阅读说明：本技术 一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法 (Method for preparing glycitein by taking bean umbilicus as raw material ) 是由 刘汝萃 鲁绪强 韩亮 刘代成 董欣伟 时玉强 崔玉涛 刘杰 于 2019-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法,包括如下步骤：将80-100目豆脐粉在55-65％的乙醇中提取45-60min,每100g豆脐粉中加入乙醇溶液的体积为500-600ml,得提取液,将提取液蒸干,得干渣；向干渣中加入正己烷提取后,弃正己烷上清液,得渣；向渣中加入乙酸乙酯萃取,经离心得上清液,将上清液蒸干,得黄豆黄素。对豆脐粉用特定的工艺进行提取时,可以提取得到单一成分的异黄酮-黄豆黄素,经过正己烷除脂和经乙酸乙酯除杂后,得到黄豆黄素纯品。该方法简单、快速、成本低,可以适用于工业生产。(the invention discloses a method for preparing glycitein by taking bean umbilicus as a raw material, which comprises the following steps: extracting 80-100 mesh bean navel powder in 55-65% ethanol for 45-60min, adding ethanol solution with volume of 500-600ml into per 100g bean navel powder to obtain extractive solution, and evaporating to dry to obtain dry residue; adding n-hexane into the dry residue, extracting, and removing the n-hexane supernatant to obtain residue; adding ethyl acetate into the residue, extracting, centrifuging to obtain supernatant, and evaporating the supernatant to dryness to obtain glycitein. When the soybean navel powder is extracted by a specific process, isoflavone, glycitein, with a single component can be extracted, and a pure glycitein product is obtained after n-hexane degreasing and ethyl acetate impurity removal. The method is simple, rapid, low in cost and suitable for industrial production.)

一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法

技术领域

本发明具体涉及一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

大豆是我国的传统食品，含有大量的生理活性物质，包括低聚糖类、磷脂、维生素类、异黄酮和大豆皂苷等，随着对大豆功能性成分的研究不断深入，大豆的综合开发利用也越来越受到世界各国的关注。大豆的豆脐也称为胚芽，是大豆种子的重要组成部分。大豆胚芽中含有28％蛋白质，8.7％脂肪(其中的不饱和脂肪酸含量高达80％，如亚油酸、亚麻酸和油酸等)，大量维生素E，1.4-1.76％大豆异黄酮以及0.4％左右的甾醇。而大豆子叶中的异黄酮含量为0.15-0.32％，种皮中为0.01％-0.02％，所以，大豆中的异黄酮主要富集在胚芽中。所以胚芽可以用于制备大豆异黄酮。

发明人经过研究发现，由于大豆异黄酮中的各个成分有共同的基本结构，各种成分之间的结构和性质差异小，似乎共生共存、难以分离。而且豆脐中的油脂种类较多，不易与弱极性的大豆异黄酮分离。文献报道的初步提取方法主要有碱提取酸沉淀法、有机溶剂提取法和二氧化碳超临界萃取，较为常用的为溶剂提取法。溶剂提取法所采用的溶剂有乙醇、甲醇、丙酮和弱碱性水溶液，提取物中包括异黄酮的各个成分，且还含有油脂、蛋白质、纤维素、单糖和多糖等杂质。且现有技术中有采用正己烷或石油醚或6#汽油作为溶剂脱除豆粕、大豆中的油脂时，提取的油脂中没有检测到大豆异黄酮。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的一个目的是提供一种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法，包括如下步骤：

将80-100目豆脐粉在55-65％的乙醇中提取45-60min，每100g豆脐粉中加入乙醇溶液的体积为500-600ml，得提取液，将提取液蒸干，得干渣；

向干渣中加入正己烷提取后，弃正己烷上清液，得渣；

向渣中加入乙酸乙酯萃取，经离心得上清液，将上清液蒸干，得黄豆黄素。

发明人在试验中意外发现，当采用55-65％(体积分数)的乙醇对豆脐粉提取45-60min时，可以提取到单一成分的异黄酮-黄豆黄素，如果乙醇的浓度偏离该范围(小于或大于该范围)或乙醇的体积偏离该范围(小于或大于该范围)或提取的时间偏离该范围(小于或大于该范围)，提取液中都是异黄酮的复合物，而非单一成分的异黄酮-黄豆黄素。

由于提取液中还有部分油脂、盐、半胱氨酸和多肽等成分，经过正己烷提取后，可以除去其中的油脂，而经过乙酸乙酯选择性萃取后，可以除去黄豆黄素中的盐、半胱氨酸和多肽等成分，得到纯品黄豆黄素。

在一些实施例中，每100g豆脐粉制备的干渣中加入15-20ml正己烷进行除油脂。

正己烷的量加入过少，会导致油脂无法完全除去，正己烷的量加入过多时，容易造成正己烷的浪费。

进一步的，加入正己烷后提取的时间为10-20min。

更进一步的，将正己烷提取后的体系离心分离后，弃去正己烷上清液，离心的转速为1000-1500r/min，离心的时间为5-10min。离心分离更容易实现正己烷上清液与固体的分离，避免弃去上清液时，造成固体的损失。

在一些实施例中，乙酸乙酯萃取的时间为10-20min。

本发明的第二个目的是提供第二种以豆脐为原料制备黄豆黄素的方法，包括如下步骤：

向豆脐粉中加入正己烷，搅拌提取，得提取液，将提取液蒸干，得豆脐油；

向豆脐油中加入无水乙醇，无水乙醇的体积与豆脐油的体积比为9-15:1，提取0.5-1h，静置分层，取上层溶液，旋蒸，得膏状物；

向膏状物中加入无水乙醇提取，取上清液，将上清液蒸干后得黄豆黄素。

在采用正己烷对豆脐粉进行提取之前，发明人为了验证现有技术，采用正己烷或石油醚或6#汽油对豆粕、大豆及大豆油脚进行提取，并检测提取液中并没有大豆异黄酮的存在。发明人又尝试将正己烷、石油醚或6#汽油对豆脐进行提取，结果意外发现，当提取溶剂为正己烷时，提取液中含有少量的黄豆黄素，但并不含有其他的大豆异黄酮。可能是豆脐中的油脂对黄豆黄素在正己烷中的溶解起到了促进作用。

为了进一步分离提取物中的油脂和黄豆黄素，制备黄豆黄素纯品，发明人进行了一系列的试验，发现，当向制得的豆脐油中加入无水乙醇时，且无水乙醇的体积与豆脐油的体积比为9-15:1，提取0.5-1h，可以选择性萃取豆脐油中的黄豆黄素，进一步纯化，即可得到黄豆黄素纯品。

在一些实施例中，采用正己烷对豆脐粉重复萃取5-8次，每次萃取时，正己烷与豆脐粉的用量比为：1.5-3：1，V/M。

由于正己烷单次对豆脐中黄豆黄素的萃取量较低，所以需要对豆脐粉进行重复提取，以尽量完全提取豆脐粉中的黄豆黄素，当每次提取正己烷与豆脐粉的用量比为：1.5-3：1，V/M时，可以选择性提取豆脐中的黄豆黄素，试验发现，正己烷的量过大或过小都不利于选择性提取黄豆黄素。

进一步的，每次正己烷对豆脐粉提取的时间为1-1.5h，提取的温度为15-30℃。

在一些实施例中，豆脐油与加入其中的无水乙醇的体积比为1：8-12。

在一些实施例中，所述膏状物与无水乙醇的质量比为100倍。

本发明的有益技术效果为：

发明人意外发现，对豆脐粉用特定的工艺(特定浓度的乙醇提取，正己烷除脂，乙酸乙酯除杂；或特定体积比的正己烷提取，无水乙醇除杂)进行提取时，可以提取得到单一成分的异黄酮-黄豆黄素，经过除脂和除杂后，得到黄豆黄素纯品。该方法简单、快速、成本低，可以适用于工业生产。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为黄豆黄苷、染料木苷和大豆苷的薄层分离3D扫描图；

图2为实施例1制备得到的产品的薄层展开扫描峰图。

图3为黄豆黄素标准品溶液的薄层展开扫描峰图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

实施例1

取80～100目豆脐粉100g加60％乙醇550mL，50℃搅拌萃取1h，过滤液400mL旋蒸至干物质为2g。向干物质中加正己烷20mL，摇动提取10min，1000～1500r/min离心5min，弃去上清，得渣。向渣中加入乙酸乙酯20mL,摇动提取15min，1000～1500r/min离心10min，得上清，经旋蒸除去乙酸乙酯得10.7mg黄豆黄素，黄豆黄素的纯度为88％。

实施例2

取80～100目豆脐粉100g加55％乙醇600mL，60℃搅拌萃取1h，过滤液450mL旋蒸至干物质为1.5g。向干物质中加正己烷15mL，摇动提取20min，1000～1500r/min离心10min，弃去上清，得渣。向渣中加入乙酸乙酯15mL,摇动提取20min，1000～1500r/min离心5min，得上清，经旋蒸除去乙酸乙酯得11mg黄豆黄素，黄豆黄素的纯度为90％。

实施例3

取80～100目豆脐粉100g加65％乙醇500mL，55℃搅拌萃取45分钟，过滤液350mL旋蒸至干物质为2g。向干物质中加正己烷20mL，摇动提取15min，1000～1500r/min离心8min，弃去上清，得渣。向渣中加入乙酸乙酯20mL,摇动提取20min，1000～1500r/min离心8min，得上清，经旋蒸除去乙酸乙酯得10.4mg黄豆黄素，黄豆黄素的纯度为88％。

对比例1

与实施例1的区别为：豆脐粉的粒径为60-75目，其他与实施例1相同。制备得到的黄豆黄素的质量为7.6mg。

对比例2

与实施例1的区别为：豆脐粉的粒径为110-120目，其他与实施例1相同。产品中脂肪素酸多，亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸及多肽杂质升高，黄豆黄素的纯度为63％。

对比例3

与实施例1的区别为：乙醇的浓度为50％，其他与实施例1相同。提取的产品中含有黄豆黄苷。

对比例4

与实施例1的区别为：乙醇的浓度为70％，其他与实施例1相同。本浓度提取的产品有较多甘油三酯等杂质，黄豆黄素的纯度为65％。

对比例5

与实施例1的区别为：加入的乙醇的体积为450ml，其他与实施例1相同。黄豆黄素产品中含有的氨基酸和多肽杂质多，黄豆黄素的纯度为54％。

对比例6

与实施例1的区别为：加入的乙醇的体积为600ml，其他与实施例1相同。油脂和小肽及脂肪酸杂质多，黄豆黄素的纯度为56％。

实施例4

取经磨细(80目)的大豆豆脐粉110g，加入正己烷300mL，室温下搅拌提取1h，静止后倒出上清150mL，再加入150mL正己烷室温下搅拌提取1h，静止后倒出上清150mL。如此再重复3次，共提5次。将上清液合并旋转蒸发除去正己烷，得豆脐油218mL。

向18mL豆脐油中加入无水乙醇200mL，搅拌提取1h，静止后倒出乙醇提取液(其他油脂在下)，旋转蒸发除去乙醇，得少量膏状物(约＜0.1g)。

向膏状物中加入10mL无水乙醇，摇动提取12min，倒出乙醇上清液(弃去贴在瓶底部的油脂)，旋转蒸发干，经检测黄豆黄素为19.88mg(可作为大豆异黄酮检测用标准品)，黄豆黄素的纯度为90.4％。

实施例5

取经磨细(80目)的大豆豆脐粉110g，加入正己烷250mL，室温下搅拌提取1.5h，静止后倒出上清150mL，再加入150mL正己烷室温下搅拌提取1.5h，静止后倒出上清150mL。如此再重复5次，共提7次。将上清液合并旋转蒸发除去正己烷，得豆脐油21mL。

向21mL豆脐油中加入无水乙醇250mL，搅拌提取45min，静止后倒出乙醇提取液(其他油脂在下)，旋转蒸发除去乙醇，得少量膏状物(约＜0.1g)。

向膏状物中加入10mL无水乙醇，摇动提取10min，倒出乙醇上清液(弃去贴在瓶底部的油脂)，旋转蒸发干，经检测黄豆黄素为21mg(可作为大豆异黄酮检测用标准品)，黄豆黄素的纯度为90.8％。

实施例6

取经磨细(80目)的大豆豆脐粉110g，加入正己烷200mL，室温下搅拌提取1.3h，静止后倒出上清150mL，再加入150mL正己烷室温下搅拌提取1.3h，静止后倒出上清150mL。如此再重复4次，共提6次。将上清液合并旋转蒸发除去正己烷，得豆脐油20mL。

向20mL豆脐油中加入无水乙醇300mL，搅拌提取0.5h，静止后倒出乙醇提取液(其他油脂在下)，旋转蒸发除去乙醇，得少量膏状物(约＜0.1g)。

向膏状物中加入10mL无水乙醇，摇动提取15min，倒出乙醇上清液(弃去贴在瓶底部的油脂)，旋转蒸发干，经检测黄豆黄素为19.5mg(可作为大豆异黄酮检测用标准品)，黄豆黄素的纯度为90.4％。

对比例7

与实施例1的区别为：采用石油醚替换正己烷，其他步骤与实施例1相同，产品中不含有黄豆黄素。

对比例8

与实施例1的区别为：向豆脐粉中加入的正己烷的体积为330ml，其他步骤与实施例1相同。溶剂用量大，产品杂质多，黄豆黄素的纯度为67％。

对比例9

与实施例1的区别为：向豆脐油中加入无水乙醇的体积为150ml，其他步骤与实施例1相同，豆脐油的溶解不好，液体粘，提取也不彻底。

对实施例1-3，对比例1-9制备的产品进行检测，检测方法如下：

1、将大豆素、大豆素苷、染料木素、染料木苷、黄豆黄素、黄豆黄苷6个标准品分别配成1mg/ml的6个标准品溶液。

2、将实例1-3、对比例1-9所制备的样品分别用10ml乙酸乙酯溶解作为样品液。

3、用活化后的硅胶GF254高效薄层板(HPTLC)10cm*20cm，对6个标准液的每个分别取1μl、2μl、3μl、4μl、5μl制作出13个标准曲线，相应的得6个标准曲线方程。

4、大豆异黄酮苷(大豆素苷，染料木苷，黄豆黄苷)的检测：外标三种标准品液各5μl。取实施例1-6，对比例1-9的产品的乙酸乙酯溶解的样品液各5μl。点在GF254HPTLC板上，自然晾干。在双槽的玻璃展开缸展开，加20ml展开剂，展开剂配方：二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:2:0.1，HPTLC板放入展开缸后加盖，饱和10分钟后始展开，展开距：13厘米。展毕取出。晾干后在365nm紫外灯下观察。

5、在薄层扫描仪TLC scanner III带有WINcats1.4.1软件(瑞士CAMAG公司)扫描条件：扫描速度80nm/s，分辨率200μm/step，照射灯D2灯，波长260nm，扫描宽度6.00mm*0.90mm。大豆素苷Rf＝0.41，染料木苷Rf＝0.52，黄豆黄苷Rf＝0.50，如图1所示，可知，这三种物质可以完全分离。

6、大豆异黄酮苷元(大豆素，染料木素，黄豆黄素)的检测：外标三种标准品液各5μl。取实施例1-6，对比例1-9的产品的乙酸乙酯溶解的样品液各5μl。点在GF254HPTLC板上，自然晾干。在双槽的玻璃展开缸展开，加20ml展开剂，展开剂配方：三氯甲烷：甲醇：乙酸＝9:1:0.15，HPTLC板放入展开缸后加盖，饱和10分钟后始展开，展开距：10厘米，展毕取出，晾干后，在365nm紫外灯下观察。

7、在薄层扫描仪TLC scanner III带有WINcats1.4.1软件(瑞士CAMAG公司)扫描条件：扫描速度80nm/s，分辨率200μm/step，照射灯D2灯，波长260nm，扫描宽度6.00mm*0.90mm，大豆苷元Rf＝0.50，染料木素Rf＝0.67，黄豆黄素Rf＝0.62。

对实施例1-6，对比例1-9的样品液进行检测，检测结果为：实施例1-6的样品液中只含有黄豆黄素，没有其他的大豆异黄酮。如图2和图3所示，实施例1制备的产品和黄豆黄素标准品的出峰位置相同，为同一种物质，且图2中的扫描图中没有其他杂质峰，说明制备的黄豆黄素产品较纯净。

实施例1-6，对比例1-9制备的产品的成分和纯度见表1。

表1

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。