茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒及其制备方法和用途 (Tea polyphenol-metal nanoparticles, drug-loaded nanoparticles, preparation method and application thereof ) 是由 郭刚 母敏 王跃龙 周良学 仝爱平 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,涉及一种茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒及其制备方法和用途,具体是通过pH与谷胱甘肽双重响应茶多酚以调节细胞凋亡/铁死亡途径抗肿瘤研究方面的应用。本发明针对癌症治疗提供了一种用于递送化疗药的载药体系：茶多酚-金属纳米粒。该茶多酚-金属纳米粒通过向EGCG储存液中滴加金属离子储存液搅拌、离心、收集沉淀物而得；向EGCG储存液中滴加金属离子储存液和抗肿瘤药物,搅拌、离心、收集沉淀物则得到本发明载药纳米粒。本发明载药体系将抗肿瘤药物与金属元素同时递送到肿瘤组织并且被肿瘤细胞摄取,在肿瘤弱酸性和高水平谷胱甘肽条件下茶多酚-金属纳米粒结构解聚,释放游离金属元素、抗肿瘤药物达到治疗作用。(The invention belongs to the field of medicines, and relates to tea polyphenol-metal nanoparticles, medicine-carrying nanoparticles, a preparation method and application thereof, in particular to application of tea polyphenol in adjusting apoptosis/iron death in the aspect of anti-tumor research by dual response of pH and glutathione. The invention provides a drug delivery system for delivering chemotherapeutic drugs for cancer treatment: tea polyphenols-metal nanoparticles. The tea polyphenol-metal nanoparticles are obtained by dripping metal ion storage liquid into EGCG storage liquid, stirring, centrifuging and collecting precipitates; and (3) dropwise adding the metal ion storage solution and the anti-tumor drug into the EGCG storage solution, stirring, centrifuging, and collecting precipitates to obtain the drug-loaded nanoparticles. The drug-carrying system simultaneously delivers the antitumor drug and the metal element to the tumor tissue and is taken by tumor cells, the tea polyphenol-metal nanoparticle structure is depolymerized under the conditions of weak acidity of the tumor and high-level glutathione, and free metal elements are released, so that the antitumor drug achieves the treatment effect.)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒及其制备方法和用途，具体是通过pH与谷胱甘肽双重响应茶多酚以调节细胞凋亡/铁死亡途径抗肿瘤的应用。
背景技术
随着经济的飞速增长，周围环境的恶化也不断地加剧，从而导致患癌率日益增加。肿瘤，一般是指细胞在一些外界和内在因素等致癌因素的刺激下，导致基因发生了突变，其生长不受调控，进一步形成局部肿块。肿瘤分为良性和恶性。良性肿瘤一般对机体的危害不大，而恶性肿瘤会威胁生命。在恶性肿瘤治疗方面，科学家不断地进行探索。近几年，很多新型的癌症治疗技术已经出现，包括光热治疗、光动力治疗、光声治疗、免疫治疗等等。然而，临床上癌症治疗手段主要还是手术切除为主，化疗和放疗为辅进一步延长患者的存活时间，提高癌症的治疗率。很多化疗药主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用，但随着化疗药的长期使用会出现药物耐受，对正常组织产生毒副作用的现象。因此，探索一些新的策略为疾病的诊断和治疗提供科学的理论基础是十分必要的。结合治疗的出现打破了这一局面。
表没食子儿茶素没食子酸酯(以下简称EGCG)，是绿茶中主要的水溶性成份，也称为茶多酚，具有抗炎、抗氧化等多重药理活性(Z.Q.Liu,Chemical Methods To EvaluateAntioxidant Ability,Chemical Review.2010,110,5675-5691.)。中国专利申请CN102526022A报道了表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是抗肝癌药物，并且针对细胞靶点设计的药物，不易形成耐药性。EGCG可以降低患癌症的风险，主要归因于它对酶活性和信号转导途径的抑制作用，从而抑制了癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡。EGCG是一个两亲性化合物，既是水溶性又有脂溶的特性，因在其结构中含有多个苯环从而影响EGCG水溶性。然而，EGCG的稳定性较差，一些外界因素会致使其失活，包括高温、高氧、碱性环境以及金属离子的络合作用。为了提高其稳定性，保持其药理活性，通过EGCG改性解决了这一难题。之前的研究表明，简单的化学反应足够将多酚与透明质酸共价连接，从而保持EGCG的活性(Dixon,S.J.Stockwell,B.R.,The role of iron and reactiveoxygen species in cell death.Nature chemical biology.2014,10,9-17.)，这是因为透明质酸(HA)是一种天然的多糖，在调节人体代谢过程中起着至关重要的作用。壳聚糖(CS)是一种通过甲壳素的N-脱乙酰化而获得的天然阳离子聚合物，具有良好的生物相容性，可生物降解；通过羟基自由基接枝对EGCG进行改性，可以提高EGCG稳定性，同时可以改善壳聚糖的溶解性，乳化活性和抗氧化性(Curcio,M.；Puoci,F.；Iemma,F.；Parisi,O.I.；Cirillo,G.；Spizzirri,U.G.；Picci,N.,Covalent insertion ofantioxidant moleculeson chitosan by a free radical grafting procedure.Journal of agricultural andfood chemistry.2009,57,5933-8.)。EGCG结构中酚羟基的存在使其易于发生氧化反应并且可与多种金属离子发生络合反应，通过Fe3+，EGCG，PVP之间的络合自组装作用，孵育24h，制备了EFPP纳米粒，用于治疗帕金森疾病(Liu Z,Li X,Wu X,Zhu C.A dual-inhibitorsystem for the effective antifibrillation of Aβ40peptides by biodegradableEGCG–Fe(iii)/PVP nanoparticles.Journal of Materials Chemistry B 2019；7:1292-9.)。中国专利申请CN107095861A公开了一种EGCG与金属离子的药物的制备方法，将药物加入到二甲基咪唑，聚乙烯吡咯烷酮和硝酸锌中，形成咪唑骨架，再引入EGCG和金属盐等水溶液，最后加入EDTA洗涤，得到EGCG与金属离子的双刺激响应药物。中国专利申请CN100361655C报道了通过EGCG，Ca，PVP作用，通氮气保护，经过高压均质机均质等一系列步骤制备形成EGCG-钙络合物，用于治疗骨质疏松。然而，以上制备EGCG/金属纳米粒的方法步骤多、耗时长，并且有些制备方法需要添加有机溶剂，这样不利于后期的纯化处理，并且会对环境造成污染以及浪费原料，另外，也不利于大批量生产。
铁是地壳中含量第四高的元素，铁元素是构成人体的微量元素之一。在成年人体内大约含有4.5g铁，主要是以血红蛋白的形式存在。在人体代谢过程中，铁参与氧的运输和储存。血红蛋白作为运输氧气的载体，通过与氧结合，运输到身体的每一个部位，参与人体的呼吸氧化，提供机体需要的能量。线粒体作为人体的“能量工厂”，铁元素直接介导线粒体内能量的释放。另外，铁能够促进机体发育，提高机体对疾病的抵抗力。在机体正常的生理状态下，铁的含量保持动态平衡，这是一个稳定的状态。食物中吸收的铁可以补充机体丢失的铁，同时又能满足机体发育的需要。铁吸收、转运和储存共同调节着铁的动态平衡。然而，当机体摄入的铁含量过高时，会导致人体内铁过载，进一步诱导一些潜在的疾病发生，如心脏、肝脏疾病。铁死亡是2012年由Stockwell定义的一种新的细胞死亡途径，是指铁离子依赖性的非凋亡性细胞死亡模式(Dixon,S.J.；Lemberg,K.M.；Lamprecht,M.R.；Skouta,R.；Zaitsev,E.M.；Gleason,C.E.；Patel,D.N.；Bauer,A.J.；Cantley,A.M.；Yang,W.S.；Morrison,B.,3rd；Stockwell,B.R.,Ferroptosis:an iron-dependent form ofnonapoptotic cell death.Cell.2012,149,1060-72.)。在铁死亡途径中，活性氧、脂质过氧化物、线粒体变小、线粒体膜密度增加是其主要特点。铁死亡过程中，细胞在形态、基因、生化水平与凋亡明显不同。近期的研究表明，铁死亡参与了许多生理和病理过程，包括急性肾损伤、肿瘤发生、中枢神经退行性疾病等。研究表明多种外界因素均可诱导细胞发生铁死亡过程。一些激活剂、抑制剂和铁螯合剂可以调控铁死亡途径。正常的生理状态下，铁含量在细胞内保持一定的动态平衡；过量的铁离子会造成“铁超载”，进一步诱导细胞死亡，其主要特征为铁离子聚集触发了一系列氧化反应，包括膜脂质过氧化反应以及过度氧化应激，从而导致选择透过性损坏质膜，最终形成细胞死亡(Dixon,S.J.；Stockwell,B.R.,Therole of iron and reactive oxygen species in cell death.Nature chemicalbiology.2014,10,9-17.)。依赖于铁离子诱导铁死亡途径发挥抗肿瘤效应已经有了研究报道，Fe3+、Fe2+通过与肿瘤细胞内高水平的H2O2发生芬顿反应产生活性氧，导致GPX4失活，诱导细胞铁死亡。(Shen Z,Liu T,Li Y,Lau J,Yang Z,Fan W,et al.Fenton-Reaction-Acceleratable Magnetic Nanoparticles for Ferroptosis Therapy of OrthotopicBrain Tumors.ACS nano 2018；12:11355-65.Liu T,Liu W,Zhang M,Yu W,Gao F,Li C,etal.Ferrous-Supply-Regeneration Nanoengineering for Cancer-Cell-SpecificFerroptosis in Combination with Imaging-Guided Photodynamic Therapy.ACS nano2018；12:12181-92.)，但是，基于EGCG与Fe3+之间形成的纳米粒诱导铁死亡途径，并且用于肺癌的治疗尚未见任何报道。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是针对癌症的治疗，提供一种用于递送化疗药的载药体系：茶多酚-金属纳米粒。
本发明所解决的第二个技术问题是提供了本发明载药体系茶多酚-金属纳米粒的制备方法，其步骤包括：
A、制备EGCG储存液：取EGCG粉末溶于去离子水中，所得EGCG储存液浓度为1-10mg/mL；
B、制备金属离子储存液：取FeCl3.6H2O或FeSO4溶于去离子水中，所得离子储存液浓度为1-10mM；
C、制备茶多酚-金属纳米粒：向EGCG储存液中滴加金属离子储存液，边滴加边搅拌，搅拌0.5-4h后，离心收集沉淀物，即得茶多酚-金属纳米粒。
上述技术方案中，步骤A中优选制备所得EGCG储存液浓度为2mg/mL。
上述技术方案中，步骤B中制备所得金属离子储存液是以FeCl3.6H2O或FeSO4为原料的Fe3+储存液。
上述技术方案中，步骤B中优选制备所得Fe3+储存液浓度为1mM。
上述技术方案中，步骤C中优选搅拌时间1h。
上述技术方案中，金属离子储存液为Fe3+储存液时，步骤C中茶多酚-金属纳米粒中Fe3+储存液与EGCG储存液的体积比为1:19～1:199；优选Fe3+储存液与EGCG储存液的体积比为1:99。
本发明所解决的第三个技术问题是提供一种载药纳米粒，是以茶多酚-金属纳米粒为载药体系，加入活性药物制成的载药纳米粒。
本发明所解决的第四个技术问题是提供该载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
A、制备EGCG储存液：取EGCG粉末溶于去离子水中，所得EGCG储存液浓度为1-10mg/mL；
B、制备金属离子储存液：取FeCl3.6H2O或FeSO4溶于去离子水中，所得金属离子储存液浓度为1-10mM；
C、制备载药纳米粒：向EGCG储存液中加入抗肿瘤药物，然后滴加金属离子储存液，边滴加边搅拌，搅拌0.5-4h后，离心去除未被装载的游离药物，收集沉淀物，即得载药纳米粒。
上述技术方案中，步骤A中优选制备所得EGCG储存液浓度为2mg/mL。
上述技术方案中，步骤B中优选制备所得金属离子储存液是以FeCl3.6H2O或FeSO4为原料的Fe3+储存液。
上述技术方案中，步骤B中优选制备所得Fe3+储存液浓度为1mM。
上述技术方案中，步骤C中优选搅拌时间1h。
上述技术方案中，金属离子储存液为Fe3+储存液时，步骤C中茶多酚-金属纳米粒中Fe3+储存液与EGCG储存液的体积比为1:19～1:199；优选Fe3+储存液与EGCG储存液的体积比为1:99。
上述技术方案中，步骤C中所述水溶性药物为盐酸阿霉素(以下简称DOX)；所述脂溶性姜黄素(以下简称Cur)。
本发明利用EGCG分子与金属离子如Fe3+之间的相互作用形成茶多酚-金属纳米粒，此过程由Fe3+/Fe2+的氧化还原以及Fe的络合作用形成。本发明制备的茶多酚-金属纳米粒可以将化疗药包裹在纳米粒中，形成纳米递送系统用于化疗药的递送。本发明载药纳米粒作为递送系统可将水溶性化疗药DOX(或脂溶性药物Cur)与金属元素Fe同时递送到肿瘤组织并且被肿瘤细胞摄取，在肿瘤弱酸性和高水平谷胱甘肽条件下茶多酚-金属纳米粒结构解聚，释放游离Fe、DOX(或Cur)达到治疗作用。
上述两种产品中，茶多酚-金属纳米粒的制备方法：将EGCG溶于去离子水中，滴加金属离子溶液，边滴加边搅拌，刚加入金属离子溶液时，溶液会由无色立即变为紫色，一段时间后颜色消失，搅拌，离心收集沉淀物，得到茶多酚-金属纳米粒。载药纳米粒制备方法则为：在金属离子储存液滴加到EGCG储存液之前，根据不同载药量而加入不同含量的药物，如DOX、Cur；理论载药量范围为2％～12.5％，试验例制备实理论载药量分别为2％、5％、10％、12.5％。实际载药量(％)＝药物质量/(载体质量+药物质量)×100％；包封率(％)＝理论载药量/实际载药量×100％；充分混匀后，加入金属离子溶液，搅拌，离心去除未被装载的游离药物，得到载药纳米粒。本发明得到的茶多酚-金属纳米粒和载药纳米粒在冻干之后均具有良好的复溶性。
本发明所解决的第五个技术问题是提供该的茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒的医药用途，即的茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒在制备治疗癌症的药物中的应用。特别的，提供了本发明载药纳米粒在制备治疗肺癌的药物中的应用。
本发明茶多酚-金属纳米粒、载药纳米粒及其制备方法和应用与现有技术相比，具有如下优势：
1.本发明基于茶多酚-金属纳米粒的制备工艺，在水溶液中茶多酚与金属通过氧化偶联和络合作用快速形成纳米粒。
2.本发明茶多酚-金属纳米粒的制备工艺绿色环保，条件温和，无有机溶剂等有毒物质的加入，减少对环境的污染，解决了纳米粒后期的处理工艺繁琐、周期长等缺点，有利于工业化生产。
3.本发明茶多酚-金属纳米粒在冻干之后再溶解，展现出良好的复溶性；同时，在储存7天之后，其粒径尺寸没有突变现象出现，表现出长时间的稳定性。
4.本发明所制备的茶多酚-金属纳米粒，通过调节金属离子储存液与EGCG储存液的体积比，得到尺寸可控的纳米粒，范围在几十纳米到几微米，扩展其应用，不仅可以作为药物载体，同时也可以作为支架用于生物医药邻域。
5.本发明茶多酚-金属纳米粒可有效负载亲水和疏水的抗肿瘤药物，具有潜在的抗肿瘤效应。
6.本发明茶多酚-金属纳米粒用于肿瘤药物载体时，能够通过铁死亡和细胞凋亡两种途径诱导肿瘤细胞死亡，进而发挥其抗肿瘤效应。
附图说明
图1透射电镜照片：其中A代表F1的透射电镜照片；B代表F3的透射电镜照片。
图2F3纳米粒与DF3纳米粒复溶图。
图3F3溶血实验图。
图4不同载药量DF3纳米粒的稳定性。
图5不同载药量CF3纳米粒的稳定性。
图6DOX释放曲线图。
图7LL2细胞凋亡图。
图8WB检测蛋白表达图：其中(1)代表空白对照，(2)代表F3，(3)代表DOX，(4)代表ADF3，(5)代表BDF3。
图9荷瘤小鼠肿瘤图。
图10治疗后荷瘤小鼠肿瘤生长曲线图。
图11治疗后荷瘤小鼠体重变化曲线图。
图12体内安全性实验。
具体实施方式
本发明提供了茶多酚-金属纳米粒作为载体递送化疗药阿霉素或姜黄素等药物的抗肿瘤研究。
肿瘤组织特殊的生长形式、代谢途径、营养供应促使肿瘤组织微环境与正常组织显著不同。具体而言，与正常组织和血液的pH相比，肿瘤组织具有较低的pH(5.7-6.8)，谷胱甘肽(以下简称GSH)的浓度(2-10mM)在细胞质中显著高于细胞外(2-10μM)。本发明制备的载药纳米粒在酸性和高水平的GSH下会自动解聚，释放抗癌药物与金属离子，抗癌药物如DOX、姜黄素等进入细胞核诱导肿瘤细胞凋亡，而金属离子Fe3+参与肿瘤细胞铁死亡。
以下实施例及应用例中，表没食子儿茶素没食子酸酯简称EGCG，谷胱甘肽简称GSH，盐酸阿霉素简称DOX，姜黄素简称Cur。
实施例1
本实施例中，制备茶多酚-金属纳米粒，其制备工艺依次如下：
(1)将20mg EGCG溶于10mL去离子水，加热助溶，充分溶解后，配制成浓度为2mg/mL的茶多酚水溶液:
(2)将2.7mg FeCl3·6H2O加入到10mL去离子水中，充分溶解，配制成1mM的FeCl3水溶液：
(3)将步骤(2)中的FeCl3水溶液缓慢滴加至步骤(1)中的茶多酚溶液中，最终使FeCl3水溶液与EGCG储存液的体积比为1:19，边滴加边搅拌，反应1h后，收集产物，8000rpm，4度离心30min，收集沉淀物，得到F1纳米粒(本实施例制备所得茶多酚-金属纳米粒简称F1)。透射电镜照片见图1A。
实施例2
本实施例中，制备茶多酚-金属纳米粒，其制备工艺依次如下：
(1)将20mg EGCG粉末溶于10mL去离子水，加热助溶，充分溶解后，配制成浓度为2mg/mL的茶多酚水溶液：
(2)将2.7mg FeCl3·6H2O加入到10mL去离子水，充分溶解，配制成1mM的FeCl3水溶液；
(3)将步骤(2)中的FeCl3水溶液缓慢滴加至步骤(1)中的茶多酚水溶液中，最终使FeCl3水溶液与EGCG储存液的体积比为1：99，边滴加边搅拌，反应1h后，收集产物，8000rpm，4度离心30min，收集沉淀产物，得到F3纳米粒(本实施例制备所得茶多酚-金属纳米粒简称F3)。透射电镜照片见图1B；冻干粉的复溶性照片见图2，由图2可见该纳米粒具有良好的复溶性。
实施例3
本实施例中，制备DOX载药茶多酚-金属纳米粒，其制备工艺依次如下：
(1)精密称取DOX粉末4.000mg，溶于2mL去离子水中，超声助溶，最终DOX浓度为2mg/mL。
(2)将步骤(1)中DOX溶液缓慢加入到实施例2步骤(1)制备所得茶多酚水溶液中，并持续搅拌，接着加入实施例2步骤(2)准备所得FeCl3水溶液中，使FeCl3水溶液与EGCG储存液的体积比为1：99，DOX的理论载药量为5％，室温下磁力搅拌1h，收集产物，8000rpm，4度离心30min，收集沉淀物，得到载药纳米粒DF3纳米粒(本实施例制备所得载药纳米粒简称DF3)。通过马尔文粒度仪测得的DF3的粒径为110.7±21.8nm，电位为8.50±0.32mV。DF3冻干粉的复溶性照片见图2，由图2可见该冻干粉具有良好的复溶性。
实施例4
本实施例中，制备Cur载药茶多酚-金属纳米粒，其制备工艺依次如下：
(1)精密称取Cur粉末4.000mg，溶于2mL无水乙醇中，超声助溶，最终Cur浓度为2mg/mL。
(2)将步骤(1)中Cur溶液缓慢加入到实施例2步骤(1)制备所得茶多酚水溶液中，并持续搅拌，接着加入实施例2步骤(2)制备所得FeCl3水溶液中，使FeCl3水溶液与EGCG储存液的体积比为1：99，Cur的理论载药量分别为2％、5％、10％、12.5％，室温下搅拌1h，收集产物，8000rpm，4度离心30min，收集沉淀物，得到Cur的载药纳米粒，以下简称CF3纳米粒。
应用例1
按照实施例2方法制备成不同浓度的纳米粒溶液，与2％兔血混合进行溶血实验分析，37度孵育1h后，酶标仪检测混合液在540nm处的吸收值。其中：PBS为磷酸缓冲液(pH7.4)，F3的浓度分别为680μM、510μM、340μM、170μM、85μM、42.5μM、21.2μM。溶血试验见图3，从该实验结果发现当F3的浓度达到340μM时没有溶血现象出现。说明本发明纳米粒具有良好的生物安全性。
应用例2
按照实施例3方法制备的不同载药量DF3纳米粒，理论载药量分别为2％、5％、10％、12.5％。DF3纳米粒经离心，收集上清，检测未被装载的DOX，计算得包封率分别为89.98％、81.47％、80.01％、79.89％。在不同时间点用马尔文粒度仪检测纳米粒的粒径，绘制稳定性曲线图，不同载药量DF3纳米粒的稳定性见图4。结果显示，本发明载药纳米粒具有长时间的储存稳定性。
应用例3
按照实施例4方法制备不同载药量CF3纳米粒，理论载药量分别为2％、5％、10％、12.5％。通过离心纳米粒，收集上清，检测未被装载的Cur，计算得包封率分别为，93.89％、90.02％、88.93％、87.98％。在不同时间点用马尔文粒度仪检测纳米粒的粒径，绘制稳定性曲线图，不同载药量CF3纳米粒的稳定性见图5。结果显示，本发明制备的CF3纳米粒具有长时间的储存稳定性。
应用例4
按照实施例3中制备的DF3纳米粒转移至透析袋中(MWCO＝1000Da)，浸没在释放介质中(pH 5.4/7.4，含或不含10mM GSH)，放置37度摇床，在预定的时间点取样1mL，HPLC检测DOX的累积释放量。DOX释放曲线图见图6，从结果看出，在没有GSH的条件下，两种pH条件下药物的释放相当缓慢，96h时DOX的累积释放不超过20％。当加入GSH后，DOX的释放速率明显加快，尤其是在pH 5.4的条件下。由于肿瘤微环境与正常生理状况的显著差异，pH 7.4和无GSH条件下缓慢释放，有利于保持纳米粒稳定，然而在pH 5.0和GSH条件下高释放率有助于纳米粒在肿瘤微环境中快速释放药物，进而达到抗肿瘤效应。
应用例5
检测按照实施例2和实施例3方法制备的F3和DF3，以及DOX对LL2肺癌细胞凋亡的影响。将1mL含有DOX，F3，ADF3(5％DOX载药量)，BDF3(12.5％DOX载药量)的培养液分别加入到LL2细胞中，培养24h后，胰酶消化，离心收集细胞。按照细胞凋亡试剂盒步骤，用细胞流式仪检测细胞凋亡率。LL2细胞凋亡率见图7，由图可见游离阿霉素诱导细胞凋亡率为27.6％，而DF3组根据载药量不同，细胞凋亡率分别为29.65％，42.7％。高载药量的纳米粒具有显著的细胞凋亡率，以上实验结果表明，F3纳米载体可以有效地将DOX递送至肿瘤细胞并发挥抗肿瘤效应。5％DOX载药量的DF3纳米粒以下称为ADF3，12.5％DOX载药量的DF3纳米粒以下称为BDF3。
应用例6
向LL2细胞中加入含有空白对照组(生理盐水NS)、DOX，F3，ADF3(5％DOX载药量)，BDF3(12.5％DOX载药量)的培养液，培养24h后，刮刀刮下并收集细胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，离心收集上清。BCA试剂盒检测蛋白总量，煮样10min，上样，电泳检测GPX4，xCT以及cleaved caspase 9的表达。WB检测蛋白表达图见图8，结果显示，DF3纳米组可以明显下调铁死亡相关蛋白GPX4，xCT的表达，以及上调凋亡相关蛋白cleaved caspase 9的表达。说明DF3纳米粒可以通过诱导肿瘤细胞凋亡以及铁死亡两种途径发挥抗肿瘤效应。
应用例7
按照实施例3方法制备的纳米粒用于抗体内肿瘤研究。本应用例将荷LL2瘤小鼠随机分为6组(n＝5)，待肿瘤体积生长至100mm3时，分别尾静脉注射生理盐水(NS)、DOX、F3、ADF3(5％DOX载药量)、BDF3(12.5％DOX载药量)，DOX给药剂量为5mg/kg。隔一天给药，给药三次后，监测肿瘤的生长及体重变化，见图9-11，结果显示此纳米粒具有良好的抗肿瘤能力，随着载药量的增加，抗肿瘤能力越强。
应用例8
本应用例将荷LL2瘤小鼠随机分为6组(n＝5)，待肿瘤体积生长至100mm3时，分别尾静脉注射生理盐水(NS)、DOX、F3、ADF3(5％DOX载药量)、BDF3(12.5％DOX载药量)，隔一天给药(每次的注射DOX剂量为5mg/kg)。给药三次后，牺牲小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾，进行切片，H&E染色，显微镜观察拍照，见图12。结果显示，本发明制备的纳米粒没有对主要器官造成损害，可见本发明制备的纳米粒具有良好的体内生物安全性。