阅读说明：本技术 一种基于光催化的无标记电化学生物传感器检测溶菌酶的新方法 (A kind of new method based on light-catalysed unmarked electrochemica biological sensor detection lysozyme ) 是由 许淑霞 唐刚旭 秦晓娇 张信凤 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：建立了一种无标记、选择性好、特异性强、灵敏高的检测溶菌酶的电化学新方法,通过先把带巯基的捕捉链DNA通过硫金键结合在金电极上,然后将适配体链DNA与捕捉链DNA通过碱基互补配对形成双链,在溶菌酶存在的情况下,溶菌酶与适配体链DNA结合后形成G-四连体,从而使适配体链DNA从双链中解链掉离。电极中余下的单链吸附在GO上,因为GO与碱基都有共同的六边形结构,它们能形成π结构的堆叠反应。最后将PB吸附到GO上,因为PB能通过π-π键吸附到GO的表面,在绿光LED灯照射下,PB吸收能量,继而传递给溶液中的溶解氧产生<Sup>1</Sup>O<Sub>2</Sub>,<Sup>1</Sup>O<Sub>2</Sub>可导致电极表面的DNA单链的断裂,使电极表面对[Fe(CN)<Sub>6</Sub>]<Sup>3-/4-</Sup>的排斥减小,造成传质阻力减少,从而使电化学阻抗信号减小；当没有目标链存在时,[Fe(CN)<Sub>6</Sub>]<Sup>3-/4-</Sup>电化学阻抗信号无明显降低,基于此,可实现对溶菌酶的无标记检测。(Establish the electrochemistry new method of unmarked one kind, selectively good, high specificity, sensitive high detection lysozyme, the capture chain DNA with sulfydryl is incorporated on gold electrode by sulphur gold key by elder generation, then aptamers chain DNA and capture chain DNA are formed into double-strand by base pair complementarity, in the presence of lysozyme, lysozyme in conjunction with aptamers chain DNA after formed G- tetrad, so that the unwinding from double-strand of aptamers chain DNA be made to drop off.In electrode it is remaining it is single-stranded be adsorbed on GO because GO and base have common hexagonal structure, they can be formed π structure stacking reaction.Finally PB is adsorbed on GO, because PB can be adsorbed onto the surface of GO by pi-pi bond, under green light LED light irradiation, PB absorbs energy, and the dissolved oxygen then passed in solution generates 1 O 2 , 1 O 2 The mono- chain break of DNA that can lead to electrode surface, makes electrode surface to [Fe (CN) 6 ] 3‑/4‑ Repulsion reduce, cause resistance to mass tranfer to reduce, thus make electrochemical impedance signal reduce；In the presence of there is no object chain, [Fe (CN) 6 ] 3‑/4‑ Electrochemical impedance signal is without being substantially reduced, based on this, it can be achieved that markless detection to lysozyme.)

一种基于光催化的无标记电化学生物传感器检测溶菌酶的新 方法

技术领域

本发明涉及一种基于光催化无标记的电化学生物传感器检测溶菌酶的新方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

溶菌酶普遍存在于动植物和微生物中，它是一种能溶解细菌细胞壁的酶，其被广泛应用于生物工程，医疗诊断和食品防腐中。由于溶菌酶在医疗检测方面的重要性，故发展了很多方法来测定其含量，如比色法、琼脂糖火箭电泳法、平板扩散法、紫外分光光度法、高效液相色谱法和电化学法等。但是比色法、琼脂糖火箭电泳法、平板扩散法需要培养细菌，过程繁琐；紫外分光光度法不需要培养细菌，过程相对简单、检测结果稳定可靠；高效液相色谱法分离效能高、重现性好，但分离样品的时间长、且仪器价格昂贵。相比之下，电化学检测法由于灵敏度高、成本低而被广泛应用于溶菌酶含量的检测。由于溶菌酶的测定对于临床诊断以及其它方面的研究具有重要的意义，因此，设计出一种高效灵敏、特异性好、精密度高的检测方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于利用纳米材料氧化石墨烯(GO)的特性，将荧光桃红(PB)的光催化反应与电化学方法相结合，设计了光催化电化学生物传感方法来检测尿液中的溶菌酶，该方法无需额外标记、方法简单、同时GO具有放大信号的作用，能大大提高灵敏度。

本发明的技术方案如下：

(1)将金电极打磨平整并清洁后滴涂4μM捕捉链DNA孵育一个小时；

(2)在(1)所述的电极表面滴涂1μM适配体链DNA溶液继续孵育两个小时；

(3)将(2)所述的电极浸入100nM溶菌酶溶液中继续孵育半个小时；

(4)将(3)所述的电极浸入100μg/mL GO溶液中孵育半个小时；

(5)将(4)所述的电极浸入100nM PB溶液继续孵育15分钟后，在室温下用LED绿灯光照15min，并用电化学工作站以电化学阻抗谱(EIS)法检测电化学信号，分析测定结果。

发明效果

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)实验过程简单、成本低、无需标记技术；

(2)与目前无标记的电化学传感器相比，本方法的检出限低1-2个数量级；

(3)灵敏度高，并可特异性识别溶菌酶，避免假阳信号的产生；

(4)通过改变适配体链DNA的序列可实现对不同种类蛋白质或者酶的识别。

具体实施方式

实施例1

将金电极打磨清洁后滴涂捕捉链DNA孵育一个小时后，滴涂1μM适配体链DNA溶液继续孵育两个小时；将制备好的电极浸入实际人尿液样品(尿液用离心机以转速8000转/分离心5分钟进行预处理，加入溶菌酶10nM)中继续孵育半个小时；再滴加100μg/mL GO溶液和100nM PB溶液分别孵育半个小时和15分钟后，在室温下用LED绿灯光照15min，并用电化学工作站以EIS法检测电化学信号，分析测定结果。

实施例2

将金电极打磨清洁后滴涂捕捉链DNA孵育一个小时后，滴涂1μM适配体链DNA溶液继续孵育两个小时；将制备好的电极浸入实际人尿液样品(尿液用离心机以转速8000转/分离心5分钟进行预处理，加入溶菌酶1nM)中继续孵育半个小时；再滴加100μg/mL GO溶液和100nM PB溶液分别孵育半个小时和15分钟后，在室温下用LED绿灯光照15min，并用电化学工作站以EIS法检测电化学信号，分析测定结果。

实施例3

将金电极打磨清洁后滴涂捕捉链DNA孵育一个小时后，滴涂1μM适配体链DNA溶液继续孵育两个小时；将制备好的电极浸入实际人尿液样品(尿液用离心机以转速8000转/分离心5分钟进行预处理，加入溶菌酶0.1nM)中继续孵育半个小时；再滴加100μg/mL GO溶液和100nM PB溶液分别孵育半个小时和15分钟后，在室温下用LED绿灯光照15min，并用电化学工作站以EIS法检测电化学信号，分析测定结果。

通过实际样品分析，对电化学光催化生物传感器检测溶菌酶的可行性进行了评估。对三个尿液品中溶菌酶进行检测，均未检出溶菌酶，然后进行了加标实验，加标浓度分别为10nM、1nM和0.1nM，结果显示三个实际人尿液样品的溶菌酶回收率良好。结果见表1。

表1尿液中加标样品的检测

样品	溶菌酶加标量(nM)	测定值(nM)	回收率(％)	相对标准偏差(％)
					1	10.00	9.5±1.9	95	2.1
2	1.00	1.0±0.017	101.1	1.7
					3	0.10	0.091±0.0028	91	2.8