一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法
阅读说明：本技术 一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法 (A kind of polyacrylamide gel and preparation method thereof for small molecular weight protein separation ) 是由 杨颂 王绪德 张高英 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳技术领域,尤其是一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶包括丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、超纯水、凝胶缓冲液、甘油、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺,凝胶缓冲液包括硼酸和Tris-HCl溶液,凝胶缓冲液的pH值为7.0。本发明以Tris-硼酸为缓冲体系制备聚丙烯酰胺凝胶,对小分子蛋白质实现很好的分离,蛋白条带清晰锐利,分离效果与目前常用的小分子蛋白分离凝胶Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶相当,分离效果甚至优于Tris-Tricine,这种方式大大降低了试剂的使用成本,并且可得到更优的分离效果。(The present invention relates to protein technique of polyacrylamide gel electrophoresis fields, especially a kind of polyacrylamide gel for small molecular weight protein separation, the gel includes acrylamide, N, N- methylene diacrylamide, ultrapure water, gel buffer liquid, glycerol, ammonium persulfate solution and tetramethylethylenediamine, gel buffer liquid includes boric acid and Tris-HCl solution, and the pH value of gel buffer liquid is 7.0.The present invention prepares polyacrylamide gel using Tris- boric acid as buffer system, separation well is realized to small protein, protein band is clearly sharp keen, separating effect is suitable with currently used small molecular protein separating gel Tris-Tricine polyacrylamide gel, separating effect is even better than Tris-Tricine, this mode greatly reduces the use cost of reagent, and available more preferably separating effect.)
技术领域
本发明涉及蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳技术领域，尤其涉及一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用聚丙烯酰胺凝胶为介质进行蛋白质分离分析检测的技术，聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子，酰胺侧链聚合后形成网状结构具备分子筛的作用，凝胶形成的网状孔径大小与凝胶浓度成反比，浓度越大，孔径越小，分离小分子量蛋白质能力越强；反之，浓度越小，孔径越大，分离大分子蛋白质效果较好，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于三个主要因素：凝胶孔隙度的大小、它所带净电荷以及分子的大小和形状，当消除电荷的影响时，影响迁移率的就是分子量大小和孔隙度，凝胶电泳技术分离蛋白的原理基于此；
用于制备聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系有很多种，例如Tris-Glycine，Bis Tris-MOPS，Tris-Acetate，Tris-Tricine等。其中大部分都是用于分离中等及以上大小分子量的蛋白质，用于小分子量蛋白质分离需要很高浓度的凝胶，浓度高凝胶的脆性高，对于可能的后续回收蛋白存在一定困难。在相同浓度凝胶条件下，对小分子量蛋白质分离的缓冲体系常用Tris-Tricine，但是Tricine试剂的成本相对较高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在小分子量蛋白质分离的缓冲试剂成本高的缺点，而提出的一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶包括丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、超纯水、凝胶缓冲液、甘油、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，所述凝胶缓冲液包括硼酸和Tris-HCl溶液。
优选的，所述凝胶缓冲液的pH值为7.0。
优选的，所述Tris的浓度为50-200mM，所述硼酸的浓度为50-200mM。
本发明还提供了一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
步骤1：配制30％丙烯酰胺储备液，其中丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的质量比为29:1，具体的实施步骤如下：
A、首先，称取29g的丙烯酰胺以及1g的N,N-甲叉双丙烯酰胺加入混合容器中；
B、然后，向容器中加入超纯水，使得丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺溶于超纯水中；
C、最后，将混合溶液定容至100mL；
步骤2：配制10％过硫酸铵储备液，称取100mg过硫酸铵溶于1mL超纯水中得到混合溶液；
步骤3：配制2.5×凝胶缓冲液，具体的实施步骤如下：
a、称取3.7856g Tris base和2.3175g硼酸混合加入容器中，并加入80mL超纯水；
b、向混合溶液中继续加入HCl滴定到pH为7.0；
c、最后将混合溶液定容至100mL；
步骤4：配制50％甘油，称取50g甘油，加入50mL超纯水得到混合溶液；
步骤5：配制5％浓缩胶，具体的实施步骤如下：
(1)、首先，取1mL步骤1中的30％丙烯酰胺储备液，然后2.4mL步骤3中的凝胶缓冲液；
(2)、然后，加入30μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液,并加入超纯水定容至6mL；
(3)、最后，在临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺；
步骤6：配制10％分离胶，具体的实施步骤如下：
S1、取4mL步骤1中的30％丙烯酰胺储备液，再加入4.8mL步骤3中的2.5×凝胶缓冲液，继续加入1.2mL步骤4中的50％甘油；
S2、加入60μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液,再加超纯水定容至12mL；
S3、临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺。本发明提出的一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法，有益效果在于：本发明以Tris-硼酸为缓冲体系制备聚丙烯酰胺凝胶，对小分子蛋白质实现很好的分离，蛋白条带清晰锐利，分离效果与目前常用的小分子蛋白分离凝胶Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶相当；通过硼酸替换Tricine使得凝胶制备成本大大降低且不影响对小分子蛋白质的分离效果，同时本发明制备的聚丙烯酰胺凝胶适用于一般的Tris-Glycine电泳缓冲液，本发明制备的聚丙烯酰胺凝胶为中性体系，制备的凝胶可长期保存不水解，不改变凝胶分辨率，未来可用来制备预制凝胶，这种方式大大降低了试剂的使用成本。
附图说明
图1为本发明的一种用于小分子量蛋白质分离电泳的聚丙烯酰胺凝胶的方法制备的分离胶为10％的Tris-Tricine凝胶和Tris-硼酸凝胶分离蛋白的对比图；
图2为本发明的一种用于小分子量蛋白质分离电泳的聚丙烯酰胺凝胶的方法制备的分离胶为18％的Tris-硼酸凝胶和18％的Tris-Tricine凝胶分离蛋白Marker对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶包括丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、超纯水、凝胶缓冲液、甘油、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，凝胶缓冲液包括硼酸和Tris-HCl溶液，凝胶缓冲液的pH值为7.0，Tris的浓度为50-200mM,硼酸的浓度为50-200mM。
本发明还提供了一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
步骤1：配制30％丙烯酰胺储备液，其中丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的质量比为29:1，具体的实施步骤如下：
A、首先，称取29g的丙烯酰胺以及1g的N,N-甲叉双丙烯酰胺加入混合容器中；
B、然后，向容器中加入超纯水，使得丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺溶于超纯水中；
C、最后，将混合溶液定容至100mL；
步骤2：配制10％过硫酸铵储备液，称取100mg过硫酸铵溶于1mL超纯水中得到混合溶液；
步骤3：配制2.5×凝胶缓冲液，具体的实施步骤如下：
a、称取3.7856g Tris base和2.3175g硼酸混合加入容器中，并加入80mL超纯水；
b、向混合溶液中继续加入HCl滴定到pH为7.0；
c、最后将混合溶液定容至100mL；
步骤4：配制50％甘油，称取50g甘油，加入50mL超纯水得到混合溶液；
步骤5：配制5％浓缩胶，具体的实施步骤如下：
(1)、首先，取1mL步骤1中的30％丙烯酰胺储备液，然后2.4mL步骤3中的凝胶缓冲液；
(2)、然后，加入30μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液,并加入超纯水定容至6mL；
(3)、最后，在临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺；
步骤6：配制10％分离胶，具体的实施步骤如下：
S1、取4mL步骤1中的30％丙烯酰胺储备液，再加入4.8mL步骤3中的2.5×凝胶缓冲液，继续加入1.2mL步骤4中的50％甘油；
S2、加入60μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液,再加超纯水定容至12mL；
S3、临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺。
结合附图1，配制10％分离胶和5％浓缩胶过程中，附图1中A是分离胶为10％的Tris-Tricine凝胶；B是分离胶为10％的Tris-硼酸凝胶；
泳道1：自制未预染蛋白Marker(10、15、20、25、30、35、40、45、55、70、110、150、220KD)；
泳道2：BSA(70KD)、溶菌酶(14KD)、抑肽酶(6KD)；
泳道3：PageRuLerTMPrestained Protein Ladder，10to 180kDa(Thermo fisher，26617)；
实验结果表明，Tris-硼酸缓冲液制备的凝胶具有与Tris–Tricine凝胶同等的分离小分子蛋白的能力。
实施例2：
作为本发明的另一优选实施例，与上一实施例的区别在于，一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶包括丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、超纯水、凝胶缓冲液、甘油、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺，凝胶缓冲液包括硼酸和Tris-HCl溶液，凝胶缓冲液的pH值为7.0，Tris的浓度为50-200mM,硼酸的浓度为50-200mM。
本发明还提供了一种用于小分子量蛋白质分离的聚丙烯酰胺凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
步骤1：配制30％丙烯酰胺储备液，其中丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的质量比为29:1，具体的实施步骤如下：
A、首先，称取29g的丙烯酰胺以及1g的N,N-甲叉双丙烯酰胺加入混合容器中；
B、然后，向容器中加入超纯水，使得丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺溶于超纯水中；
C、最后，将混合溶液定容至100mL；
步骤2：配制40％丙烯酰胺储备液，其中丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的质量比为19:1，具体的实施步骤如下：
A、首先，称取38g的丙烯酰胺以及2g的N,N-甲叉双丙烯酰胺加入混合容器中；
B、然后，向容器中加入超纯水，使得丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺溶于超纯水中；
C、最后，将混合溶液定容至100mL；
步骤3：配制10％过硫酸铵储备液，称取100mg过硫酸铵溶于1mL超纯水中得到混合溶液；
步骤4：配制2.5×凝胶缓冲液，具体的实施步骤如下：
a、称取3.7856g Tris base和2.3175g硼酸混合加入容器中，并加入80mL超纯水；
b、向混合溶液中继续加入HCl滴定到pH为7.0；
c、最后将混合溶液定容至100mL；
步骤5：配制5％浓缩胶，具体的实施步骤如下：
(1)、首先，取1mL步骤1中的30％丙烯酰胺储备液，然后2.4mL步骤4中的凝胶缓冲液；
(2)、然后，加入30μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液，并加入超纯水定容至6mL；
(3)、最后，在临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺；
步骤6：配制18％分离胶，具体的实施步骤如下：
S1、取5.4mL步骤2中的40％丙烯酰胺储备液，再加入4.8mL步骤4中的2.5×凝胶缓冲液，继续加入1.8mL 100％甘油；
S2、加入60μL步骤2中的10％过硫酸铵储备液,定容至12mL；
S3、临灌胶前加入6μL的四甲基乙二胺。
结合附图2，在配制18％分离胶和5％浓缩胶过程中，附图2中A是分离胶为18％的Tris-硼酸凝胶；B是分离胶为18％的Tris-Tricine凝胶；
泳道1：PageRuLerTMPrestained Protein Ladder，10to 180kDa(Thermo fisher，26617))；
泳道2：PageRuLerTMUnstained Low Range Protein Ladder,3.4to 100kDa(Thermo fisher，26632)；
结果表明，Tris-硼酸与Tricine具有相同的分离分子量小于10KD以下蛋白或多肽的能力，并且本发明Tris-硼酸凝胶的条带更锐利。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。