一种芡实离体快繁的方法
阅读说明：本技术 一种芡实离体快繁的方法 (Method for in vitro rapid propagation of gorgon fruit ) 是由 问涛 李吉春 曲爱爱 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及芡实离体快繁的方法,首先种子选取,选取当年新收获芡实种子；再种壳处理,继而外植体处理,然后种子催芽培养,再芡实无菌快繁体系建立,最后芡实组培生根苗驯化、移栽；即时打破芡实种子休眠,将种子去除种壳和外胚乳,运用组织培养技术将种胚催芽,从而获得芡实幼苗；完整建立芡实无菌快繁体系,从种子初代开始到组培生根苗移栽；首次实现全年随时可打破芡实种子休眠,彻底突破季节对芡实研发和生产的束缚。(The invention relates to a method for quickly propagating gordon euryale seeds in vitro, firstly, selecting seeds, selecting newly harvested gordon euryale seeds in the current year; performing seed shell treatment, then performing explant treatment, then performing seed germination acceleration culture, then establishing a gordon euryale seed sterile rapid propagation system, and finally performing tissue culture and rooting seedling domestication and transplantation on the gordon euryale seeds; timely breaking the dormancy of the gordon euryale seeds, removing seed shells and exoendosperm of the seeds, and accelerating germination of embryo by using a tissue culture technology to obtain gordon euryale seeds; completely establishing a gordon euryale seed sterile rapid propagation system from the initial generation of seeds to the transplantation of tissue culture rooting seedlings; the dormancy of the gorgon fruit seeds can be broken at any time all the year around for the first time, and the restriction of seasons on the research and development and production of the gorgon fruit is thoroughly broken.)
技术领域
本发明涉及一种芡实离体快繁的方法。
背景技术
芡实(Euryale ferox Salisb.)属睡莲科芡属一年生大型水生草本植物，又称鸡头、鸡嘴莲、鸡头果、鸡冠菜、鸡头米、雁头米、刺莲等，原产我国及东南亚，多分布在湖泊、池塘和滩地。芡实名列“苏州水八仙”之一，更是苏州优质地道药材。
芡实含有大量蛋白质、钙、磷、铁、脂肪、淀粉、维生素B1、维生素B2、维生素C、粗纤维、胡萝卜素、氨基酸等，含氨基酸多达18种，其中苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等为人体所必需的氨基酸，不仅具有较高的营养价值，还具有养血安神、益肾固精、去湿健脾、止泻止带等食疗功效，早在《本草纲目》中就记载有“芡实止渴益肾，治小便失禁、遗精、白浊带下”。芡实可药食两用，其含有甾醇类化合物、黄酮类化合物、环肽类化合物、倍半新木脂素类化合物、脑苷酯类化合物、酚类化合物等多种功效成分，具有抗氧化、抗疲劳、降血糖、延缓衰老、抗癌等药理作用，常应用于临床上治疗早期糖尿病肾脏疾病、乳糜血尿、中风后遗症以及慢性肠炎等疾病。由于芡实能起到积极的食疗和保健作用，越来越得到人们的认可和喜爱。
芡实分为苏芡和刺芡，苏芡曾名南芡，为驯化培育的栽培种，少刺，种籽粒大，米仁大，性糯，品质佳，产量高，经济效益高，是苏州珍贵的优质资源，也广泛种植，苏芡目前主要有传统地方品种紫花芡、白花芡，杂交选育品种有红花芡、姑苏芡1号、姑苏芡2号、姑苏芡3号、姑苏芡4号等。每年8月中旬到10月中旬，新鲜芡实种仁都供不应求，售价在100～200元/斤。芡实新品种的选育和开发前景越来越广阔。
芡实均以种子进行繁殖，但其种子成熟后必须经过一段休眠期才能完成其后熟作用，自然条件下保存要到翌年春才能萌发。朱红莲等人通过实验研究：浓H2SO4处理、机械处理和激素处理等方法均不能快速解除芡实种子的休眠。说明芡实种子在脱离母体后仍要经过一定时间的生理后熟，其休眠是一种后熟休眠，低温处理可以促进其后熟休眠解除，这可能是芡实经过长期演化而获得的一种对环境条件及季节性变化的生物学适应性。李彦连等人研究了山东品种芡实的组培快繁技术，但未提及如何打破种子休眠的问题，也未完整实现组培生苗移栽种植。
苏芡种壳厚且厚薄不匀，加工困难、出肉率低，完全依赖人工去壳，所以必须不断推出新品才能完全符合农业增效、农民增收的要求。目前芡实新品种选育完全依赖自然诱变和杂交育种，以上方法得到的芡实后代性状极其不稳定，大大增加了育种工作者的工作量和难度，然而芡实离体再生优化体系可广泛应用于种苗快速繁殖和遗传转化，并为芡实种子资源保存提供快速有效的方法，打破芡实种子休眠，打破季节对芡实研发和生产的束缚，满足市场需要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种芡实离体快繁的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种芡实离体快繁的方法，特点是：包括以下步骤：
1)种子选取，选取当年新收获芡实种子，将种子浸泡于纯水中密封储存于0～5℃环境中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出使用；
2)种壳处理，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜；剥出的去种壳完整种子浸泡于无菌水中，环境温度在18～25℃；
3)外植体处理，将去种壳完整种子用水持续冲洗，然后移置超净工作台，消毒顺序依次为：75％的酒精浸泡消毒30s～1min，无菌水冲洗3～5遍，接着用0.1％的HgCl2溶液浸泡消毒8～12min，无菌水清洗3～5次，期间不断晃动组培瓶，最后用无菌滤纸吸干表面水分；
4)种子催芽培养，消杀后的去种壳完整种子表面无水分且内部水分不低于50％，在超净工作台上用手术刀和镊子取下种胚，选择直径2mm以上的立即接种于发芽培养基中，发芽培养基为MS基本培养基，添加6-BA1.0～2.0mg/L、NAA0.1～0.2mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L和研碎后外胚乳20g/L，PH为5.8～6.0；将接种后芡实种胚置于光照下培养，培养条件为：温度25±1℃，光照强度30～100μmol·m-2·s-1，光照时间12～14h/d；
5)芡实无菌快繁体系建立，继续进行发芽诱导培养，待种胚发芽达2cm时移栽入继代生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L和5％AC活性炭；无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，促进生根苗生长；
6)芡实组培生根苗驯化、移栽，继续培养过程中选择叶片3片以上、植株高度3cm以上、根系健壮的生根组培苗；在培养室中打开盖子，加入无菌水，继续驯化培养。
进一步地，上述的一种芡实离体快繁的方法，其中，步骤1)，芡实种子以幼嫩到老熟程度等级依次划分为鸡黄、大担、小花衣、剥胚、大响亮、老粒共六级，选取小花衣、剥胚、大响亮和老粒，直径1.0cm以上饱满完整的种子。
进一步地，上述的一种芡实离体快繁的方法，其中，步骤2)，剥出的去种壳完整种子浸泡于无菌水中，浸泡时间不超过24小时。
进一步地，上述的一种芡实离体快繁的方法，其中，步骤3)，去种壳完整种子用水持续冲洗2～6小时。
进一步地，上述的一种芡实离体快繁的方法，其中，步骤4)，催芽培养期间及时清理污染植物材料。
进一步地，上述的一种芡实离体快繁的方法，其中，步骤6)，驯化培养10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上，随后定植。
本发明与现有技术相比具有显著的优点和有益效果，具体体现在以下方面：
①本发明即时打破芡实种子休眠，将种子去除种壳和外胚乳，运用组织培养技术将种胚催芽，从而获得芡实幼苗；完整建立芡实无菌快繁体系，从种子初代开始到组培生根苗移栽；首次实现全年随时可打破芡实种子休眠，彻底突破季节对芡实研发和生产的束缚；
②建立芡实无菌快繁体系，实现芡实周年育苗，为芡实育种研究提供基础；由于芡实自身生物学特性，自然状况下只能完成每年一次育苗，通过杂交育种、诱变育种等传统手段的种子无法高效率鉴定其性状，而本发明的方法可以运用在新品种的初步鉴定，大大提高育种效率，缩短育种年限；芡实在转基因育种领域仍然是空白，本发明方法中芡实无菌苗是转基因育种中最合适的受体，为芡实育种研究提供坚实的基础；
③为芡实种质资源保存提供快速有效的方法，打破芡实种子休眠，打破季节对芡实研发和生产的束缚，快速繁殖大量性状相同的芡实幼苗，对于芡实新品种选育，通过杂交育种产生的后代通过本发明方法进行快速繁殖，完美复制优良性状，更能大大缩短育种年限；
④对于物理诱变、化学诱变、多倍体育种及转基因育种，本发明方法能快速繁殖后代，芡实无菌苗更是最合适的受体；本发明方法可作为传统育种及转基因育种的必要手段。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明
具体实施方式
了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书中所特别指出的结构来实现和获得。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明具体实施方案。
1)种子选取，选取当年新收获芡实种子，按生物学统一规定，芡实种子以幼嫩到老熟程度等级依次划分为鸡黄、大担、小花衣、剥胚、大响亮、老粒共六级，选取小花衣、剥胚、大响亮和老粒，直径1.0cm以上饱满完整的种子，将种子浸泡于纯水中密封储存于0～5℃环境中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出使用；
2)种壳处理，将选取种子用剥壳护指器将坚硬种壳小心剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜；剥出的去种壳完整种子浸泡于无菌水中，环境温度在18～25℃，浸泡时间不超过24小时；
3)外植体处理，坚硬的种壳和厚实的外胚乳是导致芡实休眠的主要原因之一，将去种壳完整种子用水持续冲洗2～6小时，然后移置超净工作台，消毒顺序依次为：75％的酒精浸泡消毒30s～1min，无菌水冲洗3～5遍，接着用0.1％的HgCl2溶液浸泡消毒8～12min，无菌水清洗3～5次，期间不断晃动组培瓶，最后用无菌滤纸吸干表面水分；
4)种子催芽培养，消杀后的去种壳完整种子表面无水分且内部水分不低于50％，在超净工作台上用手术刀和镊子取下种胚，直径2mm以上，尺寸不达标直接舍弃，立即接种于发芽培养基中，发芽培养基为MS基本培养基(含大量元素、微量元素、铁盐、有机成分)，添加6-BA(6-苄基氨基嘌呤)1.0～2.0mg/L、NAA(萘乙酸)0.1～0.2mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L和研碎后外胚乳20g/L，PH为5.8～6.0；将接种后芡实种胚置于光照下培养，培养条件为：温度25±1℃，光照强度30～100μmol·m-2·s-1，光照时间12～14h/d；期间每天观察瓶苗生长状况，并及时发现消毒不彻底的污染植物材料，将已污染的组培瓶苗立即移出培养室进行消毒清洗；
5)芡实无菌快繁体系建立，继续进行发芽诱导培养，待种胚发芽达2cm时移栽入继代生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基(大量元素含量比MS减半)，添加0.2mg/LNAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L和5％AC活性炭，若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化；无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，促进生根苗生长；
6)芡实组培生根苗驯化、移栽，继续培养过程中选择叶片3片以上、植株高度3cm以上、根系健壮的生根组培苗；在培养室中打开盖子，加入无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上，随后定植。
实施例1
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于4℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出，用芡实专用剥壳器去壳，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜，剥出的去种壳完整种子分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒12min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，用手术刀切开厚厚的胚乳，将种子中胚的部位小心剥落，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，芡实外胚乳20g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒种胚，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在3～8天，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间10～20天，整个催芽诱导过程中，发芽率均保持在80％以上，污染率均低于15％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，活性炭0.5％。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时10～15天，芽生长形态健壮，叶柄粗壮。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，可促进生根苗生长。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达85％以上。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达90％以上。
实施例2
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于0℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒12min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，用芡实专用剥壳器去壳，将去除种壳后完整部分(胚和完整外胚乳)，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，芡实外胚乳20g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒去种壳种子，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在25～35天，种胚首先先伸出4个白色乳头状突起，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间8～15天，整个催芽诱导过程中，发芽率均保持在70％以上，污染率15～25％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，将完整芽体与外胚乳分离后转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA0.1～0.2mg/L，活性炭0.5％。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时6～12天，芽生长形态健壮，叶柄粗壮。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，可促进生根苗生长。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达95％以上。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达95％以上。
实施例3
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于5℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出，用芡实专用剥壳器去壳，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜，剥出的去种壳完整种子分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒12min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，用手术刀切开厚厚的胚乳，将种子中胚的部位小心剥落，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒种胚，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在3～8天，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间10～20天，整个催芽诱导过程中，发芽率在50～60％，污染率均低于15％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，活性炭0.5％。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时10～15天，芽生长形态健壮，叶柄粗壮。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，可促进生根苗生长。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达85％以上。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达90％以上。
实施例4
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于2℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出，用芡实专用剥壳器去壳，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜，剥出的去种壳完整种子分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒6min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，再用手术刀切开厚厚的胚乳，将种子中胚的部位小心剥落，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，芡实外胚乳20g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒种胚，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在3～8天，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间10～20天，整个催芽诱导过程中，发芽率在15～20％，污染率在65～75％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，活性炭0.5％。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时10～15天，芽生长形态健壮，叶柄粗壮。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，可促进生根苗生长。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达85％以上。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达90％以上。
实施例5
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于1℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出，用芡实专用剥壳器去壳，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜，剥出的去种壳完整种子分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒12min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，用手术刀切开厚厚的胚乳，将种子中胚的部位小心剥落，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，芡实外胚乳20g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒种胚，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在3～8天，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间10～20天，整个催芽诱导过程中，发芽率均保持在80％以上，污染率均低于15％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时15～20天，芽生长形态正常，植株枯死率较高达50～70％。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根后，在超净工作台中向培养瓶中注入5ml无菌水，可促进生根苗生长。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达70％以上。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达90％以上。
实施例6
外植体处理，取芡实剥胚种子100粒(直径1.0cm以上饱满完整无病害)清洗后作发芽诱导培养，将种子浸泡于纯水中密封储存于4℃冰箱中，期间3～5天清洗一次并更换纯水，1个月后取出，用芡实专用剥壳器去壳，将选取种子的种壳剥落，并保留完整种胚、胚乳以及表面透明的保护膜，剥出的去种壳完整种子分别用自来水冲洗后浸泡到800倍50％多菌灵溶液中20min，然后流水冲洗1h～2h后转入无菌的组培瓶中，移到超净工作台，消毒顺序依次为75％的酒精消毒45s，无菌水冲洗3～5遍，0.1％的HgCl2溶液消毒12min，无菌水清洗6～8次，期间不断晃动组培瓶，最后在无菌滤纸吸干表面水分后，并用无菌风吹干表面水分。
种子休眠打破及催芽处理，用手术刀切开厚厚的胚乳，将种子中胚的部位小心剥落，并接种置萌发培养基(MS培养基添加蔗糖20～30g/L、琼脂6～8g/L，芡实外胚乳20g/L，PH 5.8)中进行培养，接种时每瓶培养基只接种1粒种胚，这样便于观察、统计，也能避免外植体之间交叉感染。由于种胚不需要再经历自然状态下硬硬的种壳和厚厚的胚乳，此方法大大提高了催芽速度，芡实种胚平均萌动时间在3～8天，紧接着内胚乳被撑开，随后上胚轴伸长，胚芽伸出，继续伸长后成第1片线形叶，第1叶伸长达1cm左右需要平均培养时间10～20天，整个催芽诱导过程中，发芽率均保持在80％以上，污染率均低于15％。
芡实无菌快繁体系建立，完成芡实种子催芽后，并且第1叶伸长达1cm以上，转接进行继代培养，培养基配方为MS培养基添加蔗糖20～30g/L和琼脂6～8g/L，6-BA1.0～2.0mg/L，NAA 0.1～0.2mg/L，活性炭0.5％。随后抽出第2和3片叶，并且第1片叶伸长至2cm以上，平均耗时10～15天，芽生长形态健壮，叶柄粗壮。待种第一片叶长达2cm时移栽入生根培养基，培养及配方为1/2MS基本培养基，添加0.2～1.0mg/L NAA、蔗糖20～30g/L、琼脂7～7.5g/L，PH 5.8。若转接过早，幼苗容易停止生长，而转接过迟，幼苗会发生褐化。无菌苗生根培养过程中，生根率均高达85％以上，幼苗叶柄较短，叶片形态异常。
芡实组培生根苗驯化、移栽，完成芡实无菌苗生根培养后，在继续培养过程中选择叶片3片以上，植株高度3cm以上，根系健壮的生根组培苗。在培养室中打开盖子，加入定量的无菌水，继续驯化培养，10～20天后移至移栽水域旁接着驯化培养两周以上时间，随后定植，移栽成活率，30d后移栽成活率达65～75％。
芡实种子打破休眠，促进发芽，芡实种子在自然条件下每年三月份才自然萌芽，一年中有半年时间处于休眠状态，本发明即时打破芡实种子休眠，将种子去除种壳和外胚乳，运用组织培养技术将种胚催芽，从而获得芡实幼苗。
建立芡实无菌快繁体系，完成芡实周年育苗，为芡实育种研究提供基础。由于芡实自身生物学特性，自然状况下只能完成每年一次育苗，通过杂交育种、诱变育种等传统手段的种子无法高效率鉴定其性状，而本发明的方法可以运用在新品种的初步鉴定，大大提高育种效率，缩短育种年限。芡实在转基因育种领域仍然是空白，本发明方法中芡实无菌苗是转基因育种中最合适的受体，为芡实育种研究提供坚实的基础。
为芡实种质资源保存提供快速有效的方法，打破芡实种子休眠，打破季节对芡实研发和生产的束缚，快速繁殖大量性状相同的芡实幼苗，对于芡实新品种选育，通过杂交育种产生的后代通过本发明方法进行快速繁殖，完美复制优良性状，更能大大缩短育种年限。
对于物理诱变、化学诱变、多倍体育种及转基因育种，本发明方法能快速繁殖后代，芡实无菌苗更是最合适的受体；本发明方法可作为传统育种及转基因育种的必要手段。
综上所述，本发明完整建立芡实无菌快繁体系，从种子初代开始到组培生根苗移栽；首次实现全年随时可打破芡实种子休眠，彻底突破季节对芡实研发和生产的束缚。
需要说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非用以限定本发明的权利范围；同时以上的描述，对于相关技术领域的专门人士应可明了及实施，因此其它未脱离本发明所揭示的精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含在申请专利范围中。
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