阅读说明：本技术 一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法 (method for rapidly breeding floral leaf illicium verum discs through tissue culture ) 是由 李秋静 林丹 卿霞 周天宇 唐忠炳 张文昊 庞玉华 秦祥 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法,包括：(1)无菌材料的获得；(2)芽的分化和增殖；(3)生根培养；(4)炼苗与移栽。与现有技术相比,本发明采用组培快速繁育的方法,可以在短时间内获得大量株型整齐,性状优良的植株,以满足市场的大量需求。(The invention relates to a method for quickly breeding a floral leaf illicium verum disc by tissue culture, which comprises the following steps: (1) obtaining a sterile material; (2) differentiation and proliferation of shoots; (3) rooting culture; (4) hardening and transplanting the seedlings. Compared with the prior art, the invention adopts a tissue culture rapid breeding method, can obtain a large number of plants with regular plant types and excellent properties in a short time, so as to meet a large number of demands of the market.)

一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法

技术领域

本发明涉及一种植物组培繁育方法，尤其是涉及一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法。

背景技术

花叶八角金盘(学名：Fatsia japonica‘Variegata’)为五加科八角金盘属常绿灌木或小乔木植物，株高可达5米。光滑无刺。叶柄长10-30cm；叶片大，革质，近圆形，叶面有黄色或者白色斑点，直径12-30厘米，掌状7-9深裂，裂片长椭圆状卵形，先端短渐尖，基部心形。圆锥花序顶生，长20-40厘米；伞形花序直径3-5厘米，花序轴被褐色绒毛；花萼近全缘，无毛；花瓣5，卵状三角形，长2.5-3毫米，黄白色，无毛；雄蕊5，花丝与花瓣等长；子房下位，5室，每室有1胚球；花柱5，分离；花盘凸起半圆形。果实近球形，直径5毫米，熟时黑色。花期10-11月，果熟期翌年4月。

花叶八角金盘为八角金盘的一种特殊品种，龙五加科八角金盘属的常绿灌木或小乔木，观叶，常绿，叶形优美，浓绿光亮，是深受欢迎的室内外观叶植物。花叶八角金盘耐荫性强，颜色亮丽，在园林景观配置和室内盆栽观赏等方面有较多应用，市场需求量大。花叶八角金盘采用扦插等繁殖方式，繁殖系数和成活率都很低。采用组培快速繁育的方法，可以在短时间内获得大量株型整齐，性状优良的植株，以满足市场的大量需求。

中国专利CN102239805A公开了一种莺尾的组培快繁方法，包括：步骤一：培养基的配制，包括基本培养基；芽诱导培养基；继代增殖培养基；壮苗培养基；生根培养基；步骤二：莺尾脱毒组培苗的培养，包括外植体的选择与灭菌；芽诱导培养；芽增殖培养；壮苗培养；生根培养；步骤三：组培苗的炼苗与移栽，包括炼苗；移栽与培养。该方法通过对培养基激素种类、含量的调整与添加抗生素等技术手段，显著降低了莺尾外植体的污染率，使接种成活率达到90％以上，也明显提高了外植体的诱导分化率，由已有技术的70-80％上升到90％，且提高了莺尾组培的壮苗率。

中国专利CN109588318A涉及一种组织培养快速繁育朱蕉的方法，包括(1)无菌材料的获得；(2)芽的分化和增殖；(3)生根培养；(4)炼苗与移栽。该方法可以在短时间内获得大量株型整齐，性状优良的植株，以满足市场的大量需求。其材料类别选择植物茎尖，培养条件为：茎尖诱导培养基：大量元素+铁盐+肌醇+有机+微量元素+6-BA2.0+NAA0.2；不定芽增殖培养基：大量元素+铁盐+肌醇+有机+微量元素+6-BA0.2+NAA0.1；生根培养基：大量元素+铁盐+肌醇+有机+微量元素+NAA0.1。

《新疆农业科技》2009年第五期的一篇文章“八角金盘的组织培养研究”(作者依巴代提﹒阿外都、嵇云、许辉、宋峰，曹叶飞，来自乌鲁木齐市燕儿窝风景区管理站、新疆曦煜工程设计咨询有限公司)介绍了八角金盘的组织培养和快速繁殖方法，培养条件以MS为基本培养基。(1)芽诱导培养基:MS+TDZ 1mg·L～(-1)(单位下同)+NAA0.1；(2)继代增殖培养基:MS+6-BA1.5+NAA0.1；(3)生根培养基:MS+NAA0.2+IBA0.3。培养温度为(25±1)℃，光照度2000-2500Lx，光照14h/d。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法，包括以下步骤：

(1)无菌材料的获得

在春季3月采集花叶八角金盘母本上带顶芽的幼嫩茎段，洗涤干净后，用75％的酒精和1‰氯化汞相继浸泡，无菌水冲洗，将顶芽切成小段，接种于顶芽诱导培养基上；

(2)芽的分化和增殖

小芽接种于顶芽诱导培养基上15天后，小芽基部开始膨大，25天可见明显的愈伤组织，培养30天，切带小芽的愈伤组织放入不定芽增殖培养基培养；

(3)生根培养

取不定芽增殖培养基中幼苗，切取生长健壮的小植株，转接入生根培养基中诱导生根，25天后幼苗基部分化出许多白色的根原基，35天后长至2-3.5cm，生根率为95％；

(4)炼苗与移栽

根系长至2-3cm时，选择根系发达生长健壮的无菌苗，在温度15℃、自然光照和湿度的室内放置一周后，取出小苗洗净根部琼脂，移栽到苗床上，种好的小苗浇透水，大棚每天要打开，保持足够通风，注意土壤干时适当浇水，移栽成活率可达95％。

步骤(1)中，选择品种纯正、植株粗壮、长势良好、无病虫害的优良花叶八角金盘植株作为母体。

步骤(1)中，洗涤的方法为：将采集的外植体在流水下进行冲洗，清洁外植体表面的灰尘，冲洗时间为10min；再用肥皂水进行洗涤15min，洗涤时晃动瓶子，使外植体充分接触肥皂水；洗涤完成后用流水冲洗干净。

步骤(1)中，所述顶芽诱导培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、6-BA、NAA，

所述大量元素含量为0.4423g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、6-BA含量为3.0mg/L、NAA含量为0.1mg/L。

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述顶芽诱导培养基pH为5.8，所述顶芽诱导培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述顶芽诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为1800-2200，优选为2000Lx。

步骤(2)中，所述不定芽增殖培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、6-BA、NAA，

所述大量元素含量为0.4423g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、6-BA含量为1.5mg/L、NAA含量为0.1mg/L，

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述不定芽增殖培养基pH为5.8，所述不定芽增殖培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述不定芽诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为1800-2200，优选为2000Lx。

步骤(3)中，所述生根培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、IBA、NAA，

所述大量元素含量为0.2212g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、IBA含量为3.0mg/L、NAA含量为0.3mg/L；

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述生根培养基pH为5.8，所述生根培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述生根诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为1800-2200，优选为2000Lx。

步骤(4)中，苗床上的基质为草炭与珍珠岩体积比1:1的混合物，

基质搅拌均匀后平铺在苗床，平铺厚度为20cm左右，铺好的基质上撒上500倍液的敌磺钠药水消毒。

步骤(4)中，移植时用工具插孔，然后用镊子将小苗舒展根系后植入，种植深度以基质盖住幼苗基部不露根为宜。

步骤(4)中，由于下雨天土壤潮湿，小苗容易发霉死亡，所以每星期要打一次药水，多菌灵和陶氏益农-大生M45交替使用，以防止出现抗药性，晴天酌情减少次数。

本发明所提供的植物组织培养快速繁育的方法，尤其适应于繁育花叶八角金盘品种。

由于繁育的植物不同，不同植物培养对于组织培养条件不同，对于培养基的要求不同，因此，如中国专利CN109588318A涉及的组织培养快速繁育朱蕉的方法并不适用于本申请的花叶八角金盘，针对于花叶八角金盘的培养，本申请进行培养条件的改变，尤其是对于培养基中元素配比进行研究，找出最适于花叶八角金盘培养的培养基组成。

与背景技术中“八角金盘的组织培养研究”相比，本申请中增殖培养基和生根培养基不同，用量更精准；环境条件不同，pH值准确到5.8，所述生根培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，温度范围缩小到21-23℃，给出了光照条件为2000Lx左右。培养出来的花叶八角金盘小苗健壮，移栽成活率95％。

本发明采用组培快速繁育的方法，可以在短时间内获得大量株型整齐，性状优良的植株，以满足市场的大量需求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

一种组织培养快速繁育花叶八角金盘的方法，包括以下步骤：

(1)无菌材料的获得

在春季3月采集花叶八角金盘母本上带顶芽的幼嫩茎段，洗涤干净后，用75％的酒精和1‰氯化汞相继浸泡，无菌水冲洗，将顶芽切成小段，接种于顶芽诱导培养基上；

(2)芽的分化和增殖

小芽接种于顶芽诱导培养基上15天后，小芽基部开始膨大，25天可见明显的愈伤组织，培养30天，切带小芽的愈伤组织放入不定芽增殖培养基培养；

(3)生根培养

取不定芽增殖培养基中幼苗，切取生长健壮的小植株，转接入生根培养基中诱导生根，25天后幼苗基部分化出许多白色的根原基，35天后长至2-3.5cm，生根率为95％；

(4)炼苗与移栽

根系长至2-3cm时，选择根系发达生长健壮的无菌苗，在温度15℃、自然光照和湿度的室内放置一周后，取出小苗洗净根部琼脂，移栽到苗床上，种好的小苗浇透水，大棚每天要打开，保持足够通风，注意土壤干时适当浇水，移栽成活率可达95％。

步骤(1)中，选择品种纯正、植株粗壮、长势良好、无病虫害的优良植株为花叶八角金盘母体。

步骤(1)中，洗涤的方法为：将采集的外植体在流水下进行冲洗，清洁外植体表面的灰尘，冲洗时间为10min；再用肥皂水进行洗涤15min，洗涤时晃动瓶子，使外植体充分接触肥皂水；洗涤完成后用流水冲洗干净。

步骤(1)中，所述顶芽诱导培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、6-BA、NAA，

所述大量元素含量为0.4423g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、6-BA含量为3.0mg/L、NAA含量为0.1mg/L。

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述顶芽诱导培养基pH为5.8，所述顶芽诱导培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述顶芽诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为2000Lx。

步骤(2)中，所述不定芽增殖培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、6-BA、NAA，

所述大量元素含量为0.4423g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、6-BA含量为1.5mg/L、NAA含量为0.1mg/L，

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述不定芽增殖培养基pH为5.8，所述不定芽增殖培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述不定芽诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为2000Lx。

步骤(3)中，所述生根培养基含有大量元素、铁盐、肌醇、有机物质、微量元素、IBA、NAA，

所述大量元素含量为0.2212g/L、铁盐含量为0.0651g/L、肌醇含量为0.01g/L、有机物质含量为0.031g/L、微量元素含量为0.2708g/1000L、IBA含量为3.0mg/L、NAA含量为0.3mg/L；

所述大量元素包括以下物质中的一种或几种：KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄、CaCl₂、KH₂PO₄；所述铁盐是FeSO₄·7H₂O；所述有机物质包括以下物质中的一种或几种：盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸；所述微量元素包括以下物质中的一种或几种：MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·5H₂O；

所述生根培养基pH为5.8，所述生根培养基中加入蔗糖30g/L，加入琼脂3g/L，所述生根诱导培养基培养温度为21-23℃，光照为2000Lx。

步骤(4)中，苗床上的基质为草炭与珍珠岩体积比1:1的混合物，

基质搅拌均匀后平铺在苗床，平铺厚度为20cm左右，铺好的基质上撒上500倍液的敌磺钠药水消毒。

步骤(4)中，移植时用工具插孔，然后用镊子将小苗舒展根系后植入，种植深度以基质盖住幼苗基部不露根为宜。

步骤(4)中，由于下雨天土壤潮湿，小苗容易发霉死亡，所以每星期要打一次药水，多菌灵和陶氏益农-大生M45交替使用，以防止出现抗药性，晴天酌情减少次数。

本发明所提供的植物组织培养快速繁育的方法，尤其适应于繁育花叶八角金盘品种。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。