中测得的水平相关的趋势(图24，表21)。这些结果进一步验证了不同测定法中的信号特异性。寡聚体特异性ELISA与pS129 ELISA之间的关联性提示寡聚体种类很可能是磷酸化的。

表20:寡聚体水平的相关性^a

^a来自对MSA、DLB和PD脑提取物的分析的数据。显示了显著相关(p<0.001)的Pearsonr值。NS代表p>0.05

表21:总αSyn水平的相关性^a

^a来自对MSA、DLB和PD脑提取物的分析的数据。显示了显著相关(p<0.001)的Pearsonr值。NS代表p>0.05

d.对脑提取物中寡聚体的生化表征

高速离心可用于纯化αSynPFF，已被用于从脑提取物中分离出tau蛋白的高分子量聚集体。采用了类似的策略来帮助分离和表征突触核蛋白脑提取物中存在的αSyn聚集体。将对照、MSA、DLB和PD脑提取物进行高速离心，分离出可溶性(上清液)和不溶性(沉淀)物质，并通过寡聚体ELISA进行分析。如图35所示，在脑提取物离心沉淀(包括从对照脑组织产生的提取物)中检测到寡聚体。这些ELISA信号的特异性通过稀释线性得到了证实。两种寡聚体ELISA观察到相似的结果。离心沉淀中寡聚体相对于起始提取物中的水平的总回收率为20-80％(图35)。相反，在任何脑提取物中的上清液中均未检测到寡聚体。这些发现表明，寡聚体以高分子量聚集体形式存在，并且还表明，寡聚体存在于对照脑提取物中，但与疾病提取物相比含量较低。

为了进一步表征脑提取物中的高分子聚集体，将从对照和MSA脑提取物中分离的颗粒和上清级分进行大小排阻色谱，并通过SDS-PAGE/免疫印迹分析级分。如图36所示，来自对照和MSA提取物二者的上清液SEC级分中的大部分aSyn均在级分10中洗脱，对应的分子半径为～60kDa，提示该种类是四聚体。当通过SDS-PAGE/免疫印迹分析时，该四聚体分解为一个单体和较低分子量的裂解片段。与之相反，在离心沉淀级分中分离出的大部分aSyn通过SEC在空隙体积中(级分6)洗脱，对应的分子半径>670kDa。对照样品和MSA样品均观察到相似的结果，证实了对照提取物中存在聚集体：这些高分子量聚集体还通过SDS-PAGE/免疫印迹解析为单体和裂解片段。另外，在级分6中也检测到了来自离心沉淀分离物的aSyn，这提示高分子量聚集体与四聚体种类快速平衡。合起来看，这些结果证实了MSA和对照提取物中均存在高分子量聚集体，表明聚集体的大小>670kDa，并且在变性条件下(SDS加煮沸)聚集体被破坏。

为了进一步研究高分子量聚集体的潜在差异，使用不同的aSyn抗体通过SDS-PAGE/免疫印迹分析了从对照、MSA、DLB和PD中分离的提取物离心沉淀。显示了分子量范围分别为<20kDA(图37)，30-40kDa(图38)和60-100kDa(图39)的结果。使用IgG抗体对照确认了aSyn信号特异性。如图37所示，在所有脑提取物离心沉淀(4B12、4D6)中检测到可比较水平的作为单体迁移的aSyn(～14kDa)。然而，与PD和对照相比，MSA和DLB颗粒中裂解产物的水平和程度似乎更高(4B12)。识别aSyn的C末端结构域的4D6抗体的结果表明切割片段缺少该C末端区域。pS129信号(EP1536Y)在DLB最高中，>MSA>PD>>对照。肌动蛋白存在于离心沉淀分离物中，并且其水平在各样品之间相当。未观察到与IgG对照抗体的非特异性反应性，证实了在该分子量区域内的aSyn特异性。

在所有提取物沉淀中以可比较的水平检测到一个30-40kDa的突出种类，可能对应于aSyn的二聚体(图38)。Syn 303和4D6抗体的结果分别表明该种类包含完整的N和C末端结构域。有趣的是，使用抗体4B12并不能轻易检测到该突出的二聚体，尽管在DLB离心沉淀中存在低水平的反应性。这些结果表明4B12表位在该二聚体种类中被掩盖了，而且提示4B12反应性可能是二聚体构象的一个灵敏的指标。抗体81A的结果表明，该二聚体种类在S129处被磷酸化，并且在DLB离心沉淀中观察到最高水平。

在60-100kDa的分子量范围内检测到多种物质(图39)。检测到约60kDa(Syn303、4B12、4D6)和约80-100kDa(4B12，LB509、4D6)的潜在aSyn聚集体。总体而言，在所有脑提取物离心沉淀中，使用不同的aSyn抗体观察到的免疫反应性模式均相似。

e.细胞中不溶性，pS129 aSyn聚集体的诱导

当从突触核蛋白病患者脑组织中分离出的αSyn PFF和提取物添加到培养的原代神经元中时，会诱导形成不溶的、高度磷酸化的αSyn聚集体。此外，该诱导作用依赖于脑提取物中存在的αSyn高分子量种类。这些发现支持了αSyn病理可以以病毒粒子样的方式传播的观点，并且提示可传播的种类是αSyn的聚集体。对于在来自对照、MSA、DLB和PD提取物离心沉淀中分离的高分子量聚集体，评估了它们对过表达人A53T aSyn的原代神经元中不溶性的pS1290 αSyn的诱导作用。用MSA脑提取物离心沉淀处理11天后观察到了不溶性pS129的强健的诱导；相反，PD和DLB提取物离心沉淀观察到的诱导水平降低了10倍，而对照提取物离心沉淀仅观察到背景信号(图40)。诱导作用与离心沉淀分离物中存在的寡聚体水平无关。这些结果提示，MSA提取物离心沉淀所观察到的强健诱导作用可能与MSA高分子量种类与PD、DLB和对照相比的构象和/或修饰差异有关，并且这些差异可能会影响接收细胞的摄取和/或在接收细胞中启动模板聚合的能力。

f.人脑脊液中aSyn水平的测量

用aSyn寡聚体ELISA 1E8+2E2和MJFR14642+23H8来评估来自MSA突触核蛋白病患者和对照的脑脊液；还包括了总αSyn ELISA MJFR1+4B12用于比较。使用稀释度线性度和加标回收率分析来验证人脑脊液的检测方法并确定最佳稀释度。如图41所示，群组1中所有CSF样品(包括MSA，进行性核上性麻痹(PSP)和对照)的寡聚体水平均<LLQ。在1E8+2E2和MJFR14642+23H8 ELISA中都观察到了相似的结果。与之形成对照的是，在MJFR1+4B12测定中观察到的总aSyn水平为～1000pg/ml，且MSA、PSP与对照组之间的水平相似。分析了第二个群组的MSA和对照CSF样品(图42)。和群组1中观察到的一样，大多数样品中的寡聚体水平均＜LLQ；但是，在1E8+2E2 ELISA中有7个CSF样品(6个MSA和1个对照)检出了可定量的寡聚体水平。用MJFR1+4B12测得的总aSyn水平在MSA和对照CSF样品之间相似，为～1000pg/ml，与群组1的结果一致。

表22序列汇总

等同方案：

本领域技术人员仅通过常规实验即可认识到或能够确定本文公开的特定实施方案的许多等同方案。这些等同方案意欲被所附的权利要求所涵盖。