具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供前列欣胶囊的应用为如下(a)或(b)：

(a)制备炎症反应抑制剂；

(b)抑制炎症反应。

根据本发明，所述前列欣胶囊具体为前列欣胶囊的正丁醇提取物。

所述前列欣胶囊的正丁醇提取物，其制备方法包括：

取前列欣胶囊粉末，使用乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇味，使用(等体积)正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干即得。

其中，所述乙醇为50-80％乙醇，如50％、60％、70％和80％；

所述前列欣胶囊粉末与乙醇的质量比为1:5～15，如1:5、1:8、1:10、1:12和1:15。通过上述工艺制备得到前列欣胶囊的正丁醇提取物，经检测，其含有没食子酸、咖啡酸、隐丹参酮等十余种药物活性成分，对炎症反应具有良好的抑制作用。需要说明的是，本发明的前列欣胶囊的正丁醇提取物可作为实验模型工具制剂抑制(体外)细胞的炎症反应，从而为炎症相关基础研究(如信号通路、作用靶点)等提供便利。

具体的，本发明的前列欣胶囊的正丁醇提取物对以脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症具有抑制作用，表现为：前列欣胶囊的正丁醇提取物降低细胞上清中相关炎症因子和细胞中相关蛋白的分泌和表达水平；且降低程度呈剂量依赖性。

其中，正丁醇提取物使用剂量控制为10～100μg/mL，包括但不限于12.5、25和50μg/mL。

所述相关炎症因子包括但不限于NO、IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE₂；

所述相关蛋白为NF-κB信号通路相关蛋白，包括但不限于TLR4、COX-2、p-NF-κBp65、p-IKKα/β和iNOS。

本发明的又一具体实施方式中，提供前列欣胶囊在制备炎症反应相关疾病药物中的应用。

其中，所述前列欣胶囊具体为前列欣胶囊的正丁醇提取物；

所述前列欣胶囊的正丁醇提取物，其制备方法包括：

取前列欣胶囊粉末，使用乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇味，使用(等体积)正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干即得。

其中，所述乙醇为50-80％乙醇，如50％、60％、70％和80％；

所述前列欣胶囊粉末与乙醇的质量比为1:5～15，如1:5、1:8、1:10、1:12和1:15。通过上述工艺制备得到前列欣胶囊的正丁醇提取物，经检测，其含有没食子酸、咖啡酸、隐丹参酮等十余种药物活性成分，对炎症反应具有良好的抑制作用。

所述炎症反应相关疾病包括所有与炎症反应相关的疾病或病征，包括但不限于感染性心内膜炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等疾病。

本发明的又一具体实施方式中，提供前列欣胶囊在如下(1)-(4)中的应用：

(1)抑制相关炎症因子分泌和/或表达中的应用；

(2)制备抑制相关炎症因子分泌和/或表达产品中的应用；

(3)抑制相关蛋白分泌和/或表达中的应用；

(4)制备抑制相关蛋白分泌和/或表达中的应用。

其中，所述前列欣胶囊具体为前列欣胶囊的正丁醇提取物；

所述前列欣胶囊的正丁醇提取物，其制备方法包括：

取前列欣胶囊粉末，使用乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇味，使用(等体积)正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干即得。

其中，所述乙醇为50-80％乙醇，如50％、60％、70％和80％。

所述前列欣胶囊粉末与乙醇的质量比为1:5～15，如1:5、1:8、1:10、1:12和1:15。通过上述工艺制备得到前列欣胶囊的正丁醇提取物，经检测，其含有没食子酸，咖啡酸，对香豆酸，木犀草素-7-O-葡萄糖苷，丹酚酸B，丹酚酸A，白当归素，异茴香内酯，氧化前胡素，异欧前胡素，隐丹参酮等十余种药物活性成分，对炎症反应具有良好的抑制作用。

所述相关炎症因子包括但不限于NO、IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE₂；

所述相关蛋白为NF-κB信号通路相关蛋白，包括但不限于TLR4、COX-2、p-NF-κBp65、p-IKKα/β和iNOS。

本发明的第四个方面，提供一种产品，所述产品其活性成分包括上述前列欣胶囊。

其中，所述前列欣胶囊具体为前列欣胶囊的正丁醇提取物。

所述前列欣胶囊的正丁醇提取物，其制备方法包括：

取前列欣胶囊粉末，使用乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇味，使用(等体积)正丁醇进行萃取，萃取液减压浓缩至干即得。

其中，所述乙醇为50-80％乙醇，如50％、60％、70％和80％；

所述前列欣胶囊粉末与乙醇的质量比为1:5～15，如1:5、1:8、1:10、1:12和1:15。

所述产品可以为药物或实验模型工具制剂。

当所述产品为药物时，其还可以含有至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种筛选前列欣胶囊抗炎组分的方法，所述方法包括：将采用不同溶剂提取获得的前列欣胶囊提取物施加至细胞炎症模型中，对细胞炎症模型的炎症反应进行检测。

其中，所述溶剂包括但不限于石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，优选为正丁醇。采用正丁醇提取获得提取物具有最佳的抑制炎症反应效果。

所述细胞炎症模型包括脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1仪器与材料

小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)细胞株购自中国医学科学院基础研究所。

前列欣胶囊(山东宏济堂制药集团股份有限公司提供)，没食子酸，咖啡酸，对香豆酸，木犀草素-7-O-葡萄糖苷，丹酚酸B，丹酚酸A，白当归素，异茴香内酯，氧化前胡素，异欧前胡素，隐丹参酮(含量大于99％，购自上海源叶生物科技有限公司)，脂多糖(美国Sigma公司)，DMEM高糖培养基和PBS(武汉赛维尔生物科技有限公司)；胎牛血清(以色列BiologicalIndustries公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗TLR4单克隆抗体、兔抗COX-2单克隆抗体、兔抗iNOS单克隆抗体、兔抗p-p65单克隆抗体、兔抗p-NF-kBp65单克隆抗体、兔抗p-IKKα/β单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG-HRP)(美国Cell Signaling Technology公司)；ECL化学发光试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠TNF-α/IL-6/IL-1βELISA试剂盒(美国eBscience生物科技有限公司)；PGE₂ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

Agilent高效液相色谱仪(1260型，DAD检测器，美国Agilent公司)；HF90二氧化碳培养箱(上海力升科学仪器有限公司)；Eclipse Ts2倒置显微镜(日本Nikon公司)；HFsafe-1200LC生物安全柜(上海力升科学仪器有限公司)；Spark多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；PowerPac300型电泳仪(美国BIO-RAD公司)；170-3930型转膜仪(美国BIO-RAD公司)；ChemiScope 6000Exp化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)。

2方法

2.1前列欣胶囊正丁醇部位的成分分析

2.1.1测试样品的制备

称取前列欣胶囊粉末50g，用10倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次1h，提取液合并后减压浓缩至无醇味(约200mL)，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。萃取液减压浓缩至干并称重，得到石油醚提取物1.159g、乙酸乙酯提取物2.7913g、正丁醇提取物2.5617g、水层提取物25.98g。

2.1.2色谱条件

色谱柱：YMC Pack ODS-AC₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相选择乙腈(A)-0.5％甲酸水溶液(B)，流速的设置为1.0mL/min；样品的进样量为10μL；检测波长：300nm；柱温：25℃；按照表1的梯度洗脱程序进行洗脱，如下表所示。

表1梯度洗脱程序

2.1.3对照品溶液的制备

对照品溶液制备分别精密称定对照品没食子酸，咖啡酸，对香豆酸，木犀草素-7-O-葡萄糖苷，丹酚酸B，丹酚酸A，白当归素，异茴香内酯，氧化前胡素，异欧前胡素，隐丹参酮适量，加甲醇制备成各成分浓度为0.1g/L的标准品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。照上述的梯度洗脱程序进行洗脱。

2.2细胞培养

液氮中取出冻存的RAW264.7细胞，立刻放入37℃水浴锅中解冻。解冻后离心吸出上清液，移入培养皿中加适量10％FBS高糖培养基，并在5％CO₂、37℃条件下培养。待细胞长至90％，弃去细胞上清液，加入新配置好的含10％血清的高糖培养基，用细胞刮刀刮取细胞，然后用吸管充分吹打皿中细胞，混匀后，吸取上清培养液。移入新的培养皿中，继续培养。

2.3MTT法测试药物的细胞毒性

待细胞密度长满培养皿80％以上，细胞刮刀刮取细胞，吹打均匀，细胞计数，在96孔板中以2*10⁵个/mL的密度种板，每孔加入100μL的高糖培养基，培养24h后，弃去上清液，分别加入配置好的不同浓度样品的细胞培养基(12.5,25,50,100,200μg/mL)100μL，继续培养24h后，加入MTT(5μg/mL)溶液10μL，继续培养4h，弃去上清液后每孔加入100μL的DMSO溶液，震荡混匀，490nm下测定OD值。

2.4一氧化氮含量测定

待细胞密度长满培养皿80％以上，细胞刮刀刮取细胞，吹打均匀，细胞计数，在96孔板中以2×10⁵个/mL的密度种板，每孔加入100μL的高糖培养基，培养24h后，弃去上清液，分别加入配置好含有脂多糖的不同浓度石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物样品的细胞培养基(50μg/mL)100μL，采用咖啡酸(50μg/mL)作为阳性对照药，继续培养24h后，取上清液50μL，采用一氧化氮检测试剂盒测定，震荡混匀，540nm下测定OD值，计算一氧化氮抑制率。

2.5ELISA法测定IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE₂的含量

将RAW264.7细胞按5×10⁴/孔接种于48孔细胞培养板中，培养箱中培养过夜，弃上清，分别加入配置好的不同浓度样品和咖啡酸的细胞培养基(12.5,25,50μg/mL)100μL，继续培养24h后，设正常细胞对照组和模型细胞对照组。每个浓度设5个复孔。刺激24h后收获细胞上清液，-20℃保存。按小鼠IL-6，IL-1β、TNF-α和PGE₂的ELISA检测试剂盒测定。

2.6Western Blot检测iNOS/COX-2/TLR4/p-NF-κB p65/p-IKKα/β蛋白的表达

将RAW264.7细胞按5×10⁴/孔接种于6孔细胞培养板中，按照2.5的加样步骤，刺激24h后，使用PBS分别清洗各组细胞3次，然后分别向其中加入适量的裂解液，再将其置于冰上裂解半小时，多次吹打并将其转移至1.5mL的离心管中，4℃温度下12000r/min离心15min。提取其中的上清，分装进新的离心管中，加入上样缓冲液100℃变性5min。根据蛋白定量的结果上样电泳。经过SDS-PAGE电泳后，使用半干转转膜至PVDF膜，封闭后加入一抗4℃过夜，使用TBST洗涤3遍，每次时间为10min，再加入HRP标记过的羊抗兔二抗。配制化学发光液，将膜放在曝光板上，膜上滴适量的发光液，应用全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统曝光分析图片。

3结果

3.1前列欣正丁醇部位(QLXB)的成分分析

对前列欣正丁醇部位的色谱分析结果表明，上述11种成分在正丁醇部位中均可被检测得到，具有较好的分离度，且其中没食子酸、咖啡酸、隐丹参酮等含量均较高。

3.2QLXB对细胞活力的影响

细胞活力实验是评价药物对细胞毒性的重要依据。以空白组的细胞存活率为100％作为对照，分别检测前列欣胶囊正丁醇提取部位在0-100μg/mL的剂量下的细胞存活率。如图3所示，在0-25μg/mL的剂量下，细胞存活力均在100％以上，然而随着QLXB浓度的增加，RAW264.7细胞存活率逐渐下降，其中在50μg/mL剂量下，细胞活力为90％左右，也具有较好的细胞活力。然而，在100μg/mL上，细胞活力显著下降，表明此浓度会导致细胞损伤，具有细胞毒性。因此，在50μg/mL剂量下可研究前列欣胶囊正丁醇部位的安全剂量范围。

3.3QLXB对RAW264.7巨噬细胞NO生成量的影响

RAW264.7巨噬细胞在脂多糖的诱导下可以产生大量的一氧化氮，同时一氧化氮又可以影响其它炎症因子的合成与释放。如图2和4中所示，与空白组相比，LPS组的一氧化氮含量显著升高(p<0.05)，前列欣正丁醇部位具有最强的抗炎活性。加入前列欣胶囊正丁醇部位后，各组对RAW264.7巨噬细胞一氧化氮含量具有显著的抑制作用(p<0.05)，在50μg/mL的剂量下，一氧化氮的生成抑制率达到67.12％以上，抑制效果显著，与阳性药咖啡酸抑制效果较为一致。

3.4QLXB对RAW264.7巨噬细胞产生的炎症因子的影响

巨噬细胞在脂多糖的刺激下分泌大量的促炎因子(如IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α等)，其中TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，IL-1β、IL-6和PGE₂参与多种炎症疾病的发生发展过程，是炎性反应的促发剂。如图5所示，给予LPS刺激后，模型组中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE₂生成量显著增加(p<0.05)，QLXB组对RAW264.7巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE₂的分泌具有显著的抑制作用(p<0.05)，且呈现剂量依赖性关系。QLXB组在高浓度下，对炎症因子的抑制作用与咖啡酸(50μg/mL)的效果较为一致，这些结果表明QLXB能够抑制炎症介质的产生和炎症反应的进程。

3.5QLXB对iNOS/COX-2/TLR4/p-NF-κΒp65/p-IKKα/β蛋白的表达影响

在LPS诱导的RAW264.7细胞模型中，iNOS和COX-2是多种炎症介质释放的关键限速酶；Toll样受体中TLR4可以特异性识别脂多糖，p-NF-κΒp65/p-IKKα/β是NF-κΒ通路中的关键蛋白。因此，上述蛋白的表达在炎症中具有重要作用。如图6所示，Western blot对上述蛋白表达水平的检测结果表明，与空白组相比，iNOS/COX-2/TLR4/p-NF-κΒp65/p-IKKα/β蛋白在模型组细胞中的表达水平显著增加；QLXB不同剂量组可显著抑制上述蛋白的表达，且具有显著的剂量依赖性。

综上所述，实验结果表明前列欣胶囊正丁醇部位具有显著的抗炎作用，能显著抑制LPS导致的巨噬细胞释放促炎因子及炎症介质，且其作用机制与抑制NF-κB通路的激活密切相关，这些为前列欣胶囊的临床药效提供了实验基础。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。