一种创制花生新种质方法
阅读说明：本技术 一种创制花生新种质方法 (Method for creating new peanut germplasm ) 是由 王晶珊 刘斌 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种创制花生新种质方法,属于花生新品种培育技术领域,包括从花生种子的两个子叶瓣中间剥离种胚,以种胚作为诱变材料进行等离子体诱变；等离子体诱变处理后的花生种胚进行表面消毒；经表面消毒的花生种胚在无菌水中浸泡,种胚取出放入经高压灭菌的培养皿中,剥离胚小叶,随即接种于体细胞胚诱导培养基中进行培养；然后在体细胞胚萌发培养基上培养；以灭菌的沙子中无菌催芽的花生种子实生苗作为砧木,体细胞胚萌发长成的小苗作为接穗,嫁接苗移栽田间,成熟后按单株收获M2代种子,以诱变亲本作为对照。本发明利用等离子体诱变与组织培养结合的技术手段,克服花生种子大,无法利用等离子体诱变技术的瓶颈。(The invention provides a method for creating a new peanut variety, which belongs to the technical field of new peanut variety cultivation and comprises the steps of stripping a seed embryo from the middle of two cotyledon petals of a peanut seed, and carrying out plasma mutagenesis by taking the seed embryo as a mutagenesis material; performing surface disinfection on the peanut embryo subjected to plasma mutagenesis treatment; soaking the surface-sterilized peanut embryos in sterile water, taking out the embryos, putting the embryos into a culture dish subjected to autoclaving, stripping embryo leaflets, and then inoculating the embryos into a somatic embryo induction culture medium for culture; then culturing on a somatic embryo germination culture medium; taking aseptic germination-accelerating peanut seed seedlings in sterilized sand as stocks, taking young seedlings grown from somatic embryo germination as scions, transplanting the grafted seedlings into the field, harvesting seeds of M2 generations according to single plants after maturation, and taking mutagenic parents as controls. The invention utilizes the technical means of combining plasma mutagenesis and tissue culture to overcome the bottleneck that the peanut seeds are large and the plasma mutagenesis technology cannot be utilized.)
技术领域
本发明属于花生新品种培育技术领域，具体地说是涉及到一种创制花生新种质方法。
背景技术
花生又名落花生，是唯一一种地上开花地下结果的作物，因营养丰富，具有重要的保健作用，故又称为“长生果”。花生籽仁中除含有50％左右的脂肪之外，还含有蛋白质、多种维生素、多种氨基酸，具有增强记忆、降低胆固醇、预防心脑血管病、抗氧化、润肠通便等功效。花生全身是宝，花生蔓、花生壳富含蛋白质，是很好的动物饲料。并且花生叶具有很好的催眠作用。花生在我国国民经济中占有重要的位置。培育高产、优质、专用、多抗性花生新品种对提高花生产值和增加农民收益有着重要意义。但由于花生遗传基础狭窄、多样性差，成为花生育种获得突破的瓶颈，目前北方花生品种一般都有伏花生的亲缘，而南方花生一般都有狮头企的亲缘，造成花生品种亲缘关系近，利用常规杂交育种方法培育高产、优质、专用、多抗性花生新品种难以获得突破性进展。
为了突破花生遗传基础狭窄、多样性差的瓶颈，花生育种家们试图利用诱变技术创造新种质。等离子体诱变仪是近年来制作的新型仪器，具有很好的诱变效果，并且无毒、无任何对人体有害的污染气体产生，可在普通实验室对微生物、动物、植物进行诱变处理。但离子体诱变仪的诱变处理空间小，高度矮，而花生种子大，所以无法利用等离子体进行诱变处理，也即等离子体诱变技术无法用于花生种质创制与育种。
发明内容
为了解决背景技术的上述技术问题，本发明提供了一种创制花生新种质方法，本发明利用等离子体诱变与组织培养结合的技术手段，克服花生种子大，无法利用等离子体诱变技术的瓶颈，创制花生新种质，为花生育种提供材料，也为花生育种开辟新的途径；大幅增加选择群体，提高选择几率；克服突变体嵌和现象严重的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种创制花生新种质方法，括以下步骤：
(1)从花生种子的两个子叶瓣中间剥离种胚，以种胚作为诱变材料进行等离子体诱变；
(2)等离子体诱变处理后的花生种胚，进行表面消毒；
(3)经表面消毒的花生种胚在无菌水中浸泡8～12小时；
(4)浸泡的种胚取出，放入经高压灭菌的培养皿中，剥离胚小叶，随即接种于体细胞胚诱导培养基中进行培养；
(5)接种胚小叶培养的体细胞胚诱导培养基为：MS+5～15mg/L2,4-D；
(6)在体细胞胚诱导培养基上培养，胚小叶外植体开始形成体细胞胚，之后逐渐有体细胞胚形成；将存活的形成体细胞胚的胚小叶外植体转移到体细胞胚萌发培养基上培养，诱导体细胞胚萌发成苗；
(7)体细胞胚萌发培养基为：MS+4～6mg/LBAP；
(8)在体细胞胚萌发培养基上培养，每4周继代培养一次，促使体细胞胚萌发成苗；当小苗长到1.5cm以上时，即可作为接穗嫁接；
(9)以灭菌的沙子中无菌催芽的8～10日龄花生种子实生苗作为砧木，体细胞胚萌发长成的高1.5cm以上的小苗作为接穗，采用插接法在超净工作台中进行无菌嫁接，用封口膜包扎好嫁接口；嫁接苗在沙子中再培养3～5天，促使嫁接伤口愈合，然后移栽田间；
(10)嫁接苗移栽田间前2个周注意保湿，之后按常规进行田间管理；成熟后按单株收获M2代种子；
(11)收获的M2代种子按单株种成株行，以诱变亲本作为对照。
作为优选，步骤(2)中，消毒方法：用70～75％的酒精浸泡20秒，再用0.1％升汞溶液侵泡8～10分钟，之后用高压灭菌的无菌水清洗3～5次。
作为优选，步骤(2)中，消毒操作在超净工作台中进行，操作用的器具需高压灭菌或酒精灯灼烧。
作为优选，步骤(4)中，每粒种子8个胚小叶，也即种子出苗时的第一对真叶，每个真叶有4个小叶，一对真叶有8个小叶，这8个小叶是由8个胚小叶发育而成。
作为优选，步骤(4)中，选用胚小叶的理由是：与幼叶或成熟叶片相比，胚小叶分化程度低，再生能力强。
作为优选，步骤(5)和步骤(7)中，调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
作为优选，步骤(6)在体细胞胚诱导培养基上培养2周后，胚小叶外植体开始形成体细胞胚，之后逐渐有体细胞胚形成；由于辐照诱变作用，使部分胚小叶外植体褐化凋亡；一般适宜诱变剂量为半致死量或半再生率时的剂量，即一半外植体不能形成体细胞胚；培养4周后，将存活的形成体细胞胚的胚小叶外植体转移到体细胞胚萌发培养基上培养，诱导体细胞胚萌发成苗。
作为优选，步骤(11)中，生育期及收获期田间观察，与亲本一样、无变异和分离的株行淘汰；同一株行的单株间表现不一样、有明显分离，并且不同于诱变亲本，说明再生植株的胚性细胞为发生突变的细胞，由此再生的植株后代经自交，性状发生变异和分离；选择变异植株，再经过自交2～3代，使决定变异性状的基因纯合，创造花生新的种质资源。
本发明①以花生种子胚作为等离子体诱变材料，花生种子主要体积部分是两片子叶，而种子胚很小，以种子胚作为等离子体诱变材料可不受诱变空间小的限制。②诱变处理后，取种子胚的胚小叶作为外植体进行组织培养，每个胚小叶外植体可再生8个以上小苗，每粒种子的种子胚有8个胚小叶，如此每粒种子可获得64个以上再生苗。再生苗经嫁接移栽田间，每粒种子可获得60个以上植株，并开花结果。③常规诱变，只有茎顶分生组织细胞发生突变才能遗传给下一代，其他部位细胞为分化细胞，突变不能遗传，突变体嵌和现象严重。因为只有分生组织细胞具有多向分化能力，可以分化雌性胞母细胞、雄性胞母细胞，经减数分裂形成雌、雄配子，雌、雄配子结合产生下一代。但分生组织细胞在整个种子中所占比例极少，而大部分细胞是分化细胞。而本发明以花生种子的种胚进行诱变处理后，取胚小叶培养，通过胚胎发生途径再生植株，即培养的胚小叶外植体细胞经脱分化后，具备了多项分化潜能，每个细胞都具备再生植株的能力，可通过培养基中添加激素的种类和浓度调控再生途径(胚胎发生途径、器官发生途径)。本发明添加2,4-D调控胚胎发生途径再生，即脱分化的细胞形成胚性细胞，胚性细胞进一步发育成体细胞胚，体细胞胚萌发再生植株。胚性细胞起源于单个细胞，突变也是单细胞行为，一旦胚性细胞的基因发生突变，由其形成的体细胞胚以及萌发再生的植株全部细胞均为突变细胞，从而克服了突变体的嵌和现象，突变基因控制的性状均可以稳定遗传。
本发明的有益效果为：
本发明利用等离子体诱变与组织培养结合的技术手段，克服花生种子大，无法利用等离子体诱变技术的瓶颈，创制花生新种质，为花生育种提供材料，也为花生育种开辟新的途径；大幅增加选择群体，提高选择几率；克服突变体嵌和现象严重的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，以下中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本申请。
实施例1，一种创制花生新种质方法，包括以下步骤：
(1)从花生种子的两个子叶瓣中间剥离种胚，以种胚作为诱变材料进行等离子体诱变。
(2)等离子体诱变处理后的花生种胚，进行表面消毒。
消毒方法：用70％的酒精浸泡20秒，再用0.1％升汞溶液侵泡8分钟，之后用高压灭菌的无菌水清洗3次。消毒操作在超净工作台中进行，操作用的器具需高压灭菌或酒精灯灼烧。
(3)经表面消毒的花生种胚在无菌水中浸泡8小时。浸泡的目的使胚小叶吸水伸展，容易剥离。
(4)浸泡的种胚取出，放入经高压灭菌的培养皿中，剥离胚小叶，随即接种于体细胞胚诱导培养基中进行培养。每粒种子8个胚小叶，也即种子出苗时的第一对真叶，每个真叶有4个小叶，一对真叶有8个小叶，这8个小叶是由8个胚小叶发育而成。
选用胚小叶的理由是：与幼叶或成熟叶片相比，胚小叶分化程度低，再生能力强。这也是本发明前期工作经过反复试验得出的结论。
(5)接种胚小叶培养的体细胞胚诱导培养基为：MS+5mg/L2,4-D。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
MS是MS培养基，包括植物生长所必须的16种元素，有无机盐、有机成分(维生素+氨基酸+30g/L蔗糖+6～8g/L琼脂)。
2,4-D(二氯苯氧乙酸)在本发明中的的作用是，作为合成的植物生长素诱导培养的胚小叶细胞脱分化，并形成胚性细胞，最终由胚性细胞形成体细胞胚。
蔗糖的作用是提供胚小叶生长所需的能源和物质合成的碳骨架，并能调节培养基的渗透压。
琼脂的作用是固化培养基，使液体状变为固体状。
(6)在体细胞胚诱导培养基上培养2周后，胚小叶外植体开始形成体细胞胚，之后逐渐有体细胞胚形成。由于辐照诱变作用，使部分胚小叶外植体褐化凋亡。一般适宜诱变剂量为半致死量或半再生率时的剂量，即一半外植体不能形成体细胞胚。培养4周后，将存活的形成体细胞胚的胚小叶外植体转移到体细胞胚萌发培养基上培养，诱导体细胞胚萌发成苗。
(7)体细胞胚萌发培养基为：MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
BAP(6-苄氨基嘌呤)是细胞分裂素类植物生长调节剂，在本发明中的作用是，诱导体细胞胚萌发并长成小苗。
(8)在体细胞胚萌发培养基上培养，每4周继代培养一次，促使体细胞胚萌发成苗。当小苗长到1.5cm以上时，即可作为接穗嫁接。
(9)以灭菌的沙子中无菌催芽的8日龄花生种子实生苗作为砧木，体细胞胚萌发长成的高1.5cm以上的小苗作为接穗，采用插接法在超净工作台中进行无菌嫁接，用封口膜包扎好嫁接口。嫁接苗在沙子中再培养3天，促使嫁接伤口愈合，然后移栽田间。
(10)嫁接苗移栽田间前2个周注意保湿，之后按常规进行田间管理。成熟后按单株收获M2代种子。
(11)收获的M2代种子按单株种成株行，以诱变亲本作为对照。生育期及收获期田间观察，与亲本一样、无变异和分离的株行淘汰。同一株行的单株间表现不一样、有明显分离，并且不同于诱变亲本，说明再生植株的胚性细胞为发生突变的细胞，由此再生的植株后代经自交，性状发生变异和分离。选择变异植株，再经过自交2代，使决定变异性状的基因纯合，创造花生新的种质资源。
实施例2，一种创制花生新种质方法，包括以下步骤：
(1)从花生种子的两个子叶瓣中间剥离种胚，以种胚作为诱变材料进行等离子体诱变。
(2)等离子体诱变处理后的花生种胚，进行表面消毒。
消毒方法：用75％的酒精浸泡20秒，再用0.1％升汞溶液侵泡10分钟，之后用高压灭菌的无菌水清洗5次。消毒操作在超净工作台中进行，操作用的器具需高压灭菌或酒精灯灼烧。
(3)经表面消毒的花生种胚在无菌水中浸泡12小时。浸泡的目的使胚小叶吸水伸展，容易剥离。
(4)浸泡的种胚取出，放入经高压灭菌的培养皿中，剥离胚小叶，随即接种于体细胞胚诱导培养基中进行培养。每粒种子8个胚小叶，也即种子出苗时的第一对真叶，每个真叶有4个小叶，一对真叶有8个小叶，这8个小叶是由8个胚小叶发育而成。
选用胚小叶的理由是：与幼叶或成熟叶片相比，胚小叶分化程度低，再生能力强。这也是本发明前期工作经过反复试验得出的结论。
(5)接种胚小叶培养的体细胞胚诱导培养基为：MS+15mg/L2,4-D。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
MS是MS培养基，包括植物生长所必须的16种元素，有无机盐、有机成分(维生素+氨基酸+30g/L蔗糖+6～8g/L琼脂)。
2,4-D(二氯苯氧乙酸)在本发明中的的作用是，作为合成的植物生长素诱导培养的胚小叶细胞脱分化，并形成胚性细胞，最终由胚性细胞形成体细胞胚。
蔗糖的作用是提供胚小叶生长所需的能源和物质合成的碳骨架，并能调节培养基的渗透压。
琼脂的作用是固化培养基，使液体状变为固体状。
(6)在体细胞胚诱导培养基上培养2周后，胚小叶外植体开始形成体细胞胚，之后逐渐有体细胞胚形成。由于辐照诱变作用，使部分胚小叶外植体褐化凋亡。一般适宜诱变剂量为半致死量或半再生率时的剂量，即一半外植体不能形成体细胞胚。培养4周后，将存活的形成体细胞胚的胚小叶外植体转移到体细胞胚萌发培养基上培养，诱导体细胞胚萌发成苗。
(7)体细胞胚萌发培养基为：MS+6mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
BAP(6-苄氨基嘌呤)是细胞分裂素类植物生长调节剂，在本发明中的作用是，诱导体细胞胚萌发并长成小苗。
(8)在体细胞胚萌发培养基上培养，每4周继代培养一次，促使体细胞胚萌发成苗。当小苗长到1.5cm以上时，即可作为接穗嫁接。
(9)以灭菌的沙子中无菌催芽的10日龄花生种子实生苗作为砧木，体细胞胚萌发长成的高1.5cm以上的小苗作为接穗，采用插接法在超净工作台中进行无菌嫁接，用封口膜包扎好嫁接口。嫁接苗在沙子中再培养5天，促使嫁接伤口愈合，然后移栽田间。
(10)嫁接苗移栽田间前2个周注意保湿，之后按常规进行田间管理。成熟后按单株收获M2代种子。
(11)收获的M2代种子按单株种成株行，以诱变亲本作为对照。生育期及收获期田间观察，与亲本一样、无变异和分离的株行淘汰。同一株行的单株间表现不一样、有明显分离，并且不同于诱变亲本，说明再生植株的胚性细胞为发生突变的细胞，由此再生的植株后代经自交，性状发生变异和分离。选择变异植株，再经过自交3代，使决定变异性状的基因纯合，创造花生新的种质资源。
实施例3，一种创制花生新种质方法，包括以下步骤：
(1)从花生种子的两个子叶瓣中间剥离种胚，以种胚作为诱变材料进行等离子体诱变。
(2)等离子体诱变处理后的花生种胚，进行表面消毒。
消毒方法：用73％的酒精浸泡20秒，再用0.1％升汞溶液侵泡9分钟，之后用高压灭菌的无菌水清洗4次。消毒操作在超净工作台中进行，操作用的器具需高压灭菌或酒精灯灼烧。
(3)经表面消毒的花生种胚在无菌水中浸泡10小时。浸泡的目的使胚小叶吸水伸展，容易剥离。
(4)浸泡的种胚取出，放入经高压灭菌的培养皿中，剥离胚小叶，随即接种于体细胞胚诱导培养基中进行培养。每粒种子8个胚小叶，也即种子出苗时的第一对真叶，每个真叶有4个小叶，一对真叶有8个小叶，这8个小叶是由8个胚小叶发育而成。
选用胚小叶的理由是：与幼叶或成熟叶片相比，胚小叶分化程度低，再生能力强。这也是本发明前期工作经过反复试验得出的结论。
(5)接种胚小叶培养的体细胞胚诱导培养基为：MS+10mg/L2,4-D。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
MS是MS培养基，包括植物生长所必须的16种元素，有无机盐、有机成分(维生素+氨基酸+30g/L蔗糖+6～8g/L琼脂)。
2,4-D(二氯苯氧乙酸)在本发明中的的作用是，作为合成的植物生长素诱导培养的胚小叶细胞脱分化，并形成胚性细胞，最终由胚性细胞形成体细胞胚。
蔗糖的作用是提供胚小叶生长所需的能源和物质合成的碳骨架，并能调节培养基的渗透压。
琼脂的作用是固化培养基，使液体状变为固体状。
(6)在体细胞胚诱导培养基上培养2周后，胚小叶外植体开始形成体细胞胚，之后逐渐有体细胞胚形成。由于辐照诱变作用，使部分胚小叶外植体褐化凋亡。一般适宜诱变剂量为半致死量或半再生率时的剂量，即一半外植体不能形成体细胞胚。培养4周后，将存活的形成体细胞胚的胚小叶外植体转移到体细胞胚萌发培养基上培养，诱导体细胞胚萌发成苗。
(7)体细胞胚萌发培养基为：MS+5mg/LBAP+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。调整培养基的pH5.8，在高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。
BAP(6-苄氨基嘌呤)是细胞分裂素类植物生长调节剂，在本发明中的作用是，诱导体细胞胚萌发并长成小苗。
(8)在体细胞胚萌发培养基上培养，每4周继代培养一次，促使体细胞胚萌发成苗。当小苗长到1.5cm以上时，即可作为接穗嫁接。
(9)以灭菌的沙子中无菌催芽的9日龄花生种子实生苗作为砧木，体细胞胚萌发长成的高1.5cm以上的小苗作为接穗，采用插接法在超净工作台中进行无菌嫁接，用封口膜包扎好嫁接口。嫁接苗在沙子中再培养4天，促使嫁接伤口愈合，然后移栽田间。
(10)嫁接苗移栽田间前2个周注意保湿，之后按常规进行田间管理。成熟后按单株收获M2代种子。
(11)收获的M2代种子按单株种成株行，以诱变亲本作为对照。生育期及收获期田间观察，与亲本一样、无变异和分离的株行淘汰。同一株行的单株间表现不一样、有明显分离，并且不同于诱变亲本，说明再生植株的胚性细胞为发生突变的细胞，由此再生的植株后代经自交，性状发生变异和分离。选择变异植株，再经过自交3代，使决定变异性状的基因纯合，创造花生新的种质资源。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
除说明书所述的技术特征外，其余技术特征为本领域技术人员的已知技术，为突出本发明的创新特点，其余技术特征在此不再赘述。
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