一类靶向型开环葫芦脲及其制备方法
阅读说明：本技术 一类靶向型开环葫芦脲及其制备方法 (Targeting type ring-opening cucurbiturils and preparation method thereof ) 是由 杨波 朱盼永 张亚洲 孔令广 赵榆林 廖霞俐 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类靶向型开环葫芦脲及其制备方法,其包含靶向型基团和不对称开环葫芦脲,本发明靶向型开环葫芦脲化合物以卤素修饰后的不对称开环葫芦脲和生物素、叶酸发生反应而制得；与开环葫芦脲相比,本发明靶向型开环葫芦脲具有特异性靶向于肿瘤细胞的能力,能在肿瘤细胞表面富集,增加细胞摄取,且该类靶向型开环葫芦脲具有C型可调节的柔性空腔可以根据客体药物分子的大小进行调节,与客体药物分子形成很好的空腔匹配,进而极好的增加客体药物分子的水溶性,便于客体药物液体制剂的制备；本发明对于靶向抗肿瘤药物新型制剂的开发,具有潜在的应用价值。(The invention discloses a targeting ring-opened cucurbituril and a preparation method thereof, wherein the targeting ring-opened cucurbituril comprises a targeting group and an asymmetric ring-opened cucurbituril; compared with the open-loop cucurbituril, the targeted open-loop cucurbituril has the capability of specifically targeting tumor cells, can be enriched on the surfaces of the tumor cells and can increase the cell uptake, and the targeted open-loop cucurbituril has a C-type adjustable flexible cavity which can be adjusted according to the size of a guest drug molecule and can form good cavity matching with the guest drug molecule, so that the water solubility of the guest drug molecule is increased greatly, and the preparation of a guest drug liquid preparation is facilitated; the invention has potential application value for the development of novel targeted antitumor drug preparations.)
技术领域
本发明属于化学合成、新材料制备、制药和药物制剂技术领域，具体涉及一类靶向型开环葫芦脲及其制备方法。
背景技术
超分子化学是近些年来发展比较迅速的前沿学科，其中超分子主体分子与其他分子间的自组装和识别是超分子化学研究的最主要的内容。常见的超分子主体有开环葫芦脲、冠醚、环糊精、葫芦脲等；这些主体分子大多具有疏水性空腔能够用于封装小分子物质，形成主客体体系。
开环葫芦脲是近十年来发展比较迅速的一类新型超分子主体，其中心甘脲低聚物赋予曲率且具有结合疏水性阳离子的能力；两端对苯(或)萘二酚衍生物能促进容器和难溶性物质之间的π-π相互作用；侧基上的磺酸基等具有增溶作用；空腔结构类似于C字型，可以柔性调节以适应不同大小的客体分子。2009年Isaccs教授在第238届美国有机化学年会上首次报到了开环葫芦脲类分子。之后该课题组及其他课题组对这类分子的合成及衍生化、药物传输、分子识别、药物增溶等进行详细的研究。
生物素(Biotin)和叶酸(Folic-Acid)由于它们的受体在许多癌细胞中过度表达，包括肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞等，并且在正常组织细胞中很少表达。因此，生物素和叶酸作为一类有前途的靶向配体被引入用于靶向递送药物，其靶向能力能减少药物对正常细胞的副作用，提高药物对癌细胞的杀伤作用。最后，靶向制剂能在药物传输系统中确保药物载体能够稳定地将药物输送到作用部位。
靶向型开环葫芦脲主体化合物具有主动靶向能力和识别能力，可以作为超分子载体，因其柔性可调节的C型空腔在作为载体时必然具有负载率高的优势，因此，开发新的具有靶向能力的开环葫芦脲主体化合物具有重要的研究及其应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种简便、快捷、能够广泛应用的靶向型开环葫芦脲化合物，其结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ所示：
式Ⅰ
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)nCO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，m＝1～4；
式Ⅱ
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，m＝1～4；
式Ⅲ
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，m＝1～4；
式Ⅳ
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，m＝1～4；
本发明所述的靶向型开环葫芦脲既具有开环葫芦脲的分子砌块、极好的分子识别能力又具有生物素或叶酸的靶向功能；该类化合物包括具有靶向功能的生物素或叶酸以及可以容纳客体药物分子的开环葫芦脲，并且开环葫芦脲的C型柔性空腔具可调节性质能特异性识别含氮客体，最终使得该化合物既有靶向能力又具有分子识别能力，可以作为超分子靶向载体及分子识别机器，可以很好的应用于制药、医疗、临床诊断、识别检测、化工催化等行业。
上述靶向型开环葫芦脲化合物的制备方法如下：
(1)将边臂含有卤素的开环葫芦脲与含有羧基的生物素或叶酸加入含无机碱的有机溶剂中进行反应，反应温度为40～100℃，反应时间为12～48h，其中边臂含有卤素的开环葫芦脲:含有羧基的生物素或叶酸的摩尔比为3:3～3:10，边臂含有卤素的开环葫芦脲与无机碱的摩尔比1:20～40；
所述无机碱包括但不限于是碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾；有机溶剂包括但不限于是丙酮、四氢呋喃、乙醇、醋酸酐、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜；
所述边臂含有卤素的开环葫芦脲是参照申请号202011024044.X“一类开环葫芦脲环糊精双主体化合物及其制备方法”中的方法制得；
(2)反应完成后冷却至室温，把反应液滴入溶剂中产生沉淀，过滤，重结晶，固体用适量水溶解后，再用透析袋透析24～48h，透析液过0.45μm微孔滤膜得滤液，滤液经冷冻干燥即得靶向型开环葫芦脲化合物；
使反应液析出沉淀的溶剂为丙酮、四氢呋喃、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
上述靶向型开环葫芦脲化合物反应工艺过程如下：
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，R1为Cl、Br、I，m＝1～4；
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，R1为Cl、Br、I，m＝1～4；
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，R1为Cl、Br、I，m＝1～4；
其中R为(CH2)nSO3Na、(CH2)nSO3H、(CH2)n CO2Na或(CH2)nCO2H，n＝1～5，R1为Cl、Br、I，m＝1～4；
本发明另一目的是将上述靶向型开环葫芦脲化合物应用在作为靶向载体中。
本发明提供的靶向型开环葫芦脲及其制备方法，其反应合成步骤简单，操作更加简便安全和高效，易于操控，合成得到的产品纯度高，品质优良，适合工业化生产应用；且该类化合物可作为超分子载体、超分子催化剂，与客体物质匹配形成多分子体系，本发明对于抗肿瘤药物新型靶向制剂的开发，具有潜在的应用价值，可以很好的应用于制药、医疗、临床诊断、识别检测、化工催化等行业。
附图说明
图1是实施例1靶向型开环葫芦脲化合物1(R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1)的高分辨质谱(HR-MS)图；
图2是实施例2靶向型开环葫芦脲化合物2(R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2)的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图3是实施例3靶向型开环葫芦脲化合物3(R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1)的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
图4是实施例4靶向型开环葫芦脲化合物4(R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2)的傅里叶红外光谱(FT-IR)图；
图5是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在肝癌细胞(HepG2)上的倒置荧光显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B；
图6是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在肝癌细胞(HepG2)上的激光共聚焦显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B；
图7是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在肺癌细胞(A549)上的倒置荧光显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B；
图8是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在肺癌细胞(A549)上的激光共聚焦显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B；
图9是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在人的正常肝细胞(LO2)上的倒置荧光显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B；
图10是负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1～4，负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物和游离罗丹明B在人的正常肝细胞(LO2)上的激光共聚焦显微镜下的细胞摄取图，其中a图靶向型开环葫芦脲化合物1，b图是靶向型开环葫芦脲化合物2，c图是靶向型开环葫芦脲化合物3，d图是靶向型开环葫芦脲化合物4，e图是不具有靶向功能的开环葫芦脲化合物，f图是游离罗丹明B。
具体实施方式
本发明实施例公开了一类靶向型开环葫芦脲及其制备方法。本领域内技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的产品和方法已经通过说明书特别是实施例进行了描述，本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了更进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：靶向型开环葫芦脲-化合物1结构式如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1；
上述靶向型开环葫芦脲化合物1的制备方法如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1，R1为Br；
(a)分别称取卤素修饰的开环葫芦脲(1mmol)和生物素(1mmol)加入150mL的圆底烧瓶中，随后加入碳酸钠和四氢呋喃的混合溶液，其中卤素修饰的开环葫芦脲与碳酸钠的摩尔比1:20，然后在60℃下搅拌反应24h；待反应完全后冷却至室温，将反应液倒入丙酮中析出沉淀，抽滤；固体用55℃水溶解澄清后，趁热滴加甲醇至有产物沉出，静置冷却后抽滤，得白色固体，再将白色固体溶于水用透析袋透析24h，透析液经0.45μm微孔滤膜过滤，最后，经真空冷冻干燥得到靶向型开环葫芦脲化合物1(产率：66％)，靶向型开环葫芦脲化合物1高分辨质谱见图1；
(b)在37℃、含5％CO2的培养箱中培养肝癌细胞(HepG2)、肺癌细胞(A549)以及人的正常肝细胞(LO2)(浓度为1×104个/100μL)，取160μL加入12孔板中，另取500μL加入激光共聚焦皿中在培养箱中培养24h；然后分别用负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1、负载罗丹明B不具有靶向功能的开环葫芦脲、罗丹明B对细胞进行孵育1h，孵育完成后用PBS清洗5次，其中不具有靶向功能的开环葫芦脲结构式如下：
其中R为(CH2)nSO3Na；
通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜进行细胞摄取测定；靶向型开环葫芦脲化合物1的荧光显微镜结果见图5a、7a、9a，激光共聚焦结果图6a、8a、10a，从图5a，6a，7a，8a，中可以看出负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物1具有最强的荧光强度，图5e、6e，7e、8e为负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲，其几乎不在癌细胞表面富集，几乎不显示罗丹明B的红色荧光，而图5f、6f、7f、8f为单独的罗丹明B孵育的癌细胞，其仅有微弱的红色荧光；从图9a、图10a看出表面没有靶向受体存在的人的正常肝细胞(LO2)在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下均表现出较微弱的红色荧光，从而证明靶向载体的靶向功能较好；以上结果均表明负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物体1红色荧光强度聚集在癌细胞表面，明显高于负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲以及用游离罗丹明B进行细胞孵育的荧光强度，并且在人的正常肝细胞(LO2)几乎没有红色荧光，表明靶向型开环葫芦脲化合物具有极好的靶向能力。
实施例2：靶向型开环葫芦脲化合物2结构式如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2；
上述靶向型开环葫芦脲化合物2的制备方法如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2，R1为Br；
(a)分别称取卤素修饰的开环葫芦脲(1mmol)和叶酸(1mmol)加入150mL的圆底烧瓶中，随后加入碳酸钠和DMF的混合溶液，其中卤素修饰的开环葫芦脲与碳酸钠的摩尔比1:40，然后在40℃下搅拌反应48h；待反应完全后冷却至室温，将反应液倒入丙酮中析出沉淀，抽滤；固体用55℃水溶解澄清后，趁热滴加甲醇至有产物沉出，静置冷却后抽滤，得白色固体，再将白色固体溶于适量水用透析袋透析24h，透析液经0.45μm微孔滤膜过滤，最后，经真空冷冻干燥得到靶向型开环葫芦脲化合物2(产率：76％)，靶向型开环葫芦脲化合物2的核磁共振氢谱见图3；
(b)在37℃、含5％CO2的培养箱中培养肝癌细胞(HepG2)、肺癌细胞(A549)以及人的正常肝细胞(LO2)(浓度为1×104个/100μL)，取160μL加入12孔板中，另取500μL加入激光共聚焦皿中在培养箱中培养24h；然后分别用负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物2、负载罗丹明B不具有靶向功能的开环葫芦脲、罗丹明B对细胞进行孵育1h，孵育完成后用PBS清洗5次，其中不具有靶向功能的开环葫芦脲结构同实施例1；
通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜进行细胞摄取测定；靶向型开环葫芦脲化合物1的荧光显微镜结果见图5b、7b、9b，激光共聚焦结果图6b、8b、10b，从图5b、6b、7b，8b，中可以看出负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物2具有最强的荧光强度，图5e、6e、7e、8e为负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲，其几乎不在癌细胞表面富集，几乎不显示罗丹明B的红色荧光，而图5f、6f、7f、8f为单独的罗丹明B孵育的癌细胞，其仅有微弱的红色荧光；从图9b、图10b看出表面没有靶向受体存在的人的正常肝细胞(LO2)在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下均表现出较微弱的红色荧光，从而证明靶向载体的靶向功能较好；以上结果均表明负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物2红色荧光强度聚集在癌细胞表面，明显高于负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲以及用游离罗丹明B进行细胞孵育的荧光强度，并且在人的正常肝细胞(LO2)几乎没有红色荧光，表明靶向型开环葫芦脲化合物具有极好的靶向能力。
实施例3：靶向型开环葫芦脲化合物3结构式如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1；
上述靶向型开环葫芦脲化合物3的制备方法如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝1，R1为Br；
(a)分别称取卤素修饰的开环葫芦脲(1mmol)和生物素(1mmol)加入150mL的圆底烧瓶中，随后加入碳酸钾和二甲基亚砜的混合溶液，其中卤素修饰的开环葫芦脲与碳酸钾的摩尔比1:30，然后在80℃下搅拌反应36h；待反应完全后冷却至室温，将反应液倒入甲醇中析出沉淀，抽滤；固体用50℃水溶解澄清后，趁热滴加丙酮至有产物沉出，静置冷却后抽滤，得白色固体，再将白色固体溶于适量水用透析袋透析24h，透析液经0.45μm微孔滤膜过滤，最后，经真空冷冻干燥得到靶向型开环葫芦脲化合物(产率：53％)，靶向型开环葫芦脲化合物3的核磁共振氢谱见图3；
(b)在37℃、含5％CO2的培养箱中培养肝癌细胞(HepG2)、肺癌细胞(A549)以及人的正常肝细胞(LO2)(浓度为1×104个/100μL)，取160μL加入12孔板中，另取500μL加入激光共聚焦皿中在培养箱中培养24小时；然后分别用负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物3负载罗丹明B不具有靶向功能的开环葫芦脲、罗丹明B对细胞进行孵育1h，孵育完成后用PBS清洗5次，其中不具有靶向功能的开环葫芦脲结构式同实施例1；
通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜进行细胞摄取测定；靶向型开环葫芦脲化合物3的荧光显微镜结果见图5c、7c、9c，激光共聚焦结果图6c、8c、10c，从图5c、6c、7c、8c，中可以看出负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物3具有最强的荧光强度，图5e、6e、7e、8e为负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲，其几乎不在癌细胞表面富集，几乎不显示罗丹明B的红色荧光，而图5f、6f、7f、8f为单独的罗丹明B孵育的癌细胞，其仅有微弱的红色荧光；从图9c、图10c看出表面没有靶向受体存在的人的正常肝细胞(LO2)在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下均表现出较微弱的红色荧光，从而证明靶向载体的靶向功能较好。以上结果均表明负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物3的红色荧光强度聚集在癌细胞表面，明显高于负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲以及用游离罗丹明B进行细胞孵育的荧光强度，并且在人的正常肝细胞(LO2)几乎没有红色荧光，表明靶向型开环葫芦脲化合物具有极好的靶向能力。
实施例4：靶向型开环葫芦脲化合物4结构式如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2；
上述靶向型开环葫芦脲化合物4的制备方法如下：
其中R为(CH2)nSO3Na，n＝2，m＝2，R1为I；
(a)分别称取卤素修饰的开环葫芦脲(1mmol)和叶酸(1mmol)加入150mL的圆底烧瓶中，随后加入碳酸钾和DMF的混合溶液，其中卤素修饰的开环葫芦脲与碳酸钾的摩尔比1:35，然后在40℃下搅拌反应48h；待反应完全后冷却至室温，将反应液倒入丙酮中析出沉淀，抽滤；固体用55℃水溶解澄清后，趁热滴加甲醇至有产物沉出，静置冷却后抽滤，得白色固体，再将白色固体溶于适量水用透析袋透析24h，透析液经0.45μm微孔滤膜过滤，最后，经真空冷冻干燥得到靶向型开环葫芦脲化合物4(产率：76％)，靶向型开环葫芦脲化合物4的傅里叶红外谱图见图4；
(b)在37℃、含5％CO2的培养箱中培养肝癌细胞(HepG2)、肺癌细胞(A549)以及人的正常肝细胞(LO2)(浓度为1×104个/100μL)，取160μL加入12孔板中，另取500μL加入激光共聚焦皿中在培养箱中培养24小时；然后分别用负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物4、负载罗丹明B不具有靶向功能的开环葫芦脲、罗丹明B对细胞进行孵育1h，孵育完成后用PBS清洗5次，其中不具有靶向功能的开环葫芦脲结构式同实施例1；
通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜进行细胞摄取测定；靶向型开环葫芦脲化合物4的荧光显微镜结果见图5d、7d、9d，激光共聚焦结果图6d、8d、10d，从图5d、6d、7d、8d，中可以看出负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物4具有最强的荧光强度，图5e、6e、7e、8e为负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲，其几乎不在癌细胞表面富集，几乎不显示罗丹明B的红色荧光，而图5f、6f、7f、8f为单独的罗丹明B孵育的肝癌细胞，其仅有微弱的红色荧光；从图9d、图10d看出表面没有靶向受体存在的人的正常肝细胞(LO2)在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下均表现出较微弱的红色荧光，从而证明靶向载体的靶向功能较好；以上结果均表明负载罗丹明B的靶向型开环葫芦脲化合物4的红色荧光强度聚集在癌细胞表面，明显高于负载罗丹明B的不具有靶向功能的开环葫芦脲以及用游离罗丹明B进行细胞孵育的荧光强度，并且在人的正常肝细胞(LO2)几乎没有红色荧光，表明靶向型开环葫芦脲化合物具有极好的靶向能力。
总之，靶向载体和细胞表面的靶向受体特异性结合增加了细胞摄取，使得更多的模型药物能顺利通过细胞胞吞作用进入细胞，增加了药物摄取抑制肿瘤细胞的增殖，提高了细胞毒性。靶向型开环葫芦脲化合物具有主动靶向能力，在作为超分子载体时具有很好的应用价值，又因其柔性可调节的C型空腔其负载率高。本发明对于抗肿瘤药物新型制剂的开发，具有潜在的应用价值，可以很好的应用于制药、医疗、临床诊断、识别检测、化工催化等行业。
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