阅读说明：本技术 一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法 (A kind of lower method for accelerating to promote demineralization dentine remineralization of direct current auxiliary ) 是由 周洲 许涛 于金华 李泽汉 李娜 葛兴云 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法,属于生物材料工程技术领域。旨在提供一种加快脱矿牙本质再矿化的方法,其技术方案要点如下,S1.将脱矿的牙本质片进行磷酸化；S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间,双通管一部分放入酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂,另一部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内；S3.用导线导出电泳仪正负极；S4.将接有电泳仪负极的电极放入到双通管的一部分,进入到酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中,连有电泳仪正极的电极放入到盛有模拟唾液的双通管另一部分；S5.接通电泳仪电源导电,调整电流电压；S6.将S5获得的牙本质片样本清洗干净,得到所述再矿化脱矿牙本质片。(The invention discloses a kind of direct currents to assist the lower method for accelerating to promote demineralization dentine remineralization, belongs to biomaterial field of engineering technology.It is intended to provide a kind of method for accelerating demineralization dentine remineralization, drip irrigation device is as follows, and the dentine piece of demineralization is carried out phosphorylation by S1.；S2., the demineralization dentine piece of phosphorylation is fixed on to the centre of a double-way pipe, double-way pipe a part is put into casein phosphopeptide-nm amorphous calcium phosphate emulsion, and another part is fixed in the solution box for filling simulation saliva；S3. electrophoresis apparatus positive and negative anodes are exported with conducting wire；S4., the electrode for being connected to electrophoresis apparatus cathode is put into a part of double-way pipe, is entered in casein phosphopeptide-nm amorphous calcium phosphate emulsion, the electrode for being connected with electrophoresis apparatus anode is put into the double-way pipe another part for filling simulation saliva；S5. it is conductive to connect electrophoresis apparatus power supply, adjusts Current Voltage；S6. the S5 dentine piece sample obtained is cleaned up, obtains the remineralization demineralization dentine piece.)

一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法

技术领域

本发明涉及生物材料工程技术领域，具体地说，涉及一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法。

背景技术

仿生再矿化是微创牙科中的重要研究领域，通过仿生再矿化修复脱矿的牙齿，最大限度地发挥牙体自身的愈合潜能，可以解决牙齿敏感、牙齿龋坏的预防与自我修复等问题。牙齿再矿化可以分为牙釉质的再矿化和牙本质的再矿化。牙釉质的再矿化技术相对成熟，也取得了比较好的矿化效果。而牙本质再矿化因其结构特殊性，往往再矿化效果不确定，而且再矿化速度极慢。

牙本质作为牙体的主体结构，相比牙釉质矿化程度要低，除了70%的无机物，还有大约20%的有机基质和10%的水，牙本质中有机基质主要是Ⅰ型胶原纤维，胶原纤维是牙本质的基本结构单位，要真正实现牙本质再矿化，必须要使羟基磷灰石晶体进入到胶原纤维表面和胶原纤维之间。这个相比较于牙釉质再矿化直接在残留釉质晶体的基础上完成籽晶的外延和生长难度要大的多。当前在牙本质再矿化中通常使用磷酸钙复合物、生物活性玻璃离子、琼脂凝胶、聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM）等非胶原蛋白类似物引导牙本质的仿生再矿化，其作用往往速度较慢，且一般只能在牙本质表面形成一层表面矿化物，很难完成牙本质纤维内再矿化。这也很大程度制约了牙本质仿生再矿化的应用。

发明内容

鉴于目前牙本质再矿化的现状，本发明旨在发明一种用于医院临床的直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法，除了可以克服目前牙本质再矿化的缺陷，加快牙本质的再矿化，还能同时实现牙本质的纤维内和纤维外的再矿化，从而真正实现牙本质的仿生再矿化。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法，包括如下操作步骤：

S1.将脱矿的牙本质片进行磷酸化；

S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管一部分放入酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，另一部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S3.用导线导出电泳仪正负极；

S4.将接有电泳仪负极的电极放入到双通管的一部分，进入到酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中，连有电泳仪正极的电极放入到盛有模拟唾液的双通管另一部分；

S5.接通电泳仪电源导电，调整电流电压，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂和模拟唾液；

S6.将S5获得的牙本质片样本清洗干净，得到所述再矿化脱矿牙本质片。采用将经TPP处理的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触的方式，能够模拟牙齿在口腔的真实环境，便于临床的推广和使用。

进一步的，在S1中采用三聚磷酸钠对脱矿牙本质进行磷酸化，浸泡时间为24小时。因为牙本质仿生再矿化的最大难点，必须要使羟基磷灰石晶体同时进入到胶原纤维表面和胶原纤维之间，即同时实现纤维内和纤维外再矿化，这对牙本质再矿化实现机械等性能的恢复至关重要。通过三聚磷酸钠的磷酸化牙本质胶原纤维，即为后续牙本质再矿化提供了再矿化的模板，便于羟基磷灰石晶体很容易进入到牙本质的胶原纤维内，达到纤维内和纤维外同时再矿化的目的，提高再矿化牙本质的硬度和抗压强度。

进一步的，三聚磷酸钠的浓度是20g/L。

进一步的，酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙的质量百分数为10%。

进一步的，电极为铂片。

进一步的，电流为1~4mA，电压为8~12V。将直流电引入到牙本质再矿化中，通过直流电加快再矿化分子的有序运动，从而达到加快和促进再矿化的作用。通过电泳仪提供直流电，电流大小精确安全可控，电流大小和电压大小在实际工作中只能保持一个恒定，本发明选择恒流，电压只要控制在安全电压以下就行，为更好地为以后临床转化服务，本发明的电流大小主要设定为1mA、2mA、4mA，这是兼顾电流的作用效果和实际应用中人体安全电流的限制。

进一步的，在S3中，用鳄鱼夹分别连接两个电极。

进一步的，脱矿的牙本质片在磷酸化前进行超声预处理。

进一步的，酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中还含有氧化石墨烯。

进一步的，氧化石墨烯内部包覆碳化硅。

进一步的，氧化石墨烯的质量分数为5%-8%。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、以往方式的牙本质再矿化进展缓慢，一般要几周时间才能取得明显的再矿化效果，本发明采用直流电辅助再矿化，一定强度的直流电可以加快分子运动速度，从而在几个小时内就可以取得较好的再矿化效果，大大提高了再矿化的效率。

2、本发明通过三聚磷酸钠首先对脱矿的牙本质片进行胶原纤维磷酸化，为再矿化的牙本质片提供成核位点，当接通电源，带有阴离子的酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙将在直流电作用下向正极移动，此时因脱矿牙本质片已标记了成核位点，酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙进入到牙本质片中将是一种有序的结合，可以实现同时完成牙本质的纤维外和纤维内再矿化，这对后期牙本质再矿化后机械性能的恢复是至关重要的。

3、本发明提供的方法安全性高，简便经济，可为后期实现向临床转化运用；

4.氧化石墨烯的加入，使氧化石墨烯与酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙共同进入到牙本质片中，能够利用氧化石墨烯的多孔及其大的比表面积对电子进行快速的吸附，同时利用氧化石墨烯对电子进行传导作用，提高了本申请中电化学沉积的转化率，获得更加致密的牙本质；且氧化石墨烯具有良好的抗菌性，能够用于各种外部伤口愈合，防止感染；

5.氧化石墨烯包覆碳化硅能够有效提高氧化石墨烯的韧性和强度，进一步提高后期牙本质的机械性能的恢复度。

附图说明

图1是脱矿牙本质片的扫描电镜图；

图2是在4mA直流电辅助下通电2小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图；

图3是在4mA直流电辅助下未加入氧化石墨烯包覆材料通电6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图；

图4是在4mA直流电辅助下通电6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图；

图5是无直流电辅助下对照组再矿化6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图；

图6是4mA直流电辅助下未经TPP处理的脱矿牙本质片再矿化6小时的扫描电镜图；

图7是牙本质片的X衍射图；

图8是不同大小直流电辅助下再矿化后的牙本质片显微硬度变化结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

一种直流电辅助下加快促进脱矿牙本质再矿化的方法，包括以下步骤：

S1.制备脱矿牙本质样本，超声清洗备用。

S2.将脱矿的牙本质片放入20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，使脱矿的牙本质片完成磷酸化，为牙本质的再矿化提供成核位点。

S3.为更好地模拟牙齿在口腔的真实环境，将经TPP处理的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和5%氧化石墨烯包覆碳化硅，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内。模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触。

再矿化过程：

（1）用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极。两个铂片电极接入回路中即可提供直流电。

（2）将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分。保证电压仪接通电源后可以形成电流回路。

（3）接通电泳仪电源导电，调整合适的电流电压，一般电流设定为1mA、2mA、4mA，如果选定恒流，电压一般会有波动，总体不超过12V。以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂和模拟唾液，最后将牙本质片样本清洗干净，获取到再矿化脱矿牙本质片样本。

将脱矿牙本质片首先放入到20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，是为了使脱矿的牙本质片完成磷酸化，为牙本质的再矿化提供成核位点。

脱矿牙本质样本的具体制备方法如下：

（1）收集口腔门诊外科拔除的完整第三磨牙，用0.005%的麝香草酚溶液消毒浸泡，于4℃冰箱中保存；

（2）用高速涡轮机去除表面牙釉质，用慢速切割机制备4×4×1mm的牙本质片样本68片，用180目、400目、800目、1200目的砂纸依次打磨光滑，放入超声清洗中去离子水超声清洗5分钟，留4片作为阳性对照组不予处理；

（3）其余牙本质片样本用35%的磷酸凝胶反复涂擦60s以便模拟牙本质脱矿；脱矿的牙本质片样本在超声清洗机中通过去离子水清洗，干燥备用。同时留4片脱矿牙本质片作为阴性对照组。

以下实施例中将脱矿的牙本质样本分组，共分为：

（1）1mA直流电辅助再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（2）2mA直流电辅助再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（3）4mA直流电辅助再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（4）4mA直流电辅助加入氧化石墨烯包覆碳化硅材料再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（5）无直流电辅助再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（6）无TPP处理4mA直流电辅助再矿化组：矿化2小时、4小时、6小时各4片。

（7）阴性对照组（脱矿牙本质片）4片。

（8）阳性对照组（未脱矿牙本质片）4片。

实施例1：

S1.将脱矿的牙本质片放入20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，完成脱矿的牙本质片完成磷酸化；

S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S3.用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极；

S4.将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分；

S5.接通电泳仪电源导电，调整电流为恒定1mA，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和模拟唾液；

S6.将S5获得的将牙本质片样本清洗干净，获取再矿化2小时、4小时、6小时的再矿化牙本质片。

实施例2：

S1.将脱矿的牙本质片放入20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，完成脱矿的牙本质片完成磷酸化；

S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S3.用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极；

S4.将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分；

S5.接通电泳仪电源导电，调整电流为恒定2mA，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和模拟唾液；

S6.将S5获得的将牙本质片样本清洗干净，获取再矿化2小时、4小时、6小时的再矿化牙本质片。

实施例3：

S1.将脱矿的牙本质片放入20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，完成脱矿的牙本质片完成磷酸化；

S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S3.用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极；

S4.将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分；

S5.接通电泳仪电源导电，调整电流为恒定4mA，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和模拟唾液；

S6.将S5获得的将牙本质片样本清洗干净，获取再矿化2小时、4、小时、6小时的再矿化牙本质片。

实施例4：

S1.将未经磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S2.用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极；

S3. 将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分；

S4.接通电泳仪电源导电，调整电流为恒定4mA，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和模拟唾液；

S5.将S4获得的将牙本质片样本清洗干净，获取再矿化2小时、4小时、6小时的再矿化牙本质片。

实施例5：

S1.将脱矿的牙本质片放入20g/L的三聚磷酸钠（TPP）溶液中浸泡24小时，完成脱矿的牙本质片完成磷酸化；

S2.将磷酸化的脱矿牙本质片固定于一个双通管的中间，双通管上半部分放入10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和5%氧化石墨烯包覆碳化硅材料，乳剂与牙本质表面完全接触，双通管下部分固定于盛有模拟唾液的溶液盒内，模拟唾液与牙本质片的另一面也完全接触；

S3.用导线导出电泳仪正负极，使用鳄鱼夹分别连接两个铂片电极；

S4.将接有电泳仪负极的铂片电极放入到双通管的上半部分，进入到10%酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙乳剂中；连有电泳仪正极的铂片电极放入到盛有模拟唾液的双通管下半部分；

S5.接通电泳仪电源导电，调整电流为恒定4mA，以1小时为一个矿化周期，更换酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙（CPP-ACP）乳剂和模拟唾液；

S6.将S5获得的将牙本质片样本清洗干净，获取再矿化2小时、4、小时、6小时的再矿化牙本质片。

实施例6：

选取部分脱矿及再矿化牙本质样本进行乙醇梯度脱水，干燥，喷金，在扫描电镜下观察各牙本质样本的微观形态。图1是脱矿牙本质片的扫描电镜图，可见脱矿后牙本质小管基本都处于开放状态，无矿化物沉积。图2是在4mA直流电辅助下通电2小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图，可见通过再矿化，有部分牙本质小管已完成了封闭。图3是在4mA直流电辅助下未加入氧化石墨烯包覆材料通电6小时再矿化牙本质片的扫描电镜图，可见通过再矿化，大部分牙本质小管已完成了封闭。图4是在4mA直流电辅助下加入氧化石墨烯包覆碳化硅材料并通电6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图，可见通过再矿化，牙本质小管已基本完成了封闭，取得了比较好的再矿化效果。

图5是无直流电辅助下再矿化6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图，可见只有很少的牙本质小管的封闭，再矿化效果较差，说明缺少直流电辅助下的再矿化速度较慢。

图6是未经TPP处理的直流电辅助下再矿化6小时的再矿化牙本质片的扫描电镜图，可见虽然完成了不少牙本质小管的封闭，但再矿化颗粒较大且分布不均，不如同等条件下经TPP处理过的牙本质片再矿化效果好。

对牙本质样本进行X衍射分析，X射线衍射能够对物质的晶体成分和结构进行判断，如图7所示，(a)是无直流电辅助下6小时对照组再矿化牙本质片XRD结果，未出现明显波峰结构。(b)4mA直流电辅助下通电6小时经TPP处理过的再矿化牙本质片XRD结果在2θ=26°、32°时出现了羟基磷灰石峰值，已出现了类似天然未脱矿牙本质的晶体结构，(c)未脱矿牙本质片X射线衍射结果，显示明显的羟基磷灰石峰值。

对各组牙本质片进行显微纳米硬度检测，结果如图8所示，脱矿后牙本质片的硬度明显下降，随着再矿化时间的增加以及再矿化辅助直流电的增大，经TPP处理过的牙本质的硬度明显开始上升，牙本质的机械性能得到了较好的恢复，机械性能的恢复充分说明脱矿牙本质片完成了牙本质的纤维内再矿化。而未经TPP处理过的牙本质片的硬度恢复情况明显低于经TPP处理过的牙本质片，说明由TPP通过磷酸化脱矿牙本质片标记成核位点对后续完成牙本质纤维内再矿化起到重要作用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。