阅读说明：本技术 一种利用微流控芯片定量检测细菌及药敏实验的方法 (method for quantitatively detecting bacteria and drug sensitivity experiment by using micro-fluidic chip ) 是由 张晓杰 宋波 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有新型结构的微流控芯片,以及利用微流控芯片玻璃微珠定量检测细菌的方法。本发明的微流控芯片包括顶层、中层和底层结构,其中中层结构包括四个区域：入口区、检测区、浓度梯度发生器以及废液孔,所述入口区位于检测区和药敏反应池之间,同时,本发明将玻璃微珠填充到微流控芯片检测区中,采用抗原抗体技术定量检测细菌,并同步进行药敏检测。采用本发明的微流控芯片,能够实现细菌的快速准确检测,且灵敏度高,特异性高,同时药敏试剂用量小。(The invention provides a micro-fluidic chip with a novel structure and a method for quantitatively detecting bacteria by utilizing micro-fluidic chip glass beads. The micro-fluidic chip comprises a top layer, a middle layer and a bottom layer structure, wherein the middle layer structure comprises four areas: the invention discloses a micro-fluidic chip for detecting drug sensitivity, which comprises an inlet area, a detection area, a concentration gradient generator and a waste liquid hole, wherein the inlet area is positioned between the detection area and a drug sensitivity reaction tank, and meanwhile, glass beads are filled in the detection area of the micro-fluidic chip, and the antigen-antibody technology is adopted to quantitatively detect bacteria and synchronously carry out drug sensitivity detection. The micro-fluidic chip can realize the rapid and accurate detection of bacteria, and has high sensitivity, high specificity and small dosage of drug sensitive reagents.)

一种利用微流控芯片定量检测细菌及药敏实验的方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种利用微流控芯片定量检测细菌及药敏实验的方法。

背景技术

细菌的鉴定传统金标方法是使用培养法，培养法准确，但耗时，操作繁琐，使用大型仪器价格高昂。稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度(MIC)，一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点(敏感、中介和耐药)的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC。影响药敏结果的因素包括培养基和药物浓度，其中培养基应根据试验菌的营养需要进行配制，同时药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制，商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

微流控方法是近些年新兴起来的技术，将其应用于细菌检测及药敏实验，可以大大缩短检测时间，减少耗材，检测设备小巧便捷。并流型浓度梯度发生器较为常见，它是利用层流原理，在并行的相邻液流间通过扩散作用传质，形成垂直于液流方向的浓度梯度。形成梯度的特征(例如形状、浓度、区间等)只与物质种类、流速和接触时间有关。常见的并流型浓度梯度发生器有T构型、圣诞树构型、通用型等。利用同样原理制成的“圣诞树”构型，结构较为复杂，初始各液流经过多次的分流、汇合，形成的合梯度更加精细且为非连续性的，而且它将梯度形成装置与反应分析区分离开，扩大了分析区域的面枳。但是，目前的微流控芯片结构仅能单独实现细菌的药敏实验，并不能实现病原菌的检测与其药敏实验同时进行。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用微流控芯片结合微珠定量检测细菌的方法，将包被有抗体的微珠填充到微流控芯片中，利用抗原抗体反应检测细菌，并同步进行药敏检测。

第一方面，本发明提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括顶层、中层和底层，其中所述中层为PDMS结构，底层为载玻片，所述中层包括四个区域：入口区、检测区、浓度梯度发生器以及废液孔，且所述入口区位于检测区与浓度梯度发生器之间，所述浓度梯度发生器为“圣诞树”型，并包括个药敏培养池，其中n等于1、2、3、4……；

可选地，所述入口区包括待测样品加样孔、稀释液/缓冲液加样孔及药物加样孔，所述入口区底层高度高于其他区域底层2-4μm，以便于在重力的作用下快速便捷地加样。

可选地，所述待测样品加样孔位于浓度梯度发生器一侧设置有可拆卸的厚度为90-110μm的PVDF膜，在菌液检测时，防止菌液流入浓度梯度发生器，在药敏试验时，可将其拔出形成菌液流通通道，流入至浓度梯度发生器。

可选地，所述药敏培养池的直径为2-5mm，所述废液孔的直径为0.5-1mm。

可选地，所述检测区中包括微托和微珠；所述微托为V字形或半圆形，所述微珠直径为60-90μm，微托略宽于微珠，将微珠托起。

可选地，所述废液孔包括检测区废液孔(1)和浓度梯度发生器废液孔(9)，所述废液孔(1)通过液体通道与检测区相连通，所述废液孔(9)通过液体通道与所述药敏培养池下游相连通。

可选地，所述入口区与浓度梯度发生器之间、各个药敏培养池之间都设置有曲线型通道(10)，且所述检测区与废液孔(1)之间的通道宽度为40μm，其他所有通道宽度为100μm。

第二方面，本发明提供了一种所述微流控芯片的制备方法，包括：先将所述微流控芯片中层与所述微流控芯片底层封接，然后将无菌滤纸片分别置于所述药敏培养池中，等离子处理后，再将所述微流控芯片中层与所述微流控芯片顶层封接。

可选地，所述芯片封接前各层经90℃烘烤2h，紫外灯照射过夜。

第三方面，本发明还提供了微流控芯片在病原体鉴定与药敏实验中的应用，包括如下步骤：

步骤S1：芯片各层经过高压灭菌后，将底层与中层封接，向药敏培养池中加入培养基，而后在药敏培养池中加入无菌滤纸片，并将上层封接，封接后的完整芯片置于4℃冰箱中储存，使用前使用紫外灯照射芯片表面30min；

步骤S2：制备抗体包被的微珠，并由加样孔泵入检测区，微珠进入到检测区后，使用PBS冲洗加压，保证每个微托上有一个微珠，将待测菌从入口加入到检测区，使菌液被微珠捕获，使用PBS冲洗过量菌液，从废液口1吸出过量菌液，根据检测菌种加入相应兔一抗工作液，FITC标记的山羊抗兔荧光二抗工作液，待反应完成后，使用PBS冲洗过量未反应液体，从废液口1吸出过量液体，在荧光显微镜下观察芯片检测区，将观察结果用Image Pro软件分析其平均荧光显色浓度，根据标准曲线，判断待检菌浓度，整个过程将芯片置于便携式温箱中培养，便携式温箱尺寸50×30×30cm。

步骤S3：如果检测区荧光反应为阴性，则证明检测菌结果为阴性，不进行药敏实验；如果检测区荧光反应为阳性，则继续进行药敏实验。

进一步地，步骤S3中所述药敏试验包括，

步骤S31：使用PBS冲洗液体通道，在药物加样孔泵入药物，在稀释液/缓冲液加样孔泵入稀释液，通过浓度梯度发生器在每一列的孔中形成具有不同浓度梯度的药物，待药敏培养池中无菌滤纸完全浸润药物后，将废液孔中流出的多余药液去除；

步骤S32：将所述待测样品加样孔一侧的PVDF膜拔出，并在待测样品加样孔中加入经过步骤S2确认含病原菌的菌液，待菌液将全部药敏培养池充盈后，将废液孔中流出的过量菌液去除，将芯片置于便携式温箱中培养，便携式温箱尺寸50×30×30cm，根据颜色深浅判断最低抑菌浓度MIC。

进一步地，所述步骤S2中的标准曲线绘制方法为，以0.5MCF浓度相当于1.5×10⁸cfu/ml大肠埃希菌作为参考，将1.5×10⁸cfu/ml,1.5×10⁷cfu/ml,1.5×10⁶cfu/ml,1.5×10⁵cfu/ml,1.5×10⁴cfu/ml,1.5×10³cfu/ml,1.5×10²cfu/ml,1.5×10¹cfu/ml浓度的菌液分别加入到检测区，经过检测区后，冲洗过量未反应的菌液，使用荧光显微镜观察，将观察结果用Image Pro软件分析其平均荧光显色浓度，绘制标准曲线。

进一步地，步骤S2中，所述抗体包被的微珠的制备方法包括以下步骤，

微珠的处理：准确称取10mg玻璃微珠，用Piranha溶液浸泡过夜，用无菌超纯水洗涤5次，70℃干燥30min，加入2％APTES丙酮溶液反应1min，依次用丙酮和无菌超纯水清洗5次；

抗体工作液的制备：在10μL 1mg·mL^-1抗体工作液中加入50μL MES缓冲液、8μL4mg·mL^-1EDC(约2mmol·ml^-1)和12μL4mg·mL^-1NHS(约2mmol·mL^-1)，室温反应15min后，加入120μL 0.1mol·L^-1PBS缓冲液，终止NHS-抗体活化酯形成反应，即得到抗体浓度为50μg·mL^-1的抗体反应液。

微珠包被抗体：向抗体反应液中加入处理后的玻璃微珠，室温反应2h。反应完毕后用0.1mol·L^-1PBS清洗3次，得到经抗体修饰的免疫微珠，置于4℃备用。

本发明相对于现有技术具有的有益效果：

1.本发明的微流控芯片可以实现细菌定量检测和药敏实验的同时进行，同时，在浓度梯度发生器中的任意一列都可观察MIC，相较于传统方法或者其他微流控药敏实验方法更方便快速。

2.本发明的微流控芯片检测区采用抗原抗体反应的方法实现细菌的快速准确检测，灵敏度高，特异性高，且检测步骤简便，使用等离子泵驱动，避免手工操作。药敏试剂用量小，使用的光密度采集器是根据颜色深浅的变化来确定MIC，快速有效。

3.将纸基技术用于微流控芯片中的药敏实验，相对于传统浓度梯度发生器的药敏实验而言，不仅缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，简化操作步骤，而且实现了自动化控制，更利于观察实验结果。

附图说明

图1为本发明的微流控芯片总体结构示意图

其中，1-废液孔1，2-检测区，3-微珠，4-微托，5-药物加样孔，6-待测样品加样孔，7-稀释液/缓冲液加样孔，8-浓度梯度发生器，9-废液孔2，10-曲线型通道。

图2为本发明检测中使用的便携式恒温箱示意图。

图3为本发明微流控芯片检测区的标准曲线图。

图4为本发明浓度梯度发生器的终浓度药敏培养池中浓度比例。

图5为本发明药敏试验不同浓度梯度的显色强度。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

参见本发明的附图1，如图所示，所述微流控芯片包括顶层、中层和底层结构，其中所述中层和底层结构为PDMS结构，所述中层结构包括四个区域：入口区、检测区2、浓度梯度发生器8以及废液孔1、9，且所述入口区位于检测区2与浓度梯度发生器8之间，所述浓度梯度发生器8为“圣诞树”型，并包括个药敏培养池，其中n等于1、2、3、4……。

所述入口区包括待测样品加样孔6、稀释液加样孔7及药物加样孔5；所述药敏培养池的直径为2-5mm，所述废液孔的直径为0.5-1mm，所述入口区与浓度梯度发生器之间、各个药敏培养池之间都设置有曲线型通道(10)，所述检测区与废液孔(1)之间的通道宽度为40μm，其他所有通道宽度为100μm。所述入口区底层高度高于其他区域底层2-4μm。

所述检测区2中包括微托4和微珠3；所述微托为V字形或半圆形，所述微珠直径为50-90μm，微托略宽于微珠，将微珠托起。所述废液孔包括废液孔(1)和废液孔(2)，所述废液孔(1)通过液体通道与检测区相连通，所述废液孔(2)通过液体通道与所述药敏培养池下游相连通。

实施例2

所述微流控芯片的制备方法包括：等离子处理所述微流控芯片的中层和底层，再将所述微流控芯片中层与所述微流控芯片底层封接，然后将无菌滤纸片分别置于所述药敏培养池中，再将所述微流控芯片中层与所述微流控芯片顶层封接。所述芯片封接在无菌条件下进行，封接前芯片各层经90℃烘烤2h，紫外灯照射过夜。本实施例采用软刻蚀工艺加工加工微流控芯片。

实施例3

微珠的处理：准确称取10mg玻璃微珠，用Piranha溶液浸泡过夜，用无菌超纯水洗涤5次，70℃干燥30min，加入2％APTES丙酮溶液反应1min，依次用丙酮和无菌超纯水清洗5次；

抗体工作液的制备：在10μL 1mg·mL^-1抗体工作液中加入50μLMES缓冲液、8μL4mg·mL^-1EDC(～2mmol·ml^-1)和12μL 4mg·mL^-1NHS(～2mmol·mL^-1)，室温反应15min后，加入120μL 0.1mol·L^-1PBS缓冲液终止NHS-抗体活化酯形成反应，即得到抗体浓度为50μg·mL^-1的抗体反应液。

微珠包被抗体：向抗体反应液中加入处理后的玻璃微珠，室温反应2h。反应完毕后用0.1mol·L^-1PBS清洗3次，得到经抗抗体修饰的免疫微珠，置于4℃备用。

对检测区通道进行清洗、1％小牛血清白蛋白(BSA)封闭15min，将经过抗体包被的微珠用微量注射泵以10μl·min^-1的流速正压驱动由入口6泵入检测区2，微珠进入到检测区后，使用PBS冲洗加压，保证微珠平铺于检测区，在加样孔中加入待测菌液，根据检测菌种加入相应兔一抗工作液，FITC标记的山羊抗兔荧光二抗工作液，待反应完成后，使用PBS冲洗过量未反应液体，从废液口1吸出过量液体，在荧光显微镜下观察芯片检测区，将观察结果用Image Pro软件分析其平均荧光显色浓度，根据标准曲线，判断待检菌浓度；将芯片置于便携式温箱中培养，便携式温箱尺寸50×30×30cm(见附图图2)中进行。

标准曲线的绘制方法为：首先使用已知的菌浓度加样，使用不同的菌浓度，以0.5MCF浓度相当于1.5×10⁸cfu/ml大肠埃希菌作为参考，将1.5×10⁸cfu/ml，1.5×10⁷cfu/ml，1.5×10⁶cfu/ml，1.5×10⁵cfu/ml，1.5×10⁴cfu/ml，1.5×10³cfu/ml，1.5×10²cfu/ml，1.5×10cfu/ml浓度的菌液分别加入到检测区，经过检测区后，冲洗过量未反应的菌液，使用荧光显微镜观察，将观察结果用Image Pro软件分析其平均荧光显色浓度，同一浓度菌液重复检测三遍，使用菌浓度作为横坐标，平均荧光显色浓度作为纵坐标绘制标准曲线(见附图图3)。

实施例4

按照实施例3的方法，经过荧光显微镜观察确定有一定浓度细菌存在的菌液，进行药敏试验。药敏实验时，将所述待测样品加样孔一侧的PVDF膜拔出，并在待测样品加样孔(6)泵入未染色的菌液，在药物加样孔(5)泵入药物，在稀释液加样孔(7)泵入无菌水，在浓度梯度发生器8中，自动形成浓度梯度。过量未反应的液体，从废液口9吸出。所述浓度梯度发生器8为“圣诞树”型，并包括个药敏培养池，其中n等于1、2、3、4……。当n＝5时，在浓度梯度发生器最终一列六个药敏培养池中，药物浓度比例分别是0:1:2:3:4:5(见附图图4)。细菌在不同浓度的处理下，经过约6小时的的培养，对其进行检测，得到药物作用后细菌的存活情况。根据药敏培养池的颜色深浅，即显色强度，来判断最低抑菌浓度MIC(见附图图5)。本发明的微流控芯片，在浓度梯度发生器中的任意一列都可观察MIC，相较于传统方法或者其他微流控药敏实验方法也更方便快速。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。