一种单克隆抗体及其在疾病诊断和检测中的应用
阅读说明：本技术 一种单克隆抗体及其在疾病诊断和检测中的应用 (Monoclonal antibody and application thereof in disease diagnosis and detection ) 是由 马红妙 张然 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种单克隆抗体及其在疾病诊断和检测中的应用。本发明通过采用杂交瘤方法制备并获得了针对肝素的单克隆抗体,所述抗体具有较好的特异性以及灵敏度,其可以用于血液样品中肝素的含量的测定,具有较好的应用价值。(The invention relates to a monoclonal antibody and application thereof in disease diagnosis and detection. The monoclonal antibody for heparin is prepared and obtained by adopting a hybridoma method, has better specificity and sensitivity, can be used for measuring the content of heparin in a blood sample, and has better application value.)
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体的涉及一种单克隆抗体及其在疾病诊断和检测中的应用。
背景技术
肝素首先从肝脏发现而得名，由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KDa，呈强酸性。它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。
在目前的研究中，针对肝素的检测变得尤为重要。比如尿路移行上皮细胞表面被葡萄糖氨基聚糖(glycccmminoglycans，GAGs)所覆盖，使上皮细胞免受病原体、微晶体、蛋白、致癌因子所粘附，肝素是GAGs的主要成分之一，尿中排泄的肝素主要为GAGs分解脱落产生，因此尿中肝索的排泄量与膀胱肿瘤、感染等疾病可能有一定关系。
测定肝素制剂含量的第一个方法是1924年Howell建立的，其根据是对新鲜全血凝结的抑制作用。这种全血法的修正是将血加硫酸钠保存，并加牛脑凝血活素，后为英国药典采用为法定方法，1938年Reiner和Winterstein的方法，用柠檬酸盐化的羊血浆来测定重钙化后肝素对凝结时间效应，最终为美国药典采用为法定方法日。目前各国药典收载的肝素效价测定方法均是生物检定法，均应用其抗血凝的药理作用进行测定，具体方法则有所不同。如英国药典(1980)、日本药局方(用硫酸钠一牛全血法、英国药典(1980)还规定可用硫酸钠一牛全血浆、枸橼酸钠一羊血浆法(英国药典1983、1986增补本已将肝素的效价测定改为此法)用平行线测定。美国药典(USP)从2l版开始则用羊血浆移位均值法测定。中国药典(1977)用家兔全血法，(1985)、(1990)、(1995)、(2000)用家兔全血法或兔、猪血浆法。
声色底物法是目前常用的检测方法。肝素的生色底物测定，近年来发展较快。用生色底物的光度法测定肝素是1976年由Teien等首先提出，1980年Tastad、1984年TenCate等阐述了以S-2222检测肝素的改革方法。到目前普遍用于肝素测定的生色底物法有两种。其一种是由Teien法发展起来的，原理为测定抗凝血酶一肝素复合物对X仅因子抑制作用。此法于试验体系中加入外源性抗凝血酶，在抗凝血酶存在下，肝素具有增强的抗凝活性，此活性直接针对一些凝结因子，其中X仪因子和凝血酶最为突出，因此这两种酶可用于测定肝素活性。方法之二是由Bartl和Lill于1979年发展起来的，其原理是测定AT-Ⅲ·肝素对凝血酶的抑制作用，即用凝血酶和底物ChromozymTH测定肝素活性。上述两种用生色底物测定肝素的试剂供应，国外已商业化。生色底物法的最大优点是其在肝素效应测定中的特异性，因而广泛用于肝素治疗的监测和肝素性质的研究。光度法使用，使常规测定的自动化得以实现，这对临床监测也是很重要的。
但是目前，针对肝素的检测方法还不够多，开发不同的检测思路变得迫在眉睫。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。单克隆抗体由于纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性。因此，开发肝素特异性的单克隆抗体及其检测方法变得尤为重要。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种采用生物法来检测血液中肝素含量的方法。
一方面，本发明提供一种特异性针对肝素的单克隆抗体。
所述单克隆抗体为5C5抗体，优选地，所述抗体的重链包含重链可变区(VH)，轻链包含轻链可变区(VL)，并且所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列的重链可变区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，用于本发明的第一种单克隆抗体包含重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO:2至少85％，90％，95％，98％，99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，用于本发明的第一种单克隆抗体包含轻链可变区序列，其具有与SEQ ID NO:1至少85％，90％，95％，98％，99％或100％相同的序列。
根据本发明的
具体实施方式
，所述抗体带有可检测标记。所述可检测标记例如酶标记、放射性标记、发光标记、显色标记、半抗原(例如地高辛、生物素)、金属络合物和金属(例如胶体金)。
第二个方面，提供一种检测肝素含量的方法，包括使用本发明的单克隆抗体进行检测；优选地，通过ELISA方法检测。进一步优选地，本发明的单克隆抗体作为包被抗体，以常规方法制备的兔多克隆抗体作为检测抗体。
优选地，所述方法包括：
1)使用本发明的单克隆抗体包被酶联板；
2)将被测样品与本发明的单克隆抗体反应；
3)使用常规方法制备的兔多克隆抗体进行检测和显色反应，测定450nm下吸光值；
4)利用肝素标准品制备标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中肝素含量。
本发明另外一方面，提供一种含有本发明单克隆抗体的试剂盒。所述试剂盒可用于选自以下的检测方法：化学发光免疫分析法、免疫比浊、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹(Western blotting)、抗体微阵列、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)等。优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，例如双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明所述的抗体组合。
进一步优选地，所述试剂盒还包括IgG、洗液、底物显色液A(EDTA-Na、柠檬酸、甘油、TMB)、底物显色液B(醋酸钠、柠檬酸、30％H2O2)、终止液(2M H2SO4)和BSA，以及酶联板和封板膜和/或肝素标准品。
在一些实施方案中，ELISA测定或夹心ELISA测定包括使用一种或多种本文所述的单克隆抗体。在一个实施方案中，ELISA测定或夹心ELISA测定包括将尿样暴露于本文所述的第一单克隆抗体。在一个实施方案中，ELISA测定或夹心ELISA测定包括将尿样暴露于第二单克隆抗体。在一个实施方案中，ELISA测定或夹心ELISA测定包括将尿样暴露于本文所述的第一单克隆抗体和/或第二单克隆抗体。在一个实施方案中，ELISA测定或夹心ELISA测定包括将尿样暴露于本文所述的第一单克隆抗体。在一些实施方案中，用于ELISA测定或夹心ELISA测定的第一单克隆抗体和/或第二单克隆抗体特异性结合肝素。在一些实施方案中，用于ELISA测定或夹心ELISA测定的第一种单克隆抗体结合肝素。
在本发明的中，检测对象优选是人的样本；所述生物学样本为选自来自受试者的全血、血浆、血清、血细胞、腹水、淋巴液、唾液、痰液、汗液、尿液、粘液、间质液、组织活检和细胞中的一种或多种，优选全血、血清或血浆。
任选地，本发明的试剂盒用于诊断原位癌的用途，当本发明涉及T1膀胱癌时，可以具有至少约35％的灵敏度，至少约45％，至少约55％，至少约65％，至少约75％，至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％。
在一些实施例中，当膀胱癌是T1膀胱癌时，本发明的方法和用途，可以具有至少约75％的灵敏度。
有益效果
本发明通过采用杂交瘤方法制备并获得了针对肝素的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性以及灵敏度，其可以用于血液样品中肝素的含量的测定，具有较好的应用价值。
附图说明
图1 Western检测结果图
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1肝素制备
将离体的肺组织100g，按1∶10(g∶mL)加入蒸馏水，在组织捣碎机中充分破碎至肉糜状，转移至1000mL烧杯中备用。采用2mol/LNaOH溶液调杯内肉糜pH至8.5，加入2％蛋白酶酶解3h，加入样品量的5％的NaCl 60℃下每间隔10min搅拌30s，连续进行此操作2h，2h后立即升温至100℃，静置10min沉淀蛋白，以100目筛过滤，收集滤液。滤液冷却至50℃，用2mol/L NaOH调pH至8.5，加入8％陶氏AMBERLITETM FPA98CL食品级特种聚合物(树脂)树脂(树脂用蒸馏水冲洗至中性)，于恒温磁力搅拌器中50℃下，连续吸附8h，以100目筛过滤，收集树脂备用。将树脂装入洗脱柱，以蒸馏水反复冲洗至无色，用1.2mol/L的NaCl浸泡洗涤树脂30min，弃滤液。在树脂洗脱柱中加入5mol/L的NaCl浸泡3h，用烧杯收集浸提液；再用3.5mol/L的NaCl浸泡2h(连续两次)，用同一个烧杯收集液体，滤液烧杯中备用。将滤液用1∶1(V∶V)的HCl调pH至3.5，静置30min，沉淀酸蛋白，用滤纸过滤；将上次滤液用2mol/L NaOH调pH10，静置3h，沉淀碱蛋白，用滤纸过滤，滤液备用。取滤液用1.5倍体积95％乙醇加入烧杯中，摇匀静置12h，真空抽滤，保留固体，滤液收集进行乙醇回收。把抽滤得到的固体在真空干燥箱中60℃下真空干燥，用天平称量至两次的称量重量相差在0.02g即达到恒重，得到肝素粗品。将肝素粗品制备成为浓度为1mg/mL的肝素溶液，上S5428树脂层析柱进行纯化，其中S5428树脂层析柱的动态吸附条件是:吸附温度45℃，肝素溶液进样浓度1.0mg/mL，进样速度1.5mL/min，吸附量可达3mg/mL，用2.0mol/L NaCl为解吸剂，洗脱流速1.5mL/min，pH8.0，洗脱温度45℃。在此条件下，收集纯化的肝素，即为纯化肝素。经检测，采用浓硫酸氧化法来检测溶液中肝素的浓度为287mg/kg，并且肝素效价为140U/mg。
实施例2肝素特异性单克隆抗体的制备
将实施例1制备的肝素吸取1mg的抗原溶于1ml的生理盐水中，充分混匀，制成浓度为1mg/ml的抗原溶液。
将反复乳化好的免疫原去免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，共免疫6次，具体方案如下：第一次免疫用免疫原加弗氏完全佐剂，两者按体积比l：1混合，小鼠足垫、腹部皮下多点注射，60ug/只，2周后进行下一次免疫；第2至5次免疫，将免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化后，小鼠足垫、皮下多点注射，30ug/只，每次间隔2周；取血清，测效价，选取效价最好的小鼠在做细胞融合前3天，腹腔注射100ul、50ug的免疫原，以加强免疫效果。
经免疫加强后第三天的小鼠，拉颈处死。小鼠用自来水冲洗后，置于1％新洁尔灭溶液中浸泡5分钟，将其右侧卧位固定，无菌操作剪开腹部皮肤，暴露腹膜，于脾脏处剪开腹膜，取出脾脏，剔除脂肪及结缔组织，置于有少许DMEM的平皿中。实验前预先将如下实验器械高温灭菌：200目的细胞筛网、玻璃注射器的推杆，3把手术剪。将细胞筛网置于有少许DMEM的平皿中，同时将脾脏小心置于细胞筛网上，用玻璃推杆仔细研磨脾脏让其透过细胞筛网进入DMEM中，研磨完全后，用50ml离心管将脾细胞悬液收集起来。将收集到的脾细胞悬液离心，弃上清。用DMEM重悬沉淀，吹匀，此即为待融合的脾细胞，苔盼兰染色后活细胞计数备用。将SP2/O瘤细胞与免疫脾细胞按1：5比例混合，2000rpm，离心10分钟，倒掉上清后再用吸管仔细吸尽残留的液体，轻轻震动管底，混匀后置于37℃水浴环境中。吸取0.6mlPEG(MW.4000)，边加边轻轻搅拌，在1分钟内加完。加lmlDMEM，边加边摇晃试管，在1.5分钟内加完。再次1分钟内加完lmlDMEM，边加边摇晃试管，并反复三次。再加lOmlDMEM，边加边摇晃试管，在1分钟内加完。2000rpm，离心10分钟，弃上清。细胞沉淀用HAT选择培养液小心重悬浮，接种于已有饲养细胞的96孔细胞培养板孔中，每孔加入0.1ml(按脾细胞计，每孔加量为2×105个细胞)。留一孔加入含有HAT选择培养液的SP2/O，作为SP2/0对HAT的敏感性对照孔。置于37℃5％C02孵箱中培养，细胞融合后第七天左右，SP2/O对照孔细胞全部死亡。10-14天后可见大的杂交瘤细胞克隆，待培养液微黄，则可吸出部分上清进行检测。
采用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，共获得7株阳性杂交瘤细胞株，同时通过在显微镜下观察阳性孔细胞生长的状况，最终选定1B4,5C5这二株细胞做亚克隆。采用有限稀释法将选定的2株细胞株进行亚克隆，将这2株细胞扩大规模培养后，收集上清以备抗体纯化，细胞保存备用。同时，留取一定数量的细胞以便制作腹水。
腹水制备前1周，取10周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂500ul/只。将1B4和5C5阳性杂交瘤细胞分别培养至对数生长期时，离心弃上清；用预热的无血清IMDM培养基重悬并洗涤细胞2次，同时进行细胞计数；然后以适量的预热生理盐水重悬细胞，分别每只小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞2x106个/300ul。待小鼠腹水产生明显时，用12号注射针头无菌条件下收取腹水，于4℃、2000rpm离心10min收取上清，采用Protein-G免疫亲和层析法纯化抗体腹水，贮存于-20℃备用。
采用Western印迹法检测：将实施例1纯化后制备的肝素以及实施例1的粗品作为免疫原制备成Western印迹样本，BSA作为对照，进行电泳并转膜，依次孵育1B4和5C5这二个待检测单抗，4℃反应过夜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。结果如图1所示。
从图1的结果可以看出，1B4和5C5这二株单抗能够检测到实施例1制备的纯化的肝素(分别对应泳道1和2)。
实施例2 5C5和1B4抗体亚类的鉴定
用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类。ELISA板包被抗原，50ul/孔，置4℃过夜。弃上清，加封闭液200ul/孔，置于37℃孵育1小时。洗涤液洗3次，将1B4或5C5单抗分别加到9个不同孔中，50ul/孔，设复孔。将阳性对照加到第10孔中，置37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。将正常兔血清加到第1个孔中，兔抗小鼠免疫球蛋白类或亚类的特异性抗体分别加到2-9孔中，阳性对照孔加入兔抗小鼠IgGl抗体，50ul/孔，37℃孵育1小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入HRP-羊抗兔lgG抗体，50ul/孔，37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入TMB显色液，50ul/孔。室温显色5min，加入100ul终止液终止反应，于450nm处测OD值，记录并判定结果。结果如表1所示。
表1抗体亚型检测
克隆号
重链类/亚类
轻链亚型
1B4
IgM
κ
5C5
IgM
κ
从表1的结果可以看出，1B4和5C5这二个抗体都是IgM亚型，轻链都是κ。
实施例3 5C5抗体亲和力鉴定
利用AMC传感器，将纯化出来的5C5抗体用PBST稀释到10ug/ml，肝素用PBST进行梯度稀释：444.4nmol/ml、222.2nmol/ml、111.1nmol/ml、55.6nmol/ml、27.8nmol/ml、0nmol/ml；运行流程：PBST中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，PBST中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69GLY溶液进行传感器再生，输出数据，(KD表示平衡解离常数即亲和力)，结果显示，5C5抗体的Kd值为4.88E-09M，具有较好的结合特性。
实施例4 5C5抗体序列鉴定
采用试剂盒提取5C5杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，具体的引物序列为：重链：上游引物：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGAGGTGCAACTGCAGCAGTCAGG-3’，下游引物为5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’(S/M/R是碱基兼并码)。轻链：上游引物：5’-GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC-3’，下游引物：5’-GCGCCGTCTAGAATFAACACTCATTCCTGTTGAA-3’。采用该引物进行PCR扩增，扩增后，将目的基因片段插入pMD18-T载体，转入感受态细胞DH5a，菌液PCR鉴定，测序，测序结果用IMGT/V-Quest软件进行分析，结果显示，5C5抗体的轻重链序列分别如下所示。
轻链可变区(SEQ ID NO：1)
DIVITQAPALMAASPGEKVTITCFGTTYFSADSPYWYQQKSGISPKPWIYTTHPPHRGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCATRPTRHVKFGAGTKLELK
重链可变区(SEQ ID NO：2)
EVQLEESATELARPGARVKLSCKASGYIFSNEIGHWIKQRPGQGLEWIGEWWGQGYFLMQLPIAYGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSCNNTKGWGLGTTLAVSS。
实施例5血液中肝素含量的检测
血液透析2例，肝素化后30min采血，给药剂量为62.6～100U/kg，静脉采血9：1比例，抗凝剂用109mmol/L的枸橼酸钠，3000r/min，15min离心，取血浆检测。
ELISA检测法：用PBS将肝素做一系列浓度梯度稀释，37℃包被96孔板2h，3％胎牛血清封闭，加入稀释2000倍的5C5单抗，然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，以ABTS显色，测定450nm处吸光度，并绘制标准曲线。以上述血浆作为检测样本，按照ELISA检测方法依据标准曲线计算得到肝素的浓度结果如下表2所示。以本领域常用的分光光度法作为对照。
表2肝素含量
样本
ELISA检测法(U/L)
分光光度法(U/L)
病例1
452.8±24.63
458.9±19.23
病例2
486.1±21.03
491.9±21.03
病例1和病例2的检测结果与本领域常规用分光光伏发检测的肝素含量基本保持较好的一致性，这说明本发明的单克隆抗体可以用于血液中肝素的含量检测。
实施例6检测膀胱癌患者尿液中肝素含量
取膀胱癌患者临床分期为Ta-T1期患者10例，正常患者10例，每组对象留取清洁中段尿10mL。采用实施例5类似的方法，检测样本中肝素水平，结果如表3所示。
表3肝素含量
从表3可以看出，在膀胱癌患者的尿液中肝素的含量是比健康者的含量要高，而且采用本发明的单抗检测方法与本领域常用的分光光度法检测方法的结果基本相似。但是本发明的检测操作更加方便，可以批量快速检测，效果更加高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京保图生物技术有限公司
<120> 一种单克隆抗体及其在疾病诊断和检测中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ala Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Phe Gly Thr Thr Tyr Phe Ser Ala Asp
20 25 30
Ser Pro Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Thr Thr His Pro Pro His Arg Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Arg Pro Thr Arg His
85 90 95
Val Lys Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Arg Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Glu
20 25 30
Ile Gly His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Trp Trp Gly Gln Gly Tyr Phe Leu Met Gln Leu Pro Ile Ala
50 55 60
Tyr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Cys Asn Asn Thr Lys Gly Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115
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