阅读说明：本技术 造血干细胞用于制备治疗病毒性疾病的制剂的应用 (Application of hematopoietic stem cells in preparation of preparation for treating viral diseases ) 是由 邹清雁 李时悦 姚继红 王斌 刘海霞 杜少茵 梁海燕 钟慧霖 丁先风 吴志君 朱 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及造血干细胞的新用途,尤其是涉及造血干细胞用于制备治疗病毒性疾病的制剂的应用。所述的病毒性疾病是选自：病毒性肝炎、流行性感冒、病毒性间质性肺炎、病毒性脑炎和禽流行性感冒。本发明所提出的造血干细胞的新用途对于治疗流感病毒性疾病可能具有较好的应用前景。(The invention relates to a new application of hematopoietic stem cells, in particular to an application of the hematopoietic stem cells in preparing a preparation for treating viral diseases. Said viral disease is selected from: viral hepatitis, influenza, viral interstitial pneumonia, viral encephalitis, and avian influenza. The new application of the hematopoietic stem cells provided by the invention has better application prospect for treating influenza virus diseases.)

造血干细胞用于制备治疗病毒性疾病的制剂的应用

技术领域

本发明涉及造血干细胞的新用途，尤其是涉及造血干细胞用于制备治疗病毒性疾病的制剂的应用。

背景技术

病毒感染引起的多种疾病，严重危害人类和动物的健康和生命。迄今，全世界已发现使人类致病的病毒1200多种，数万种病毒亚型和变异株。自二十世纪80年代以来，新发现的流行性传染病有三分之二是由病毒感染引起的，其中，发病率高，危害性大的病毒性疾病有A、B、C、D、E和G种肝炎病毒所致的急、慢性肝炎；8种人疱疹病毒引起的视网膜炎、角膜炎、间质性肺炎、脑炎、生殖器疱疹、带状疱疹和***部疱疹等；呼吸道病毒感染引发的支气管炎、肺炎、麻疹、腮腺炎和脊髓灰质炎等；肠道病毒所致的急性肠胃炎、旅行者和婴幼儿腹泻等；甲、乙型流感病毒和禽流感病毒常导致季节性全球或局部地区大流行。

2019年3月英国剑桥大学的研究人员宣布，全球第二例艾滋病患者被成功清除了HIV，这例患者的姓名尚未透露，被称为“伦敦病人”(HIV-1remissionfollowing CCR5Δ32/Δ32haematopoietic stem-cell transplantation Ravindra K.Gupta,Sultan Abdul-Jawad,Laura E.McCoy,Hoi Ping Mok,Dimitra Peppa,Maria Salgado,Javier Martinez-Picado,Monique Nijhuis,Annemarie M.J.Wensing,Helen Lee,PaulGrant,EleniNastouli,Jonathan Lambert,Matthew Pace,Fanny Salasc,ChristopherMonit,AndrewJ.Innes,Luke Muir,Laura Waters,John Frater,Andrew M.L.Lever,Simon G.Edwards,Ian H.Gabriel&Eduardo Olavarria Nature，volume 568,pages244–248(2019))。全球第一例成功治愈艾滋病的患者名为Timothy RayBrown，也被称为“柏林病人”，他在2007年治愈了艾滋病。

“柏林病人”和这名新的“伦敦病人”均接受了来自捐献者的干细胞移植治疗，而捐献者都携带一种罕见的基因突变，其HIV共受体CCR5为纯合子突变(CCR5Δ32/Δ32)。接受干细胞移植后，这些病人对HIV具有了抵抗力。根据《自然》文章，这名“伦敦病人”在停止服用抗逆转录病毒药物后病情已经缓解了长达18个月。

该研究的主要作者、英国剑桥大学医学系研究人员Ravindra Gupta表示，通过使用类似的方法在第2名患者中获得缓解，已经证明“柏林病人”并不是一个异常现象，而且这2例患者的治疗方法确实消除了HIV。

发明内容

本发明的目的在于提供造血干细胞的新用途，具体是造血干细胞用于制备治疗病毒性疾病的制剂的应用。所述的病毒性疾病是选自：病毒性肝炎、流行性感冒、病毒性间质性肺炎、病毒性脑炎和禽流行性感冒。

根据本发明所述的应用的进一步特征，所述的造血干细胞是从动物脐带血中提取的脐血单个核细胞，其造血干细胞(CD34和CD133细胞)比例应大于1％。

根据本发明所述的应用的进一步特征，所述的造血干细胞是从动物骨髓血中提取的骨髓血单个核细胞，其造血干细胞(CD34和CD133细胞)比例应大于1％。

根据本发明所述的应用的进一步特征，所述的造血干细胞是从幼年动物组织中提取的组织血中的单个核细胞，其造血干细胞(CD34和CD133细胞)比例应大于1％。

本发明的研究结果表明：干细胞治疗可能对病毒性疾病有效。本发明所提出的造血干细胞的新用途对于治疗流感病毒性疾病可能具有较好的应用前景。

具体实施方式

定义：在具体描述本发明时，有必要对本文中所要用到的某些术语进行定义和解释，以利对本发明的理解。

造血干细胞：造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。它们具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。捐献造血干细胞对捐献者的身体并无很大伤害。目前人的造血干细胞来源主要有四种：骨髓来源、外周血来源、脐带血来源、胎盘来源。动物来源更为广泛，如幼年动物的骨髓，脐带，肝、肾、肌肉组织或器官。

病毒性疾病：由病毒感染引起的疾病。常见病毒性疾病包括，流感、艾滋病、麻疹、风疹、天花流行性腮腺炎、风疹、麻疹、水痘、呼吸道病毒感染、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、其他肠道病毒感染、流行性乙型脑炎、流行性出血热等。

抗病毒化合物：是指一类对病毒性疾病有治疗或预防性作用的化合物，这类化合物包括正在研究的、开发中的和市售的化合物。这类化合物包括但不限于：干扰素类化合物、核苷类似物化合物等。此类化合物在本发明可以是一种或多种化合物组合使用，也可以是先后使用。

实施例一：脐带血造血干细胞的制备。

一、材料

1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，采血袋。

2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。

3、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。

4、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。

二、方法

1、细胞制备：在10ml脐带血中加入每管加10ml干细胞分离液。20℃以1500r/min离心15分钟，离心管中液体分为四层，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层。以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟，细胞计数。

2、细胞存活率分析：胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。

3、流式细胞仪检测：PBS洗涤细胞后，将PE-CD34，PE-CD133、PE-CD90，PE-CD44、PE-CD45、单克隆抗体分别加入PBS悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆克隆抗干细胞作为空白对照。

三、结果

所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上。

细胞计数：

注：本实验中，每离心管所加骨髓血量为10ml。

经计算后细胞计数结果，分离脐带血所获细胞数：每ml脐带血所获有核细胞数为3.46×10⁵个。

流式细胞仪检测表明，脐血单个核细胞(UC-MNCs)中CD34+、CD133+细胞比例应大于1.0％。

实施例二：骨髓血造血干细胞的制备。

一、材料

1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪，干燥箱，手套和手术衣。

2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。

3、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。

4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。

二、方法

1、将20ml骨髓加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻匀，常温离心机中以1500r/min进行离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞悬液按2：1比例缓慢加入到干细胞分离液中，20℃以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。

2、用罗丹明拒染实验鉴定骨髓干细胞

罗丹明染色步骤如下：新鲜分离的细胞以1×10⁶接种在培养板上培养2小时，加入1μg罗丹明123，37℃孵育1小时后，用PBS洗去细胞外罗丹明123，流式细胞仪观察罗丹明123在细胞内的分布情况。

三、结果

1、所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上。

细胞计数：

注：本实验中，每离心管所加骨髓血量为5ml。

经计算后细胞计数结果：每ml骨髓所获细胞数为1.80×10⁶个。

2、用瑞氏染色法鉴定，分离所得细胞主要为干细胞，细胞小，如红细胞大小，核染色深，胞质很少。

3、罗丹明123拒染试验结果

根据干细胞不主动吸收荧光染料罗丹明123的特点，可用罗丹明123拒染试验鉴定骨髓血中的干细胞。

结果显示：用干细胞分离液所得的罗丹明123拒染细胞比例为3.62％，干细胞分离液能有效地分离和富集骨髓血中的造血干细胞。

实施例三：新生小鼠骨髓造血干细胞的制备。

一、材料与方法

(一)材料

1、试剂和溶剂：

1)灭菌注射用水，生产单位：自制。2)生理盐水和Hank’s缓冲液；3)酒精；4)手术器械。

2、新生C57BL/6(CD45.1)健康小鼠，购自广东省实验动物监测中心。

(二)方法

选取新生的C57BL/6(CD45.1)健康小鼠，处死，酒精消毒，无菌条件下取出小鼠的骨髓细胞悬液，过滤后的细胞悬液在室温条件下500g离心5分钟，去掉上清后收集细胞，加入2mL红细胞裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟左右查看红细胞裂解情况，离心后重悬细胞清洗一遍，离心，收集细胞。

重悬细胞，加入抗体lineage cocktail(1：100)，Sca-1(1：100)，c-Kit(1：100)，4℃避光孵育30分钟；离心，去上清，重悬细胞后，40μm滤膜过滤细胞悬液。流式细胞仪分析LSK(Lin-Sca-1+c-Kit+)的造血干细胞。

二、结果：

1、10只新生小鼠造血干细胞，分离后细胞计数2.1×10⁷，冻存。

2、流式检测结果：CD34+细胞为3.99％，CD133+细胞为4.64％。

实施例四：胎大鼠肝脏造血干细胞的制备。

目的：从大鼠胚胎肝组织中分离肝中的造血干细胞

一、材料与方法

一)材料

1、试剂和溶剂：1)灭菌注射用水，生产单位：自制。2)生理盐水和Hank’s缓冲液；3)酒精；4)手术器械

2、试验动物和饲养条件

2.1试验动物：SPF级SD大鼠；6-8周龄；130～200g，7只，雌性孕鼠。广东省实验动物监测中心；

3、主要仪器：电子天平：METTLER TOLEDO AB104S，冰冻切片机：Leica，CM1900，生物荧光显微镜：Leica，DM5000B，全自动生化分析仪：BeckmanCounter CX5，台式高速低温离心机：Eppendoff Centrifuge 5804R，细胞计数器：Invitrogen,Countess.，酶标仪：Thermas,Multiscan FC。

二)方法

1、怀孕二周左右SD大鼠，杀死后取胎鼠肝脏，在无菌条件下分离出肝组织，称重；按1：2加入DMEM培养基，组织剪碎，离心。

2、胎肝组织，先用0.01％胶原酶消化1小时，再用0.1％的胰酶消化20～40min终止消化，40目筛网过滤制成单细胞悬液，活细胞计数。

3、HSCs用冻存液(体积分数为90％的DMEM/F12,10％的DMSO)混悬后，匀速降温，最后冻存于液氮中。在4周、24周后分别复苏，计数活细胞比例和流式细胞学研究。

二、结果

1、肝组织湿重为1.95g/10只胎大鼠。

2、分离细胞计数，细胞总数为0.4×10⁶个。

3、冻存细胞复苏后存活率为93％，流式细胞检测CD133细胞比例为2.3％和CD34细胞比例为3.6％。

实施例五：小猪骨髓造血干细胞的制备。

一、材料

1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪，干燥箱，手套和手术衣。

2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)，罗丹明123(Sigma公司)。

3、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干细胞计数试剂盒，批号：NO.340498)。

4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。

5、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。

6、实验用的猪均为新生蕨麻猪，雄性，体重0.5kg，由广州市芳村屠宰场提供。

二、方法

1、实验猪进行骨髓抽取手术，其步骤如下：

按每公斤实验猪体重使用30mg/kg量的戊巴比妥钠，对实验猪进行腹腔麻醉，对所有手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒，用电推剪将实验猪腿部体表的毛发剪去，用75wt％酒精对实验猪进行体表消毒，铺巾，利多卡因局部麻醉后抽取猪髂骨内骨髓30ml。

2、骨髓成功抽取后按以下方法分离猪骨髓细胞：

将骨髓加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻匀，常温离心机中以1500r/min离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，得细胞悬液。

将细胞悬液按2：1比例缓慢加入干细胞分离液中，20℃以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。

3、用罗丹明拒染实验鉴定猪骨髓干细胞

罗丹明染色步骤如下：新鲜分离的细胞以1×10⁶接种在培养板上培养2小时，加入1μg罗丹明123，37℃孵育1小时后，用PBS洗去细胞外罗丹明123，流式细胞仪观察罗丹明123在细胞内的分布情况。

4、用干细胞计数试剂盒和流式细胞仪鉴定猪骨髓干细胞

将新鲜分离的细胞加入Eppendoff管(106细胞/管)，以1500rpm转速离心5分钟，PBS洗1次，加入冷丙酮1ml，0-4℃固定8分钟；离心，弃上清后加入一抗(CD34、CD45)，混匀后37℃反应45分钟，1500rpm转速离心10分钟，PBS洗3次，离心弃上清后加入带二抗标记的IgG，混匀后37℃反应30分钟，PBS洗涤两次，离心后视沉淀物的量加入PBS，制备成细胞悬液，流式细胞仪进行检测。

三、结果

1、所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上，细胞计数：

2、罗丹明123拒染试验结果

根据干细胞不主动吸收荧光染料罗丹明123的特点，可用罗丹明123拒染试验鉴定骨髓血中的干细胞。

3、用干细胞标志试剂盒和流式细胞仪鉴定猪骨髓干细胞的结果

干细胞标志试剂盒主要用于鉴定骨髓造血干细胞，其中CD34用于标志造血干细胞，CD45用于标志淋巴细胞，PI主要用于标志有核细胞。

经流式细胞仪测定，经干细胞分离液所得细胞悬液中CD34、CD45和有核细胞比例见表1。

表1：细胞分离液分离猪骨髓细胞各种标志的细胞比例

管1为淋巴细胞分离液。管2-3为干细胞分离液。

结果提示：用比重为1.086的干细胞分离液所得的CD34阳性细胞数比淋巴细胞分离液所得的CD34阳性数多12倍。

4、细胞经培养1-7天，在相差显微镜观察，结果如下：新鲜分离的的骨髓单个核细胞呈圆球状分散悬浮于培养液中，有少量造血细胞。换液去除非黏附细胞后，留下来的细胞的形态大多和骨髓基质细胞接近，贴壁生长，呈梭形。

非黏附细胞经离心换液，继续培养7天，可见成团细胞生长。其中以干细胞分离液所得的细胞，细胞成团生长活跃。

四、结论

骨髓血分离纯化的细胞相对外周血较少，分离过程相对复杂，显微镜下观察细胞大小均匀，折光性好。

采用干细胞分离液可成功分离猪骨髓造血干细胞，骨髓血2.7×10⁸，细胞流式检测结果提示造血干细胞为CD34+细胞为2.37％，CD133+细胞为1.73％，比例可达1％以上。

实施例六：小猪肝脏造血干细胞的制备。

1、实验目的：对比不同分离方法、酶、分离液分离新生乳猪肝中造血干细胞。

2、实验器材：2ML移液管、50ML离心管、DMEM/F12、PBS、Ⅱ型胶原酶、胰酶、DNA酶、蛋白酶、聚乙烯吡咯烷酮、分离液。

3、实验步骤：

3.1分离

将新生乳猪在无菌条件下分离出肝组织，按1：2加入DMEM培养基，组织剪碎，离心。

3.1.1手动法：取组织，称重。用剪刀剪碎约0.1mm3，按1：10加入PBS(可同时加入胰酶或胶原酶)，250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS洗三次；收集组织备用。

3.1.2电动机械法：取组织，称重。按1：10加入PBS(可同时加入胰酶或胶原酶)，用组织绞碎机或匀浆机，7000转/分钟，匀浆1分钟。匀浆液250g离心5分钟，去上清，沉淀用0.1M/L的PBS洗三次；收集组织备用。

3.2消化

3.2.1胶原酶、胰酶消化

3.2.1.1 250g离心5分钟，沉淀用10倍体积的0.01％的胶原酶37℃消化30分钟，收集细胞，细胞计数和存活率检测。

3.2.1.2洗涤，再用10倍体积的0.01％的胰酶消化30分钟，观察消化效果；PBS洗涤3次，收集细胞，40目筛网过滤制成单细胞悬液，计数和存活率检测。

3.2.2多酶消化

采用10倍体积的0.1MPBS液将沉淀洗出，加0.01％胶原酶，0.02％的蛋白酶K，0.005％的DNA酶37℃消化30分钟，分时观察消化效果。

3.3纯化

50ml离心管中分别加入干细胞分离液中，取上述细胞按1×10⁷/ml细胞悬浮液约10ml，小心加至分离液之上(分离液：细胞悬液为1：1)，离心，取分离液与上清液界面的细胞，用0.1MPBS液洗涤3次，细胞计数并冻存。

3.4冻存细胞复苏

将体外传代培养的细胞用冻存液(体积分数为90％的DMEM/F12、10％的DMSO)混悬后，匀速降温，最后冻存于液氮中。在4周、24周后分别复苏，计数活细胞比例。

4、结果：所获得小猪肝脏重量为13.58g，分离获得总细胞量：肝脏中单个核细胞总数为1.9×10⁷，其中提示造血干细胞为CD34+细胞为2.69％，CD133+细胞为1.43％。

实施例七：新生小鸡的骨髓造血干细胞的制备。

目的：从新生小鸡骨髓组织中分离造血干细胞

一、材料与方法

(一)材料

1、试剂和溶剂：

1)灭菌注射用水，生产单位：自制。2)生理盐水和Hank’s缓冲液；3)酒精；4)手术器械。

2、新生健康小鸡，购自广东省白云养鸡场。

(二)方法

选取新生的健康小鸡三只，处死，酒精消毒，无菌条件下取出骨髓细胞悬液，过滤后的细胞悬液在室温条件下500g离心5分钟，去掉上清后收集细胞，重悬细胞，40μm滤膜过滤细胞悬液，计数造血干细胞的存活率。

(三)结果

三只小鸡骨髓血的单个核细胞总数为1.2×10⁸，流式细胞检测未检出CD34和CD133细胞，可能与鸡的造血干细胞表面标志物成分不一样有关。

实施例八：脐带血造血干细胞抑制鸭体内乙肝病毒复制的实验研究

原理：鸭乙型肝炎是鸭自然感染的肝炎模型，能导致慢性肝炎和肝硬化。通过检测鸭血清的HBsAg、HBeAg和HBV DNA的含量，可以测定药物的抗病毒活性。本实施例用脐带血造血干细胞鸭体内移植，观察它们对乙肝病毒的抑制作用。

1、材料与方法

1.1试剂：32P-dCTP和缺口翻译试剂盒(Promega公司产品)；鱼精DNA、牛血清白蛋白(Sigma公司产品)。

1.2动物：雌性麻鸭，6只，购自自由市场；1日龄北京鸭，购自广东省广州市力康农工商联合公司。

1.3筛选阳性血清：6只麻鸭，在无菌条件下抽血，分离血清。常规PCR反应，结果有3只麻鸭PCR扩增结果呈阳性，出现3条阳性条带，阴性对照未出现阳性条带。选取病毒滴度较高的麻鸭血清作为阳性血清，备用。

1.4制备鸭乙肝模型：取阳性鸭血清感染1日龄麻鸭。于孵化当日取100只健康雏鸭，其中95只每只经腿静脉注射100μl阳性鸭血清，5只不处理作为正常对照组。鸭乙肝感染率检测：于感染后第2周静脉采血，PCR法检测DHBV。结果感染DHBV阳性血清的95只鸭有60只阳性，5只正常对照鸭全部阴性。鸭乙肝模型造模成功。选择病毒血清滴度大于10000的30只麻鸭进行试验。

1.5将30只阳性鸭分成3组，分组情况如下表2：

表2：实验分组情况

拉米夫定	-	+	-
				干细胞组	-	-	+
动物数	10	10	10

注：“+”表示加相应的药物，“-”表示不加相应的药物。

于感染后第2周开始治疗，连续治疗8周后半定量PCR法检测鸭乙肝病毒滴度变化情况。

1.6PCR反应：取5μl鸭血清加50μl裂解液，100℃煮沸10min，快速离心后置于冰上，作为模板待用。常规PCR反应，以阳性血清为阳性对照，每次反应共设5个阳性对照，空白对照含有RT-PCR所需的所有成分，但不加模板。

1.7凝胶电泳分析：PCR反应产物用琼脂糖凝胶分离，结果在多功能成像分析系统上进行定量分析。

1.8病理学检查：肝组织常规石腊切片，HE染色，观察肝脏的组织形态学、炎症程度和变性程度。

1.9统计分析所有结果均用SPSS统计软件包进行统计分析，P<0.05判断为差异有显著性。

2、结果

2.1拉米夫定和干细胞治疗后，同对照组相比，干细胞组和拉米夫定组肝细胞变性和炎性均明显减轻。

2.2拉米夫定和干细胞治疗前后鸭体内病毒滴度变化结果见表3。

表3：拉米夫定和干细胞治疗对鸭体内乙肝病毒滴度的影响(n＝10，χ±SD)

拉米夫定	-	+	-
				干细胞	-	-	+
DHBV滴度	12867.6±4023.1	3896.4.2±1108.7**	8879.6±2367.9*

注：“+”表示加相应的药物，“-”表示不加相应的药物。

*表示p<0.05；**表示p<0.05(同生理盐水组比较)。

结果表明：治疗结束后，拉米夫定治疗组有低滴度DHBV，干细胞治疗后，鸭血清中DHBV滴度有一定的下降，但抗病毒效果不如拉米夫定治疗组。

3、结论

3.1拉米夫定和干细胞治疗均能明显减轻鸭乙型肝炎的病理改变。

3.2脐血干细胞治疗对鸭乙肝病毒有一定的抑制作用，但作用不如拉米夫定的明显。

实施例九：脐带血造血干细胞对小鼠肝炎病毒感染的治疗作用

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)是常见的小鼠感染病原。MHV是冠状病毒科冠状病毒属成员，基因组为单链RNA。MHV常作为冠状病毒的研究模型。

脐带血干细胞是近年来的研究热点，有巨大的临床应用价值。

一、材料与方法

1、动物的分组和干细胞的干预

使用SPF级NIH雌性小鼠，平行进行3组实验。将动物随机分成3组，每组20只。一组作为对照组，仅感染MHV；一组作为治疗组1，在干细胞干预前3天，每天注射一次干细胞悬液，连续进行3天，然后进行MHV的感染；一组作为治疗组2，MHV感染后再注射干细胞悬液。感染24小时之后第一次注射，每隔24小时进行一次，共进行3次。注射方式为尾静脉，每只50微升干细胞悬液。小鼠感染MHV剂量为0.2ml腹腔接种，病毒含量约为106TCID50。

说明：该次预实验主要是评估干细胞对MHV感染后小鼠死亡率的改善，因此干细胞的剂量和使用次数尽量多一些。细胞悬液设置为高浓度，10⁸/ml甚至更高。注射的次数设为3次。

2、观察指标

前期的研究表明，NIH小鼠感染MHV后，第4-6天死亡率较高，7天以后没有小鼠死亡。观察3组小鼠的临床表现和死亡率，干细胞对于小鼠感染MHV后的死亡率有改善，关键在感染后前7天。

二、实验结果

感染病毒后第8天，对照组死亡9只，感染病毒后注射干细胞组死亡6只。提前注射干细胞组无死亡。感染后第9，10，11，12天观察无死亡。

三、结论

本研究中动物感染病毒后第8天动物死亡，感染病毒后干细胞注射有保护动物作用，提取注射干细胞能够保护动物抵抗病毒感染。后续连续观察没有死亡现象。本研究可以观察到干细胞对动物感染病毒的良好保护作用，但是需要进一步重复实验确认该效果。

实施例十：脐带血造血干细胞对感染流感病毒的小鼠保护作用

1、目的：测试干细胞对感染流感病毒的小鼠保护作用。

2、材料

病毒：A/PR8/34(H1N1)。

脐带血干细胞及对照细胞(间充质干细胞)：由广州吉帝生物科技有限公司提供。

细胞：狗肾上皮细胞系(Madin-Darby Canine Kidney Cells，MDCK)。

3、方法

选择6周龄的SPF级BALB/C雄性小鼠90只，随机分五组，正常对照组、病毒组、高、低剂量组(脐带血干细胞，按1.0×10⁷/kg和1.0×10⁸/kg于0.2ml生理盐水中尾静脉注射)、对照细胞组(间充质干细胞按1.0×10⁸/kg于0.2ml生理盐水中尾静脉注射)。除正常对照组外，麻醉后滴鼻感染流感病毒，其余组别同法滴入等量培养基。感染第3天进行治疗，尾静脉注射干细胞或对照细胞(一个剂量一个给药时间点)。

3.1死亡保护作用

连续观察小鼠15天，每天记录实验动物体重及死亡数等，根据结果计算存活率和平均存活时间。

3.2肺病理的检测

在感染后的第5天一半小鼠收集肺组织，进行肺指数的计算和肺病理切片的制作，用于评价感染模型肺炎症的情况。未进行支气管肺泡灌洗的肺组织取出后，用生理盐水冲洗表面血迹，用4％多聚甲醛固定24小时，随后用PBS冲洗多聚甲醛，再用4％蔗糖溶液固定24小时。石蜡浸泡包埋，切片行HE染色(此过程是由机器自动完成)。光学显微镜下观察建模后肺组织的损伤程度，炎症细胞浸润等情况，并用数码摄影一体化系统保存图片。

3.3肺组织病毒滴度检测

取出肺组织放在高温高压灭菌消毒的EP管中，加入1mL冷冻的PBS液体，电动匀浆仪匀浆肺组织(冰上操作)，离心3000转，5分钟，取上清。加入含2倍青霉素、链霉素、两性霉素以及1.5μg/mL TPCK-treated胰酶的MEM培养基，10倍梯度稀释上清液，加入预先准备好的96孔板的MDCK细胞中100μL/孔稀释液，48小时后观察细胞病变，用Reed-Muench法计算TCID50。

4、结果

4.1脐血干细胞对流感病毒感染小鼠肺重量的影响：结果见表4。

表4：对流感病毒感染小鼠肺指数的影响

组别	剂量	n	肺指数，g/10g体重	抑制率(％)
					正常对照组	-	10	0.80±0.09	-
病毒组	-	20	1.31±0.26<sup>#</sup>	-
					高剂量组	1.0×10<sup>7</sup>/kg	20	0.91±0.05<sup>＊＊＊</sup>	30.5
低剂量组	1.0×10<sup>8</sup>/kg	20	0.98±0.06<sup>＊＊</sup>	25.2
					对照细胞组	1.0×10<sup>8</sup>/kg	20	1.09±0.08<sup>＊，○</sup>	16.8

注：^#P＜0.001，表明造模成功；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001；与高剂量组比较，○P＜0.01。

表4结果提示：脐带血干细胞中、高剂量均能显著降低流感病毒感染小鼠的肺指数(P<0.01～0.001)，与间充质干细胞比较，也有显著的差异(P<0.01)。

4.2对流感病毒感染小鼠的死亡保护作用：结果见表5。

表5对流感病毒感染小鼠的死亡保护作用

组别	n	死亡数	死亡率(％)	平均存活天数
					正常对照组	10	-	-	>14
病毒组	20	17	85<sup>#</sup>	6.8
					高剂量组	20	3	15<sup>＊＊＊</sup>	9.42
低剂量组	20	11	55<sup>＊＊</sup>	8.26
					对照细胞组	20	10	50<sup>＊</sup>	9.08

注：与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.001。

表5结果提示，脐带血干细胞高剂量组可显著地降低流感病毒感染小鼠死亡率(P<0.05)，并可延长病鼠存活天数，效果优于低剂量组和间充质干细胞组，有明确的量效关系。

5、结论：脐带血干细胞可明显降低流感病毒感染小鼠死亡率(P<0.05)，并可延长病鼠存活天数，对流感病毒引发的肺部炎症和肺指数也有明显的降低作用。

实施例十一：猪造血干细胞对猪流行性感冒及重症肺炎的治疗作用

1、目的：观察猪造血干细胞对猪流行性感冒及重症肺炎的疗效观察。

选择发生流行性感冒并发重症肺炎的公猪24头，应用猪造血干细胞进行治疗，观察其治疗效果。

2、材料和方法

2.1猪造血干细胞制备，见本专利实施例五，由广州熙帝生物科技有限公司制备。

2.2诊断和分组

佛山某猪场发生猪流感，病猪出现不食，精神不振，不走动，体温上升，呼吸加快等症状。120多头公猪鼻液浓绸，带有铁锈色，呼吸音***，偶尔可听见咳嗽，胸部听诊有啰音。根据临床症状、流行病学调查，选用体重在100-150公斤确诊为猪流行性感冒及致发性重症肺炎混合感染的公猪36只，进行分组治疗，其中干细胞治疗组12只，在普通的中药治疗基础上加用猪造血干细胞治疗，高剂量组12只，静脉注射，剂量为1.0×10⁷/kg体重，低剂量组12只，静脉注射，剂量为1.0×10⁶/kg体重。对照组，普通中药治疗，双黄连注射液，河南福森药业有限公司生产；

试验方法：将病猪进行隔离治疗，36只公猪用大尼龙绳猪上鼻甲骨绑定。干细胞高剂量组，公猪12只，用猪造血干细胞，剂量为1.0×10⁷/kg体重加入生理盐水100ml中进行静脉注射+双黄连注射液50ml，静脉注射，1次。干细胞低剂量组，公猪12只，用猪造血干细胞，剂量为1.0×10⁶/kg体重加入生理盐水100ml中进行静脉注射+双黄连注射液50ml，静脉注射，1次。对照组，只用双黄连注射液50ml，静脉注射，1次。

2.3治愈疗效标准：体温正常，食欲正常，呼吸道症状消失，无浓稠鼻液流出为治愈。

3、结果：猪造血干细胞对猪流行性感冒及重症肺炎的疗效观察，见表6。

表6：猪造血干细胞对猪流行性感冒及重症肺炎治愈的疗效观察(治愈数)

	N	第二天	第三天	第四天	第八天	治愈数	治愈率％
								高剂量组	12	4	6	2		12	100<sup>**</sup>
低剂量组	12		6	4	1	11	92<sup>*</sup>
								对照组	12		2	4	3	9	75

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.001。

从表6可知，干细胞可以促进猪流行性感冒及重症肺炎治愈，高低剂量组分别为100％和92％，相比对照组75％有显著性差异，并能加速猪流行性感冒的恢复。

4、结论：干细胞可以促进猪流行性感冒及重症肺炎治愈，并能加速猪流行性感冒的恢复。

实施例十二：脐带血干细胞对老年人流行性感冒及重症肺炎的治疗作用

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，经飞沫传播，临床典型表现为突起畏寒、高热、头痛、全身酸痛、疲弱乏力等全身中毒症状。流行病学最显著的特点是突然爆发、迅速蔓延、波及面广。流感常会在起病后2～4天或恢复期病情加重，出现高热、剧烈咳嗽、脓性痰、呼吸困难，肺部湿性啰音。婴幼儿、老年人、有心肺疾病及其他慢性疾病患者或免疫功能低下者可并发肺炎，预后较差。

1、材料和方法

1.1一般资料

收集符合临床流感重症诊断标准的住院患者140例；其中男74例，女66例；年龄60～83岁，平均69岁。有流感高危因素的患者121例，占86.43％，其中有呼吸系统、心血管系统等慢性疾病者62例；肥胖者12例。以随机数字表法分为干细胞组(治疗组)70例、综合治疗组(对照组)70例。

治疗组中男35例，女35例；年龄66～83岁，年龄中位数71岁；对照组中男39例，女31例；年龄60～82岁，年龄中位数70岁，性别与年龄组间均衡。

1.2诊断标准

1.2.1流行性感冒重症诊断：

符合《流行性感冒诊断与治疗指南(2018年版)》^[1]中流行性感冒的诊断，同时具备以下重症标准^[1]之一：①呼吸频率快,呼吸困难，***紫绀；②反应迟钝、嗜睡、躁动、惊厥等神智改变；③严重呕吐、腹泻，出现脱水表现；④影像学检查有肺炎征象；⑤肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等心肌酶水平迅速增高；⑥原有基础疾病明显加重。

1.2.2流感继发细菌性肺炎诊断^[1]

流感重症患者持续高热>3天，伴剧烈咳嗽、脓性痰、呼吸困难，肺部湿性啰音及肺实变体征；下述任一检测指标超出正常值上限，可认为发生继发细菌性肺炎：①外周血白细胞总数；②外周血中性粒细胞；③C反应蛋白。

1.3纳入标准

符合流感细菌性肺炎诊断标准，年龄≥60岁；同意参加干细胞临床研究，并签署知情同意书者。

1.4排除标准

精神疾患者。近1个月参加其他流感药物临床研究者。符合危重症诊断标准之一：呼吸衰竭；感染中毒性休克；多脏器功能不全；出现其他需进行监护治疗的严重临床情况。妊娠妇女。

1.6治疗方案

1.6.1对照组

参照《甲型H1N1流感诊疗方案(2010年版)》^[2]《流行性感冒诊断与治疗指南(2018年版)》^[1]进行综合治疗，包括抗病毒(奥司他韦)和对症支持，根据患者病情选用不同抗生素(青霉素，阿齐霉素，左氧氟沙星，阿莫西林，头孢克洛)等。

1.6.2治疗组：在综合治疗的基础上加用脐血干细胞(2×10⁶/kg体重，加入100ml生理盐水中静脉滴注)治疗。

1.7观察指标

检测肺部X光、血常规和C反应蛋白，以判断继发细菌性肺炎情况；记录抗流感病毒药物的使用情况。

1.8统计学方法

建立中心数据库录入系统，由双人分别录入资料，核定数据的准确性。运用SAS9.1.3统计软件进行数据分析，计数资料以频数和百分比描述,采用秩和检验，P≤0.05为差异有统计意义。

2、结果

2.1二组抗流感病毒药物使用情况比较

治疗组70例患者中，46例使用了抗病毒药物，占65.71％；对照组70例中54例使用，占77.14％。2组比较差异无统计学意义。说明2组患者抗病毒治疗水平一致。

2.2二组继发细菌性肺炎情况比较

140例重症流行性感冒患者中，发生继发细菌性肺炎48例，占34.28％。治疗组70例患者中，发生细菌性肺炎9例，占12.86％，对照组70例中，发生细菌性肺炎26例，37.14％。2组细菌性肺炎发生率比较，差异有统计学意义(p<0.01)。

3、结论

干细胞治疗可以促进重症流感的恢复，减少并发性肺炎的发生率。

[1]流行性感冒诊疗方案(2018年版)[J].中国感染控制杂志，2018，02：181-184。

[2]甲型H1N1流感诊疗方案(2010年版)[J].国际呼吸杂志，2011，31(2)：81-84。

实施例十三：脐带血干细胞对儿童病毒性脑炎的治疗作用

病毒性脑炎是儿科常见的一种颅内感染疾病，由病毒感染诱发的脑实质炎症，起病急，进展快，通常是由虫媒病毒、肠道病毒、风疹以及单纯疤疹病毒引发的，严重时威胁生命安全，或者遗留后遗症(陈勇，吴华平，小儿病毒性脑炎的诊断与治疗[J].实用儿科临床杂志，2012，27(24)：385一402)。本研究在小儿病毒性脑炎的治疗过程当中，联合使用脐血干细胞和更昔洛韦，效果如下。

1、材料和方法

1.1一般资料

收集2013年1月一2015年1月广东三九脑科医院收治的小儿病毒性脑炎患儿32例，男30例，女，2例，年龄，3个月至11岁，平均(7.3士0.6岁)。临床表现为发热5例，头痛19例，呕吐8例，惊厥17例，意识障碍6例，脑膜刺激征13例。

将32例患儿随机分为对照组和干细胞组，各16例。2组患儿在年龄、性别以及病情等方面的差异无统计学意义，有可比性。

1.2方法

两组患儿均予以常规治疗，包括抗感染、补液维持水电解质平衡，同时给予止惊、退热以及降颅压等方面的对症治疗，如果存在高热、抽搐或者意识障碍，口服***和更昔洛韦，实验组加用脐血干细胞(2×10⁶/kg体重，加入100ml生理盐水中静脉滴注)治疗。

1.3疗效评价标准根据***颁布的常见病质量控制标准进一步制定患儿的疗效评价标准。

显效：患儿的症状以及体征消失，可以恢复正常的工作或者料理生活

有效：患儿的症状以及体征减轻，但仍存在一定程度的体征以及残留症状；

无效：患者的症状以及体征无明显改善。

以显效以及有效统计患儿的治疗有效率。

1.4统计学方法

将所检测的数据用统计学专业软件数据包SPSS26.0进行分析。

2、结果

在两组患儿的治疗效果方面见表7.

表7：两组患儿症状及体征改善时间比较

组别	例数	退热时间(天)	惊厥控制(天)	恢复意识清醒(天)
					对照组	16	3.6±0.75	7.2±2.3	14.6±2.8
干细胞组	16	2.3±0.6	3.2±1.2	6.5±2.1
					P值	_	<0.05	<0.01	<0.01

对照组患儿显效4例，有效3例，无效9例，有效率为43.75％，干细胞组显效10例，有效5例，无效1例，有效率为93.75％，干细胞组的有效率显著优于对照组，差异有统计学意义(p<0.01)。

3、结论：脐血干细胞联合更昔洛韦治疗小儿病毒性脑炎的疗效确切。