新型多功能肽及其用途
阅读说明：本技术 新型多功能肽及其用途 (Novel multifunctional peptide and use thereof ) 是由 李泰勋 金载允 李泫珠 于 2020-03-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新型多功能肽,能够有效调节免疫细胞的活性,同时还对各种细菌如革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出优异的抗菌活性,因此可以用作一种抗菌剂,一种用于免疫疾病的治疗剂,以及一种用于改善皮肤免疫疾病的化妆品组合物。(The present invention provides a novel multifunctional peptide which is capable of effectively modulating the activity of immune cells while also exhibiting excellent antibacterial activity against various bacteria such as gram-negative bacteria and gram-positive bacteria, and thus can be used as an antibacterial agent, a therapeutic agent for immune diseases, and a cosmetic composition for improving skin immune diseases.)
具体实施方式
术语的定义：
本文所用术语“免疫调节肽”是指具有直接或间接抗微生物和/或抗病毒活性和免疫调节活性的肽，例如免疫细胞的炎症反应控制、免疫细胞迁移和表皮或内皮细胞的炎症反应控制。换言之，该肽通过在嗜中性粒细胞和单核细胞等吞噬细胞和表皮细胞等中表达的甲酰基肽受体1(FPR1)和甲酰基肽受体2(FPR2)在宿主抵抗病原体感染中发挥重要作用。上述受体已知与对百日咳毒素敏感的Gi蛋白结合。FPR1和FPR2的激活诱导Gβγ亚基从Gαi亚基中分离，Gβγ亚基诱导磷脂酶Cβ或磷酸肌醇3-激酶的激活。这些分子的激活诱导复杂的下游细胞内信号传导，以介导细胞反应，如趋化性迁移、脱颗粒和超氧化物生成。
本文所用术语“抗菌肽”是一种阳离子肽类化合物，通常由相对简单的结构组成，能够抗包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等在内的广谱微生物。其作用机制虽然不完全清楚，但一般认为它的作用机制是通过破坏微生物细胞膜表现出抗菌活性的。
最佳模式：
在本发明的一个方面，提供了一种具有抗菌和免疫调节活性的肽，其由6至12个氨基酸组成，其包含的氨基酸序列选自由：
i)BOBWX1OU；和
ii)X1RWWUX1X2m所组成的组；
其中，所述B为独立地选自由赖氨酸(K)和精氨酸(R)组成的组中的碱性氨基酸，所述O独立地选自由苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)组成的组中的芳香族氨基酸，所述X1独立地选自由精氨酸(R)、正亮氨酸(Nle)或2-萘基-L-丙氨酸(Z)组成的组，所述U不存在或选自由m、X2WW、RX2WW和MVm组成的组，
其中所述X2为正亮氨酸(Nle)、色氨酸(W)或缬氨酸(V)，并且所述m为D-型甲硫氨酸，并且KFKWRYm被排除在i)之外。
根据上述肽，所述i)是包含选自由BOBW-Nle-Om、BOBWBO、BOBWZO、BOBWZOm和BOBWBOMVm组成的组中的氨基酸序列的肽。
根据上述肽，所述ii)是包含选自由ZRWWX1X2m、RRWWX1X2m和ZRWWRX2WWRWm组成的组中的氨基酸序列的肽。
根据上述肽，可以将辛酰基或乙酰基添加到上述肽的N-末端或C-末端，或者上述肽的C-末端可以被酰胺化。
根据上述肽，可由选自SEQ ID NO:1至17组成的的组中的氨基酸序列组成。
在本发明的另一方面，提供了一种包含上述肽作为活性成分的抗菌剂。
所述抗菌剂可以对铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌具有抗菌活性。
在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗免疫相关疾病的药物组合物，其包含所述肽作为活性成分。
根据所述药物组合物，所述免疫相关疾病可以是特应性皮炎、银屑病、结膜炎、角膜炎、干眼症、肺炎、哮喘、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
在本发明的另一方面，提供了一种用于改善选自特应性皮炎、狼疮和银屑病组成的组中的皮肤自身免疫病的症状的化妆品组合物，其含有所述肽作为活性成分。
包含作为活性成分的所述肽的药物组合物可包括选自盐、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油和乙醇的药物稀释剂中的至少一种，但稀释剂不限于此。根据给药目的和疾病状态，可不同地应用药物组合物。实际给药的活性成分量应考虑多种相关因素，如待治疗疾病、患者病情的严重程度、与其他药物(如化疗药物)联合给药、患者的年龄、性别、体重、食物、给药时间、给药途径，以及该组合物的剂量比。该组合物可每天给药一次或1-3次，但剂量和给药途径可根据疾病的类型和严重程度进行调整。
包含所述肽作为活性成分的药物组合物可以用本领域常规制备时使用的任何制剂制备(例如，Remington's Pharmaceutical Science，最新版；Mack PublishingCompany，Easton PA)，并且制剂的形式优选可以是外用制剂但不限于此。本发明的外用制剂包括常规的外用制剂，例如片剂、液体涂层、喷剂、乳液、乳霜、膏药、粉末、渗透垫、喷剂、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、搽剂、软膏、气溶胶、悬浮液和经皮吸收剂。这些制剂在Remington's Pharmaceutical Science，第15版，1975，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania 18042(第87章：Blaug，Seymour)中有所描述，该制剂是所有药物化学领域公知的。
包含本发明的肽或物质的药物组合物可以口服或经肠外途径给药。经肠外途径给药是指通过非口服给药途径，即直肠内、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、透皮、吸入、眼内和皮下给药。包含所述肽或物质的药物组合物可以配制为任何形式，例如口服剂型、注射液或局部制剂。优选制备用于口服和注射给药的制剂(真溶液、悬浮液或乳剂)，并且最优选制备为口服形式，例如所需的片剂、胶囊、软胶囊、水性药物、丸剂、颗粒剂等。上述制剂中，将本发明的肽填入不含辅药的软胶囊中，与载体混合或稀释后制成合适的制剂。合适的载体的实例包括淀粉、水、盐水、林格氏溶液和葡萄糖。
包含本发明的肽作为活性成分的化妆品组合物可包含一种或多种用于化妆品组合物制剂的添加剂。例如，此类添加剂包括1,3-丁二醇、大豆磷脂胆碱、鞘氨醇、胆固醇、吐温80、植物鞘氨醇、水杨酸、皮肤保湿剂(润湿剂)、软化剂、天然油、天然提取物、角蛋白、类脂质、吸水性水溶性物质、角质层神经酰胺、表皮脂酸膜脂肪酸、胆固醇酯、乙醇、蒸馏水等。
包含本发明的肽作为活性成分的药物组合物可以通过口服给药或经肠外途径给药，更优选口服给药，但不限于此。经肠外途径给药时，可以通过静脉注射、鼻内吸入、肌肉给药、腹腔给药、经皮吸收等多种途径给药。
此外，包含本发明的肽作为活性成分的药物组合物可以以0.1mg/kg至1g/kg的剂量给药，更优选以1mg/kg至600mg/kg的剂量给药。同时，可根据患者的年龄、性别和病情适当调整剂量。
本发明的模式：
在下文中，将通过实施例和实验例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下公开的实施例和实验例，并且可以以各种不同的方式实施，以下实施例和实验例使本发明的公开完整，并完整告知本领域技术人员本发明的范围。
实施例1：抗菌肽的制备
本发明人通过常规的基础筛选研究开发了一种具有抗菌活性的肽(KFKWRYm)，并获得了该肽的专利(韩国专利号10-1855170)。随后，为了开发一种具有比该肽更好的抗菌和免疫调节功能的改良肽，本发明人设计了与专利肽氨基酸序列不同的各种变体，并使用一般的氨基酸合成方法合成了各种抗菌候选肽(Umbarger,HE,Ann.Rev.Biochem.,47:533-606,1978)。
此外，本发明人以在上述合成的肽的N-末端添加辛酰基或乙酰基和/或用胺基取代C-末端羧基的形式添加修饰。
实验例1：新型肽的FPR2激活效应分析
本发明人观察了根据本发明实施方案的候选肽的钙离子渗透性的变化，以确定它们是否能够激活体内的免疫调节功能。特别是，测量细胞内钙离子浓度以确认所述肽能够激活FPR2。使用既不表达FPR1也不表达FPR2的RBL细胞、过表达FPR1的RBL细胞(FPR1-RBL)和过表达FPR2的RBL细胞(FPR2-RBL)，并利用一种对钙具有高结合亲和力的荧光团Fura-2/AM灵敏地检测细胞内钙离子水平。为此，将细胞在添加有10％胎牛血清的RPMI培养基中培养，并在对数期(对数中期，1-3×107个细胞/ml)通过离心收获，然后用未添加胎牛血清的RPMI培养基洗涤数次，然后将细胞重悬于RPMI培养基中至1×107个细胞/ml。随后，加入终浓度为3μM的Fura-2/AM，并将细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养45分钟。在适当的时间后，收获细胞，再次用RPMI培养基洗涤，然后悬浮在添加250μM磺吡酮(Sulfinpyrazone)的适量RPMI培养基中以防止Fura-2进入细胞而损失。每次取约2×106个细胞，快速离心收获，重悬于1ml不加钙离子和EGTA的Locke溶液中，每隔约1分钟用不同浓度(1μM、0.1μM和0.01μM)本发明实施方案中的肽处理，在分光光度计上监测340nm和380nm两个波长处的吸光度之比，然后研究在两个波长下的吸光度差异。根据Grynkiewicz的方法，将其转化为游离钙离子进入细胞的浓度。
结果显示，在大多数所述肽中显示出了激活FPR2的作用，这表明根据本发明实施方案中的肽可以通过结合并激活FPR2来调节个体的免疫功能(图1)。分析所述肽对FPR2激活作用的结果总结在下面的表1中。
表1
被测试的肽的FPR2活性的分析
肽
FPR2活性(EC<sub>50</sub>,nm)
SEQ ID Nos
V3
106.9
1
V4
64.0
2
V5
41.5
3
V6
4.2
4
V7
3.2
5
V8
6.4
6
V9
4.7
7
V16
-
8
V16_0
-
9
V18
62.8
10
V18_0
10.0
11
V19_Ac
69.4
12
V20_Ac
45.3
13
V21_Ac
92.3
14
V22_Ac
16.2
15
V23_Ac
61.3
16
V24_Ac
58.6
17
实验例2：新型肽抗菌活性测试
本发明人为了在实施例1中合成的各种肽中选择性能优异的肽，评估了它们激活FPR2的能力。特别地，为了检测所述肽的抗微生物活性，将革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa)通过四区划线将细菌接种在琼脂平板培养基上，并在36℃培养箱中培养过夜。第二天，将在琼脂平板培养基上产生的菌株菌落接种到3ml营养培养基中，并在36℃和220rpm的摇床中培养过夜。第二天，将细菌稀释以测量600nm处的吸光度，调整为OD600＝0.5，并在营养培养基中以1:100的比例稀释。然后，将上述实施例中制备的肽在营养培养基中依次稀释为0、1.25、2.5、5、10、20μM的浓度，各制备1ml，然后接种1ml稀释后的细菌。随后，将混合物在36℃和220rpm的条件下振荡，孵育18小时，并测量在600nm处的吸光度。
结果显示，筛选出了20种对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌显示出高抗菌活性的肽(图2和3)。表中总结了这些肽的序列信息和抗菌活性。
表2
本发明抗菌肽的氨基酸序列信息及抗菌活性
已经参考上述实施例和实验例描述了本发明，但是理解这些仅仅是示例性的，并且本领域技术人员可以进行各种修改和等效的其他实施例和实验例。因此，本发明的真正范围应由所附权利要求的技术精神决定。
SEQUENCE LISTING
<110> 诺娃细胞科技公司
<120> 新型多功能肽及其用途
<130> P21117441WP
<150> KR 10-2019-0031330
<151> 2019-03-19
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
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Xaa Arg Trp Trp Arg Xaa Trp Trp Arg Trp Xaa
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<223> Xaa is D-type methionine
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Arg Arg Trp Trp Arg Trp Xaa
1 5
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