阅读说明：本技术 聚胺辅助天然多酚快速、稳定修饰磁性纳米固定化酶载体及应用 (Polyamine-assisted natural polyphenol rapid and stable modification magnetic nano immobilized enzyme carrier and application thereof ) 是由 陈超 汤文 王平 庄家丰 马同昊 于 2019-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种聚胺辅助实现天然多酚快速且稳定修饰的磁性纳米固定化酶载体,包括磁性纳米颗粒,表面经天然多酚和聚胺类修饰。本发明提供了相应的制备方法、固定化酶及制备方法、应用。本发明提供了一种利用聚胺加速天然多酚聚合且稳定沉淀的仿生黏附策略制备天然多酚/聚胺二元体系修饰的磁性纳米颗粒固定化酶的方法,为固定化酶技术提供了新方法。本发明首次合成了天然多酚/聚胺二元体系修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒,用于酶的固定化,具有超顺磁性、良好的生物相容性以及高的酶负载量,为固定化酶提供了新的酶固定化载体。本发明将固定化的脂肪酶在交变磁场中催化废弃食用油生产生物柴油,具有较高的催化效率,表现出巨大的工业应用前景。(The invention provides a magnetic nano immobilized enzyme carrier for realizing quick and stable modification of natural polyphenol by polyamine, which comprises magnetic nano particles, wherein the surfaces of the magnetic nano particles are modified by natural polyphenol and polyamine. The invention provides a corresponding preparation method, immobilized enzyme, a preparation method and application. The invention provides a method for preparing a magnetic nanoparticle immobilized enzyme modified by a natural polyphenol/polyamine binary system by utilizing a bionic adhesion strategy of polyamine for accelerating polymerization of natural polyphenol and stabilizing precipitation, and provides a new method for an immobilized enzyme technology. The magnetic ferroferric oxide nano-particles modified by a natural polyphenol/polyamine binary system are synthesized for the first time, are used for enzyme immobilization, have superparamagnetism, good biocompatibility and high enzyme loading capacity, and provide a new enzyme immobilization carrier for immobilized enzymes. The invention catalyzes the waste edible oil to produce the biodiesel by the immobilized lipase in the alternating magnetic field, has higher catalytic efficiency and shows huge industrial application prospect.)

聚胺辅助天然多酚快速、稳定修饰磁性纳米固定化酶载体及 应用

技术领域

本发明涉及酶的固定化技术，具体涉及一种聚胺辅助实现天然多酚快速且稳定修饰的磁性纳米酶固定化载体的制备及应用，属于高分子材料及生物催化科学领域。

背景技术

近年来，生物柴油作为一种可生物降解、环境友好以及可再生的生物燃料越来越受到人们的重视。它可以在生物催化剂或者化学催化剂的作用下，通过酯交换反应利用废油、动物脂肪和植物油来生产。目前，生物柴油的供应主要来自于碱或酸催化转化，但潜在的环境污染、能源需求高以及反应不理想等缺点严重降低了生物柴油的质量和收率。与化学催化相比，酶法(例如：脂肪酶)催化以其环境友好、操作条件温和以及能耗低等优点越来越受到人们的重视。然而，游离脂肪酶由于难以回收再利用、易在有机溶剂中失活以及操作成本高，因而在工业应用中存在诸多问题。

为了克服以上瓶颈问题，近年来研究者们一直在寻找适合脂肪酶的高效酶固定化载体，以提高酶的稳定性，显著降低成本，实现酶的重复利用。目前，介孔材料、磁性材料以及聚合物材料等多种纳米材料作为酶固定化载体被成功设计和合成。

在各种纳米材料中，磁性纳米颗粒因其高比表面积、低传质阻力、良好的生物相容性和易于分离回收等优点，在酶固定化领域具有广阔的应用前景。然而，酶直接固定化在磁性纳米颗粒表面会严重影响固定化酶的催化性能和负载能力，这主要是由于其固有的化学惰性和缺乏酶固定化的活性位点。此外，磁性纳米颗粒表面与固定化酶之间存在空间位阻和高的传质阻力。因此，利用具有多活性官能团的、可生物降解的且具有良好生物相容的天然聚合物对磁性纳米颗粒进行表面修饰，可以显著提高酶的固定化效率。

到目前为止，绿色化学为制备功能纳米结构提供了一种环境友好型策略。其中，利用天然多酚对磁性纳米颗粒进行修饰，增强其与酶的相互作用，或为载体提供额外的酶共价固定化功能基团，受到了越来越多的关注。其中，单宁酸是一种从植物中提取的天然多酚类化合物，已被广泛应用于功能化纳米颗粒。具体来说，单宁酸可以氧化自聚在磁性纳米颗粒表面形成一层聚(单宁酸)层，这已被证明是一个酶固定化的通用平台，它通过迈克尔反应或者席夫碱反应实现酶的固定化。然而，纯单宁酸表面修饰技术在酶固定化方面存在的一些缺点限制了其广泛应用，如聚(单宁酸)层的形成耗时长，形成的单宁酸聚合物层机械稳定性较差。和纯单宁酸相比，聚多巴胺可以通过共价和非共价作用快速、紧密地粘附在各种基底材料上。此外，已有研究指出，氨基和酚基是在聚多巴胺层中形成共价键的两个关键成分。受此启发，本研究可以有把握地推断，含有酚基和氨基的分子可能具有粘附性能，能够迅速氧化聚合形成类似于聚多巴胺的稳定聚合物层。考虑到单宁酸含有丰富的酚基和聚胺还有丰富的氨基，这两者的组合可以具有与多巴胺相似的化学结构，因此单宁酸/聚胺二元体系可以氧化聚合，形成稳定的聚合物层用于酶的固定化。

针对单宁酸层修饰基底材料耗时长，且在基底材料上机械稳定性差，严重阻碍了其在固定化酶领域的实际应用这些问题，本专利提出了一种聚胺辅助实现单宁酸快速、稳定地修饰在磁性纳米颗粒表面用于酶固定化的策略，并成功合成了单宁酸/聚胺二元体系修饰的四氧化三铁纳米颗粒复合物(Fe₃O₄-pTAPA)。该复合物载体具有良好的机械稳定性、生物相容性、分散性、磁响应性及与酶共价连接、对酶负载量高的优点，因而为酶提供了一种性能优异的固定化酶载体，在酶催化领域具有巨大的工业应用潜力。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的缺失，提供一种生物相容性好、稳定性高以及负载量高的载酶磁性纳米固定化酶载体、固定化酶及相应的制备方法、应用，能够解决单宁酸层的形成耗时长、且在基底材料上机械稳定性差、严重阻碍其在固定化酶领域的实际应用的技术问题。

本发明的第一个目的是提供了一种聚胺辅助实现天然多酚快速且稳定修饰的磁性纳米固定化酶载体，包括磁性纳米颗粒，所述的磁性纳米颗粒的表面经天然多酚和聚胺类修饰。该固定化酶载体，生物相容性良好，稳定性高，负载量高。

较佳地，所述的聚胺类为四乙烯五胺(TEPA)、聚醚酰亚胺(PEI)、三乙烯四胺(TETA)或二乙烯三胺(DETA)中的一种或多种。

较佳地，所述的天然多酚为单宁酸(TA)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素(EGC)中一种或多种。

较佳地，所述的磁性纳米颗粒为四氧化三铁磁性纳米颗粒。

本发明的第二个目的是提供了一种所述的聚胺辅助实现天然多酚快速且稳定修饰的磁性纳米固定化酶载体的制备方法，包括步骤：

(1)制备磁性纳米颗粒；优选地，使用溶剂热法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄NPs)；

(2)在弱碱性条件下，采用天然多酚/聚胺二元体系对磁性纳米颗粒的表面进行功能化修饰。

在该制备方法及由该制备方法获得的产品中，聚胺类辅助单宁酸快速修饰磁性纳米颗粒的表面。

较佳地，所述的步骤(2)中，单宁酸/聚胺的质量比为8:1～3:1。

较佳地，所述的步骤(2)中，单宁酸/聚胺二元体系的共沉淀时间为4～10h。

本发明的第三个目的是提供了一种固定化酶，通过将任一水溶性酶固定于所述的磁性纳米固定化酶载体的修饰表面上获得。

本发明的第四个目的是提供了一种所述的固定化酶的制备方法，包括步骤：将所述的固定化酶载体加入到酶溶液中，进行固定化酶。

其中，酶可以为任一水溶性酶；初始酶添加量为50-350mg/g载体；酶固定化时间为1-9h。

本发明的第五个目的是提供了一种固定化酶的应用，用于食品、生物柴油生产、污水处理、手性药物生产等，特别地，用于在交变磁场下生产生物柴油，其中交变磁场由交变磁场发生器产生，交变磁场发生器主要由控制面板、铁线圈、玻璃反应器和变压器组成。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种利用聚胺加速天然多酚聚合且稳定沉淀的仿生黏附策略制备天然多酚/聚胺二元体系修饰的磁性纳米颗粒固定化酶的方法，为固定化酶技术提供了新的方法。

(2)本发明首次合成了天然多酚/聚胺二元体系修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒，用于酶的固定化，具有超顺磁性、良好的生物相容性以及高的酶负载量，为固定化酶提供了新的酶固定化载体。

(3)本发明利用新的固定化方法，大幅度提高了酶的稳定性和重复利用性。

(4)本发明将固定化的脂肪酶在交变磁场下催化废弃食用油生产生物柴油，具有较高的催化效率，表现出巨大的工业应用前景。

附图说明

图1：单宁酸/聚胺二元体系修饰的磁性四氧化三铁(Fe₃O₄)纳米颗粒的制备及应用的基本原理图。

图2A～2D：制备的功能化的磁性Fe₃O₄纳米颗粒的形态和结构表征图。其中，图2A为修饰前的Fe₃O₄透射电镜图，图2B为修饰后的Fe₃O₄透射电镜图(Fe₃O₄-pTAPA)，图2C为制备的磁性Fe₃O₄，Fe₃O₄-pTAPA和Fe₃O₄-pTAPA-CALB纳米颗粒的红外光谱图，图2D为制备的磁性Fe₃O₄，Fe₃O₄-pTAPA和Fe₃O₄-pTAPA-CALB纳米颗粒的磁滞曲线图。

图3A～3D：制备的功能化的磁性Fe₃O₄纳米颗粒机械稳定性和生物相容性考察图。图3A为制备的磁性Fe₃O₄，Fe₃O₄-pTA和Fe₃O₄-pTAPA磁性纳米颗粒的热失重分析图；图3B为Fe₃O₄-pTA和Fe₃O₄-pTAPA磁性纳米颗粒在不同时间的聚合物残留率；图3C为不同浓度的Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒孵育L-02细胞后的细胞存活率；图3D为使用或不使用Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒培养L-02细胞的光学显微镜图。

图4A～4B：固定化酶过程优化。图4A为TA/TEPA二元体系共沉积时间对酶负载量和相对活性的影响；图4B为添加CALB浓度对酶负载量和相对活性的影响。

图5A～5D：固定化酶酶学性质。图5A～5B为pH和温度对游离酶和固定化酶水解活性的影响；图5C为游离酶和固定化酶在40℃的热稳定性；图5D为游离酶和固定化酶在存在30％和60％甲醇时的耐受性。

图6A～6D：固定化酶生产生物柴油。图6A为用游离酶和固定酶催化废食用油生产生物柴油；图6B为实验室自制的交变磁场发生器照片；图6C为在最高磁场强度下，不同外加交变磁场频率对固定化酶催化生物柴油生产的影响；图6D为在交变磁场下，固定化酶用于生物柴油生产的重复利用性。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1所示：本发明以磁响应型的四氧化三铁Fe₃O₄作为基底材料，单宁酸(TA)的三个没食子酰基首先与四氧化三铁(Fe₃O₄)纳米颗粒表面的Fe^III反应，形成稳定的八面体络合物。同时，TA中的酚基在碱性条件下氧化成醌式结构，随后进一步与聚胺中的氨基通过迈克尔加成反应/席夫碱反应在苯环的邻位上形成碳氮键(C-N bond)。形成的聚(单宁酸/聚胺)层通过共价和非共价作用紧密地粘附在磁性Fe₃O₄表面。最后，在不使用任何化学交联剂的情况下，酶与上述载体之间通过共价键实现固定化。

实施例1：

聚胺辅助实现单宁酸快速且稳定修饰的磁性纳米酶固定化载体的制备及相应固定化酶的制备

(1)溶剂热法制备磁性四氧化三铁纳米颗粒(Fe₃O₄ NPs)：

将聚丙烯酸(PAA,150mg)、乙酸钠(NaAc,6.0g)、六水三氯化铁(FeCl₃·6H₂O,1.62g)分别溶解于由二甘醇和乙二醇组成的混合溶液中。剧烈机械搅拌后，200℃密封加热12h。反应结束后，用磁铁分离收集，再用去离子水和无水乙醇分别清洗3次，得到的黑色磁性颗粒真空干燥24h。

(2)单宁酸(TA)/聚胺(TEPA)二元体系功能化的磁性纳米颗粒的制备(Fe₃O₄-pTAPANPs)：

将步骤(1)制备好的Fe₃O₄纳米颗粒加入含有2mg/mL TA的Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中，然后将TEPA加入上述混合溶液中反应一段时间。最后，用去离子水和乙醇对合成的纳米材料进行多次洗涤，真空干燥24h。获得TA/TEPA二元体系功能化的磁性纳米颗粒(Fe₃O₄-pTAPA NPs)。

作为对照实验，未加入TEPA合成的纳米颗粒命名为Fe₃O₄-pTA NPs。

(3)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)/聚胺(DETA)二元体系功能化的磁性纳米颗粒的制备(Fe₃O₄-pEGDE NPs)：

将步骤(1)制备好的Fe₃O₄纳米颗粒加入含有3mg/mL EGCG的Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中，然后DETA按一定的质量比加入上述混合溶液中反应一段时间。最后，用去离子水和乙醇对合成的纳米材料进行多次洗涤，真空干燥24h。获得EGCG/DETA二元体系功能化的磁性纳米颗粒(Fe₃O₄-pEGDE NPs)。

其中，步骤(3)可作为步骤(2)的替换方案。

(4)固定化脂肪酶

本实施例选择脂肪酶CALB作为模型酶，通过简单的共价结合方法将酶固定在Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒上。

具体来说，一定量的Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒经超声分散在含有脂肪酶CALB的缓冲溶液中，在180rpm震荡反应6h。随后，固定化的脂肪酶CALB(Fe₃O₄-pTAPA-CALB)用磁铁分离并用磷酸盐缓冲液洗涤几次，除去未连接的脂肪酶CALB。最终获得的脂肪酶储存储在4℃待用。

(5)表征

本实施例中，通过透射电镜、红外光谱、震动样品磁强计对合成的材料进行表征，结果如图2A～2D所示。如图2A所示，透射电镜表明本发明合成的球形Fe₃O₄纳米颗粒的平均直径约为100nm；如图2B所示，经TA/TEPA二元体系修饰后得到的Fe₃O₄-pTAPA在Fe₃O₄纳米颗粒周围呈现出明显的不规则层，说明TA/TEPA二元体系成功修饰在Fe₃O₄纳米颗粒上；如图2C的红外光谱所示，和未经修饰的Fe₃O₄相比，经TA/TEPA二元体系修饰后，出现了几个新的吸收峰，在1222和1437cm^-1处新出现的吸收峰可以归因于TEPA的C-N伸缩带和酰胺II，在1614cm^-1附近有一个较宽的吸收带，这可能与TA的芳香环有关，这进一步证明Fe₃O₄纳米颗粒被TA/TEPA二元体系成功修饰；在CALB固定化后，Fe₃O₄-pTAPA-CALB在1200cm^-1处出现了新的吸收峰，这可能与固定化过程中席夫碱反应形成C-N键的拉伸有关，说明CALB被成功共价固定在Fe3O4-pTAPA纳米颗粒上。如图2D所示，Fe₃O₄、Fe₃O₄-pTAPA和Fe₃O₄-pTAPA-CALB纳米颗粒的饱和磁强度分别为62.8、59.7和44.0emu/g。由于TA/TEPA二元体系的修饰和脂肪酶CALB的进一步固定，导致了材料的磁强度逐步下降。这一结果也明显证实了由TA/TEPA二元体系氧化聚合的pTAPA层的形成以及脂肪酶CALB的固定。虽然Fe₃O₄-pTAPA-CALB纳米颗粒的饱和磁化强度值小于Fe₃O₄纳米颗粒，但从图2D的插图中可以明显看出，磁铁仍然可以在20秒内快速地将固定化的脂肪酶CALB从水溶液中分离出来。

综上所述，上述结果表明，Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒被成功合成且固定化脂肪酶CALB被成功构建。此外，可以通过磁铁快速从反应液中回收固定化酶，实现催化剂的重复利用。

实施例2：

功能化的磁性Fe₃O₄纳米颗粒机械稳定性和生物相容性的考察

机械稳定性考察：将0.5mg/mL的Fe₃O₄-pTA或者Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒分散在磷酸盐缓冲液(20mM,pH 7.0)中，搅拌7天。每天从上述溶液中取样，进行热失重(TGA)分析。聚合物残余率量计算公式如下:

聚合物残余率(％)＝W_i/W₀×100

其中，W₀为Fe₃O₄-pTAPA或者Fe₃O₄-pTA纳米颗粒在0天热失重，W_i为Fe₃O₄-pTAPA或者Fe₃O₄-pTA纳米颗粒在某个时间的热失重。

生物相容性的考察：L-02细胞被接种到96孔板，37℃培养过夜。然后，用不同浓度的Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒新鲜培养基替代原培养基培养24h，最后用MTT法测定Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒的细胞毒性。

从图3A中可以看出，Fe₃O₄-pTA的失重为25.1wt％，而Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒的失重增加到51.2wt％。这一现象可以解释为，在弱碱性条件下，提供酚基的单宁酸(TA)和提供氨基的聚胺(TEPA)可以快速形成共价键，形成的pTAPA层通过共价和非共价作用紧密地粘附在Fe₃O₄纳米颗粒表面。因此，这一结果表明，聚胺(TEPA)的存在可以加速TA在Fe₃O₄纳米颗粒上的聚合。

如图3B所示，搅拌7天后，Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒的聚合物残留率仍然保持在80.9％以上，而Fe₃O₄-pTA纳米颗粒的聚合物残余率下降到53.2％，表明聚胺(TEPA)能够提高单宁酸聚合物层的机械稳定性。这个结果可能是因为TA中的酚基被氧化成醌式结构，这易于与聚胺中的氨基发生迈克尔加成反应和席夫碱反应，产生致密的聚合物层包裹在载体材料表面。

图3C显示在Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒的浓度高达200μg/mL时，L-02细胞的细胞存活率仍高于85％，这表明Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒良好的生物相容性和低的细胞毒性。

如图3D所示，用光学显微镜观察添加或不添加Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒处理的L-02细胞的形态学图像。和对照组L-02细胞相比，经Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒处理过的L-02细胞，细胞形态无明显破坏，这也清楚地证实了合成的纳米颗粒具有良好的生物相容性。

以上结果表明，聚胺能够加速单宁酸氧化聚合在磁性四氧化三铁纳米颗粒表面，并且合成的Fe₃O₄-pTAPA纳米颗粒具有良好的机械稳定性和生物相容性。

实施例3：脂肪酶固定化过程的优化

在酶固定化过程中，考察了TA/TEPA二元体系共沉积时间(4-10)和初始脂肪酶CALB添加量(50-350mg/g载体)对酶的负载能力和酶活性的影响。酶活测定按照p-NPP法测定，以最高酶活为100％，得到不同固定化过程条件下的相对酶活和载酶量。

如图4A和4B所示，最适固定化酶条件为：TA/TEPA二元体共沉淀时间为7h和固定化脂肪酶添加量为250mg/g载体。

实施例4：固定化脂肪酶的酶学性能

(1)最适pH和温度

采用p-NPP法测定脂肪酶水解活性，研究了不同pH(4-10)和不同温度(20-80℃)对游离和固定化脂肪酶CALB催化活性的影响，并比较了相对酶活性。

(2)温度稳定性

在40℃磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.0)中温和搅拌，每隔一定时间，取适量样品采用p-NPP法进行酶活性测定，然后计算游离和固定化CALB的相对活性。

(3)甲醇耐受性

将游离酶和固定化脂肪酶CALB分别培养在不同浓度甲醇溶液(v/v、30％和60％)中一定时间，取适量样品采用p-NPP法测定游离和固定化CALB的酶活并比较甲醇耐受性。

如图5A～5D所示，相比于游离酶，固定化酶的pH、温度、热稳定性和甲醇耐受性均显著提高，这主要是由于酶通过多点共价固定在载体上增强了固定化酶的刚性，从而有效地避免了固定化酶在不同微环境下构象剧烈的变化。

实施例5：固定化脂肪酶在交变磁场中生产生物柴油

催化反应在10mL加塞摇瓶中进行，反应体系如下：2.0g废食用油、无水甲醇按油/甲醇摩尔比为1:3添加、分子筛(40wt％油)和一定量的游离脂肪酶CALB或固定化脂肪酶CALB。在反应过程中，甲醇的加入分三次进行。在40℃，200rpm的搅拌速度下进行反应，反应时间最长为96h。与此同时，每隔一定时间从反应体系中取样，用气相色谱法进行定量分析。此外，在研究交变磁场的磁场对固定化酶的影响的时候，我们将固定化酶的添加量减少为原来的一半，反应84h，其他条件不变。

如图6A所示，固定化脂肪酶CALB的催化性能显著高于游离脂肪酶CALB。这一现象可能是由于反应体系中存在过量的甲醇，而甲醇在废食用油中的溶解度较差，可能会使导致脂肪酶CALB失活，然而由于固定化脂肪酶CALB的甲醇的耐受性显著提高，因而提高了生物柴油的生产效率。

有趣的是，我们研究组之前报道过，固定化在超顺磁性纳米颗粒上的酶和辅因子可以在交变磁场下显著提高催化反应速率。图6B展示了我们实验室自制的交变磁场发生器的照片，它由控制面板、铁线圈、玻璃反应器和变压器组成。其中，控制面板上有5级磁场频率(25～500Hz)和4级磁场强度(最低、低、高和最高)。

由图6C可以看出，在交变磁场作用下，固定化脂肪酶CALB的催化效率比无交变磁场作用下的催化效率高，且反应速率随磁场频率的增加而提高。这一结果显示，Fe₃O₄-pTAPA-CALB纳米颗粒在交变磁场下像一个个微搅拌器，可以显著提高固定化脂肪酶CALB与底物的碰撞频率，从而提高生物柴油的生产效率。因此，这些有趣的结果表明，交变磁场能够促进Fe₃O₄-pTAPA-CALB催化生产生物柴油，并且生物柴油生产效率随着交变磁场频率和强度的增加而进一步提高。

如图6D所示，Fe₃O₄-pTAPA-CALB具有良好的重复利用性。

综上所述，经过一系列形态、结构表征证明本发明巧妙的通过引入聚胺解决了单宁酸层形成耗时长且机械稳定性差的问题，并且成功合成了单宁酸/聚胺二元体系修饰的磁性纳米颗粒。本发明合成的磁性纳米颗粒具有良好的机械稳定性、生物相容性、分散性、磁响应性及与酶共价连接、对酶负载量高的优点。利用本方法固定化脂肪酶可以在交变磁场下高效利用废食用油生产生物柴油，且具有良好的重复利用性。此外，本发明合成的磁性载体适用于任何水溶性酶的固定化。本发明的制备方法简单且环境友好，适合于大规模生产

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。