阅读说明：本技术 一种小分子多肽及其用途 (A kind of micromolecule polypeptide and application thereof ) 是由 周丽丽 袁倩 于 2019-08-07 设计创作，主要内容包括：本发明中公开一种小分子多肽及其用途。该小分子多肽KP-6T具有显著抑制及逆转肾脏组织纤维化和CKD进展的作用,且无明显毒副作用,因此可用于制备有效抑制CKD进展的药物。与现有技术中公开的小分子多肽KP-6相比,KP-6T与KP-6均可延缓晚期UUO小鼠的肾脏纤维化进展,但是KP-6T中仅含有11个氨基酸,肽链更短,合成更容易、造价更低、并且更容易在体内吸收分布。(A kind of micromolecule polypeptide and application thereof is disclosed in the present invention.Micromolecule polypeptide KP-6T has the function of significantly inhibiting and reverse kidney tissue fibrosis and CKD progress, and without obvious toxic-side effects, therefore can be used for preparing the drug for effectively inhibiting CKD progress.Compared with micromolecule polypeptide KP-6 disclosed in the prior art, KP-6T and KP-6 can delay the renal fibrosis of advanced stage UUO mouse to be in progress, but only containing 11 amino acid in KP-6T, peptide chain is shorter, and synthesis is easier, cost is lower and is easier to absorb distribution in vivo.)

一种小分子多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种小分子多肽及其在制备治疗慢性肾脏病(CKD)药物中的用途。

背景技术

慢性肾脏病(CKD)是一种由多种病因如高血压、糖尿病、肾炎等所引起的长期(超过三个月)的以肾脏结构改变、肾功能下降为特征的慢性疾病。进展至终末期肾功能衰竭(ESRD)的CKD患者终身依赖“肾脏替代治疗”来维持生命。研究表明衰老是CKD发生发展的独立危险因素。在过去的几十年中，伴随着人类社会的人口老龄化，CKD患病率呈现逐年上升趋势(Nat Rev Nephrol,2011,7:684-696)。CKD正成为一种全球“公共健康问题”，严重危害人类健康并消耗大量卫生资源。然而，目前临床上尚缺乏有效延缓CKD进展的药物。针对CKD的发病机制，寻找有效地抑制或延缓CKD进展的药物无疑是当前肾脏病学界的当务之急，成为亟待攻克的战略重点之一。

肾脏纤维化是CKD进展至终末期的共同病理表现，其特征是肾小球硬化，肾小管萎缩，肾间质大量炎症细胞浸润及细胞外基质过量沉积，毛细血管稀疏化。大量研究表明，肾脏损伤后Wnt/β-catenin信号的持续激活是CKD发生发展和肾脏纤维化的一个关键途径(Kidney Int Supple 2014,4:84-90)。并且较多文献中已公开Wnt/β-catenin信号激活与肝、肺、心的纤维化密切相关。因此，寻找阻断Wnt/β-catenin信号途径的对策，对于抑制肾脏、肝、肺、心纤维化的发生发展具有重要的理论意义和临床应用价值。

CN106822865A中公开了一种小分子多肽KP-6的用途，具体涉及小分子多肽KP-6在制备治疗慢性肾脏病(CKD)的药物中的用途，小分子多肽KP-6具有显著抑制肾脏组织纤维化和CKD进展的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效治疗慢性肾脏病的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子多肽KP-6T及其在制备治疗慢性肾脏病(CKD)药物中的用途。

本发明所采取的技术方案是：

本发明在CN106822865A公开的小分子多肽KP-6的基础上，进一步缩短肽链长度，得到长度仅11个氨基酸的小分子多肽KP-6T。

一种小分子多肽，其特征在于：其氨基酸序列为a)、b)中的任意一种：

a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：1为LQDAYGGWANR；

b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得氨基酸序列。

上述小分子多肽在制备抑制β-catenin蛋白及其下游靶基因表达水平的试剂中的应用

进一步地，β-catenin蛋白的下游靶基因包括但不限于Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、Snail-1、MMP7。

上述小分子多肽在制备治疗器官纤维化的药物中的应用，所述器官为肾、肝、肺、心中的任意一种或几种。

上述小分子多肽在制备治疗慢性肾脏病的药物中的应用。

一种抑制β-catenin蛋白及其下游靶基因表达水平的试剂，其特征在于：含有有效剂量的上述小分子多肽。

进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

一种治疗器官纤维化的药物，所述器官为肾、肝、肺、心中的任意一种或几种，药物中含有有效剂量的上述小分子多肽。

进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

一种治疗慢性肾脏病的药物，其含有有效剂量的上述小分子多肽。

进一步地，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果是：

本发明中提供一种小分子多肽KP-6T，KP-6T具有显著抑制及逆转肾脏组织纤维化和CKD进展的作用，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效抑制CKD进展的药物。

与现有技术中公开的小分子多肽KP-6相比，KP-6T与KP-6均可延缓晚期UUO小鼠的肾脏纤维化进展，但是KP-6T中仅含有11个氨基酸，肽链更短，合成更容易、造价更低、并且更容易在体内吸收分布。

附图说明

图1是UUO早期给药模型肾脏天狼猩红染色图。其中，图1A：此图中，左：假手术组；中：UUO7d模型组；右：UUO7d+KP-6T给药组。图1B：胶原纤维沉积面积占总面积的比例。

图2是UUO早期给药模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色及免疫印迹图。图2A为纤连蛋白(Fibronectin)免疫染色图，Sham：假手术组；UUO7d：模型组；UUO7d+KP-6T：给药组。图2B为纤连蛋白及α-肌动蛋白(α-SMA)的免疫印迹图。图2C为纤连蛋白表达量的相对定量统计图。图2D为α-肌动蛋白表达量的相对定量统计图。

图3是UUO早期给药模型各组小鼠肾组织active-β-catenin蛋白水平及其下游靶基因mRNA水平。图3A为active-β-catenin蛋白免疫印迹图。图3B为active-β-catenin蛋白表达量的相对定量统计图。图3C为active-β-catenin下游靶基因Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)的mRNA水平。图3D为active-β-catenin下游靶基因Snail-1的mRNA水平。

图4是UUO晚期给药模型肾脏天狼猩红染色图。其中，图4A：此图中，左：假手术组；中：UUO11d模型组；右：UUO11d+KP-6T给药组。图4B：胶原纤维沉积面积占总面积的比例。

图5是UUO晚期给药模型各组小鼠肾脏纤维化指标的免疫染色及免疫印迹图。图5A为纤连蛋白(Fibronectin)免疫染色图，Sham：假手术组；UUO11d：模型组；UUO11d+KP-6T：给药组。图5B为纤连蛋白及α-肌动蛋白(α-SMA)的免疫印迹图。图5C为纤连蛋白表达量的相对定量统计图。图5D为α-肌动蛋白表达量的相对定量统计图。

图6是UUO晚期给药模型各组小鼠肾组织active-β-catenin蛋白水平及其下游靶基因mRNA水平。图6A为active-β-catenin蛋白免疫印迹图。图6B为active-β-catenin蛋白表达量的相对定量统计图。图6C为active-β-catenin下游靶基因MMP7的mRNA水平。图6D为active-β-catenin下游靶基因PAI-1的mRNA水平。

图7是UUO晚期分别给予KP6T与KP6的效果对比图。图7A为蛋白免疫印迹图。Fibronectin，α-SMA是肾脏纤维化相关指标。Klotho反映肾小管病变的严重程度。active-β-catenin是Wnt信号通路激活的关键因子。图7B为肾脏切片的天狼猩红染色及Fibronectin、active-β-catenin免疫组化染色图。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

实施例1

本实施例中使用的KP-6T肽段的氨基酸序列为：LQDAYGGWANR。

KP-6T肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成，进行以下实验。

1.实验动物：BALB/C小鼠，雌雄匹配，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠18只，随机分为3组，每组6只。包括假手术组、模型组及用药组。

2.实验分组

1)假手术组：室温，3％戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后，选择左侧腹2-3cm为切口；局部消毒后，逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，发现左侧输尿管后，随即逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

2)模型对照组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3)用药组：同上麻醉、消毒。逐层切开皮肤、皮下、肌层及腹膜，找到左侧输尿管后，于输尿管上1/3段结扎，逐层缝合。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3.实验过程

KP-6T或KP-6水溶性的粉末用无菌的0.01Mol冰醋酸溶液稀释为10mg/ml的储存浓度。实验各组分笼饲养。假手术组仅观察。模型对照组仅给予0.01Mol冰醋酸溶液尾静脉注射。用药组予以UUO术后第1天或第5天开始连续6天以含有0.5mg/kg体重的KP-6T或KP-6的冰醋酸溶液尾静脉注射。饲养7天或11天后给予各组小鼠安乐死，取左侧肾脏，分别予以10％中性甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以天狼猩红染色及纤连蛋白免疫组化染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测纤维化指标、active-β-catenin及其靶基因表达水平。

4.实验结果

1)天狼猩红染色检测肾脏组织纤维化程度

(I)KP-6T减少UUO小鼠肾间质胶原沉积

实验结果如图1及图4所示，用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。

(II)KP-6T减少UUO小鼠肾脏纤维化

实验结果如图2和图5所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏纤连蛋白(Fibronectin)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)水平明显降低。

(III)KP-6T抑制UUO小鼠的异常活化的β-catenin信号通路

实验结果如图3和图6所示，与模型对照组比较，用药组小鼠肾脏的β-catenin蛋白及其下游靶基因表达水平明显降低。

(Ⅳ)KP6T与KP-6均可延缓晚期UUO小鼠的肾脏纤维化进展

实验结果如图7所示，与模型组比较，给予KP-6和KP-6T的小鼠肾脏纤连蛋白(Fibronectin)、平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)水平明显降低，肾***外基质沉积明显减少，健康肾小管上皮细胞表达的蛋白Klotho得以回升，Wnt信号通路被抑制。

综上所述，KP-6T明显地减少UUO小鼠肾间质胶原蛋白沉积，纤连蛋白和α-SMA的蛋白表达水平，并可以明显抑制CKD模型中的异常活化的β-catenin信号通路。UUO后第5天开始用药，也能明显抑制小鼠肾间质胶原蛋白沉积，纤连蛋白和α-SMA蛋白的表达水平。说明KP-6T既可明显延缓UUO小鼠肾脏纤维化的进展还可阻断已形成的肾间质纤维化。因此，KP-6T可以成为有效治疗CKD的新药。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 一种小分子多肽及其用途

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg

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