具体实施方式

I.引言

TREM2是在小神经胶质细胞、树突状细胞、巨噬细胞和破骨细胞的细胞表面上表达的跨膜受体。不受特定理论的束缚，据认为在配体结合后，TREM2与跨膜衔接蛋白、DNAX活化蛋白12(DAP12)形成信号传导复合物，后者又被蛋白激酶SRC进行酪氨酸磷酸化。据认为活化的TREM2/DAP12信号传导复合物通过募集和磷酸化激酶例如Syk激酶来介导细胞内信号传导。TREM2/DAP12信号传导调节细胞如小神经胶质细胞和巨噬细胞的活性，例如吞噬作用、细胞生长和存活、促炎性细胞因子分泌和迁移。TREM2经历调控的膜内蛋白水解，其中膜相关全长TREM2通过金属蛋白酶ADAM10切割成从细胞上脱落的sTREM2部分和通过γ分泌酶进一步降解的膜保留C末端片段。在患有阿尔茨海默病或额颞叶痴呆并且具有TREM2突变的患者中已报道sTREM2的水平改变。另外，TREM2突变与功能改变如吞噬作用受损和小神经胶质细胞功能降低相关。

如以下实施例部分详述，已生成特异性结合到人类TREM2并调节TREM2/DAP12信号传导复合物的一种或多种下游功能的抗体。因此，在一个方面，本公开提供抗TREM2抗体和其抗原结合片段。因此，在一个方面，本公开提供抗TREM2抗体和其抗原结合部分。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强TREM2活性，例如增强吞噬作用或增强髓系细胞、小神经胶质细胞或巨噬细胞的分化、功能、迁移或存活。因此，在另一方面，提供了增强例如患有神经退行性疾病的受试者的TREM2活性的方法。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体减少sTREM2脱落。因此，在另一方面，提供了减少例如患有神经退行性疾病的受试者的sTREM2水平的方法。

II.定义

如本文所用，除非内容另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一种抗体”任选地包括两个或更多个此类分子的组合，等等。

如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰以数值或范围指定的量时指示所述数值以及本领域技术人员已知的与所述值的合理偏差例如±20％、±10％、或±5％处于所述值的预期含义内。

如本文所用，术语“TREM2蛋白”是指由基因TREM2编码的髓系细胞表达的触发受体2。如本文所用，“TREM2蛋白”是指任何脊椎动物的天然(即，野生型)TREM2蛋白，所述脊椎动物例如但不限于人类、非人灵长类动物(例如，食蟹猴)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)和其他哺乳动物。在一些实施方案中，TREM2蛋白是具有UniprotKB登录号Q9NZC2(SEQ ID NO:1)中鉴定的序列的人类TREM2蛋白。

如本文所用，术语“抗TREM2抗体”是指特异性结合到TREM2蛋白(例如，人类TREM2)的抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指具有经由其可变区特异性结合到抗原的免疫球蛋白折叠的蛋白质。所述术语包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、多特异性抗体如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。如本文所用，术语“抗体”还包括经由其可变区保留结合特异性的抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab')₂、Fv、scFv和二价scFv。抗体可含有被分类为κ或λ的轻链。抗体可含有被分类为γ、μ、α、δ或ε的重链，其又分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体主要由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻链”(约25kD)和一个“重链”(约50-70kD)。每条链的N末端限定主要负责抗原识别的具有约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(V_H)分别是指这些轻链和重链。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中来源于种系可变(V)基因、多样性(D)基因、或连接(J)基因(而非来源于恒定(Cμ和Cδ)基因区段)并且赋予抗体结合到抗原的特异性的结构域。通常，抗体可变区包含四个保守性“框架”区，其穿插有三个高变“互补决定区”。

术语“互补决定区”或“CDR”是指每条链中的三个高变区，其中断了由轻链和重链可变区建立的四个框架区。CDR主要负责抗体与抗原的表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，其从N末端开始依次编号，并且通常也由特定CDR所处的链鉴定。因此，V_HCDR3或CDR-H3位于存在所述CDR的抗体的重链的可变区中，而V_L CDR1或CDR-L1是来自存在所述CDR的抗体的轻链的可变区的CDR1。

不同轻链或重链的“框架区”或“FR”在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区是组成型轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间内定位并比对CDR。框架序列可获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公布参考。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于人类和小鼠序列的“VBASE2”种系可变基因序列。

CDR和框架区的氨基酸序列可使用本领域中的各种众所周知的定义来确定，例如Kabat、Chothia、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)、AbM和已观测抗原接触(observedantigen contacts)(“Contact”)。在一些实施方案中，CDR根据Contact定义来确定。参见MacC allum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)。在一些实施方案中，CDR通过Kabat、Chothia和/或Contact CDR定义来确定。

术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”在本文中可互换使用并且是指抗体的保留经由其可变区特异性结合到抗原(例如，TREM2蛋白)的能力的一种或多种片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、V_H、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab')₂片段(在铰链区处包含由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(dsFv)、互补决定区(CDR)、V_L(轻链可变区)和V_H(重链可变区)。

术语“表位”是指抗体的CDR所特异性结合的抗原的区域或区并且可包括一些氨基酸或一些氨基酸的部分，例如5个或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸或那些氨基酸的部分。例如，在靶为蛋白质时，表位可包含连续氨基酸(例如，线性表位)或来自蛋白质中通过蛋白质折叠而彼此接近的不同部分的氨基酸(例如，不连续或构象表位)。在一些实施方案中，表位在一个氨基酸处(例如，在丝氨酸或苏氨酸残基处)被磷酸化。

如本文所用，如关于抗TREM2抗体使用的短语“识别表位”意指抗体CDR与抗原(即，TREM2蛋白)在所述表位或所述抗原的含有所述表位的部分处相互作用或特异性结合。

如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含两个或更多个不同抗原结合部分的抗体，其中每个抗原结合部分包含识别不同抗原的不同可变区，或者抗体的经由其可变区结合到两个或更多个不同抗原的片段或部分。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指包含两个不同抗原结合部分的抗体，其中每个抗原结合部分包含识别不同抗原的不同可变区，或者抗体的经由其可变区结合到两个不同抗原的片段或部分。

“单克隆抗体”是指由细胞的单一克隆或单一细胞系产生并且由初级氨基酸序列相同的抗体分子组成或基本上由所述抗体分子组成的抗体。

“多克隆抗体”是指由异质抗体群体获得的抗体，其中所述群体中的不同抗体结合到抗原的不同表位。

“嵌合抗体”是指如下抗体分子，其中恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(即，可变区、CDR、或其部分)连接至具有不同或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区，或者其中可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区(例如CDR和来自不同物种的框架区)改变、替换或交换。在一些实施方案中，嵌合抗体是包含来自一个来源或物种(例如小鼠)的可变区和来源于第二来源或物种(例如人类)的恒定区的单克隆抗体。用于产生嵌合抗体的方法在本领域中描述。

“人源化抗体”是来源于非人类来源(例如鼠类)的嵌合免疫球蛋白，其在CDR外部含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。一般来说，人源化抗体将包含至少一个(例如两个)抗原结合可变区，其中CDR区基本上对应于非人类免疫球蛋白的那些并且框架区基本上对应于人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白序列。抗体人源化的方法是本领域中已知的。

“人类抗体”或“完全人类抗体”是具有人类重链和轻链序列的抗体，所述序列通常来源于人类种系基因。在一些实施方案中，抗体由人类细胞、由利用人类抗体库的非人类动物(例如，被遗传工程化以表达人类抗体序列的转基因小鼠)、或由噬菌体展示平台产生。

术语“特异性结合”是指与分子(例如，抗体或其抗原结合部分)结合到另一个表位或非靶标化合物(例如，结构上不同的抗原)相比，其以更大亲和力、更大亲合力和/或更大的与样品中表位或靶标的持续时间结合到所述表位或靶标。在一些实施方案中，特异性结合到表位或靶标的抗体(或其抗原结合部分)是以比其他表位或非靶标化合物大至少5倍，例如至少6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大亲和力结合到表位或靶标的抗体(或其抗原结合部分)。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性结合到”特定表位或靶标、或对与特定表位或靶标“有特异性”可例如通过对其所结合的表位或靶标具有以下平衡解离常数K_D的分子来表现：10^-4M或更小，例如10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M。技术人员将认识到，特异性结合到来自一个物种的靶标(例如，TREM2蛋白)的抗体也可特异性结合到所述靶标的直系同源物(例如，TREM2蛋白)。

术语“结合亲和力”在本文中用于是指两个分子之间，例如抗体(或其抗原结合部分)与抗原之间的非共价相互作用的强度。因此，例如，除非上下文另外指明或从上下文显而易见，否则所述术语可指抗体(或其抗原结合部分)与抗原之间的1:1相互作用。结合亲和力可通过测量平衡解离常数(K_D)来量化，所述平衡解离常数是指解离速率常数(k_d，时间^-1)除以缔合速率常数(k_a，时间^-1M^-1)。K_D可通过例如使用以下方法测量复合物形成和解离的动力学来确定：表面等离子体共振(SPR)方法，例如Biacore^TM系统；动力排阻测定，例如和生物层干涉术(例如，使用Octet平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括正式结合亲和力，例如反映抗体(或其抗原结合部分)与抗原之间的1:1相互作用的那些，而且还包括表观亲和力，其K_D值经计算并且可反映亲合结合。

如本文所用，术语“交叉反应”是指抗体结合到除了产生所述抗体的抗原以外的抗原的能力。在一些实施方案中，交叉反应性是指抗体结合到除了产生所述抗体的抗原以外的来自另一物种的抗原的能力。作为非限制性实例，如本文所述并且针对人类TREM2肽产生的抗TREM2抗体可表现出与来自不同物种(例如，猴或小鼠)的TREM2肽或蛋白的交叉反应性。

如关于核酸或蛋白(例如，抗体)所用的术语“分离的”表示所述核酸或蛋白基本上不含在自然状态下与其缔合的其他细胞组分。纯度和均质性通常使用分析化学技术如电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳)或色谱法(例如，高效液相色谱法)来确定。在一些实施方案中，分离的核酸或蛋白(例如，抗体)是至少85％纯的、至少90％纯的、至少95％纯的、或至少99％纯的。

术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)和它们的组合。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，α碳结合至氢、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此等类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以其通常已知的三字母符号或以IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的单字母符号来提及。

术语“多肽”和“肽”在本文中可互换地用于指单链中的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完整L-氨基酸、完整D-氨基酸、或L氨基酸和D氨基酸的混合物。

如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即，两个)或多聚体(即，三个或更多个)。蛋白质的单链多肽可通过共价键(例如二硫键)或非共价相互作用连接。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地指具有任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可通过DNA或RNA聚合酶并入链中的任何基质。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和它们的类似物。本文涵盖的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA，和具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。

术语“保守取代”和“保守突变”是指导致一个氨基酸用可被分类为具有类似特征的另一氨基酸取代的改变。以这种方式定义的保守性氨基酸组的类别的实例可包括：“带电荷/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)、和His(组氨酸或H)；“芳族组”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)、和(组氨酸或H)；和“脂族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)、和Cys(半胱氨酸或C)。在每个组内，也可鉴定子组。例如，带电荷或极性氨基酸的组可细分成包括以下的子组：“带正电荷子组”，包含Lys、Arg和His；“带负电荷子组”，包含Glu和Asp；和“极性子组”，包含Asn和Gln。在另一个实例中，芳族或环状组可细分成包括以下的子组：“氮环子组”，包含Pro、His和Trp；和“苯基子组”，包含Phe和Tyr。在另一个其他实例中，脂族组可细分成子组，例如“脂族非极性子组”，包含Val、Leu、Gly和Ala；和“脂族弱极性子组”，包含Met、Ser、Thr和Cys。保守突变的类别的实例包括对以上子组内的氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：以Lys取代Arg或相反，使得可维持正电荷；以Glu取代Asp或相反，使得可维持负电荷；以Ser取代Thr或相反，使得可维持游离-OH；以及以Gln取代Asn或相反，使得可维持游离-NH₂。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代天然存在的疏水性氨基酸，例如在活性位点中，以保持疏水性。

在两种或更多种多肽序列的情形下，术语“同一”或“同一性”百分比是指两个或更多个序列或子序列当使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测量来比较和比对比较窗口或指定区域的最大对应性时，为相同的或在指定区域内具有指定百分比的相同氨基酸残基，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更大百分比。

关于多肽的序列比较，通常一个氨基酸序列充当与候选序列进行比较的参考序列。比对可使用本领域技术人员可用的各种方法进行，例如目视比对或使用可公开获得的软件使用已知算法实现最大比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最大比对的参数可通过本领域技术人员确定。关于出于此应用目的而进行的多肽序列的序列比较，使用用于以默认参数比对两种蛋白质序列的BLASTP算法标准蛋白BLAST。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)、兔子、牛、猪、马和其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，受试者、个体或患者是人类。

术语“治疗(treating/treatment)”和类似术语在本文中通常用于表示获得所需药理学和/或生理学作用。“治疗(treating/treatment)”可指成功治疗或改善神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病或本文所述的另一种神经退行性疾病)的任何标记，包括任何客观或主观参数，例如缓解、缓和、患者存活改善、存活时间或存活率增加、症状减轻或者使得疾病更为患者所耐受、退化或衰弱速率减慢、或改善患者的身体或心理健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数。治疗作用可与未接受治疗的一名个体或一组个体相比较，或者与治疗前或治疗期间的不同时间点的同一患者相比较。

术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生物学上或药理学上相容以用于人类或动物的非活性药物成分，例如但不限于缓冲剂、载体、或防腐剂。

如本文所用，药剂(例如，如本文所述的抗体)的“治疗量”或“治疗有效量”是药剂的治疗、减轻、去除或减少受试者的疾病症状的严重程度的量。药剂(例如，如本文所述的抗体)的“治疗量”可改善患者存活，增加存活时间或存活率，减少症状，使得损伤、疾病或疾患(例如，神经退行性疾病)更耐受，减慢退化或衰弱速率，或改善患者身体或心理健康。

术语“施用”是指将药剂、化合物或组合物递送到所需生物作用位点的方法。这些方法包括但不限于局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、透皮递送、肌肉内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，如本文所述的抗体是经静脉内施用。

术语“对照”或“对照值”是指参考值或基线值。适当对照可由本领域技术人员确定。在一些情况下，对照值可相对于同一受试者或实验内的基线确定，例如在以抗TREM2抗体治疗前所获得的sTREM2测量值可为同一受试者中sTREM2水平的治疗后测量值的对照值。在其他情况下，对照值可相对于对照受试者(例如，健康对照或疾病对照)或对照受试者群体中的平均值(例如，健康对照或疾病对照，例如10、20、50、100、200、500、1000个或更多个对照受试者的群体)确定，例如，在基线下或治疗后的受试者sTREM2水平的测量值可与健康对照值相比较。

III.抗TREM2抗体

在一个方面，提供特异性结合到TREM2蛋白的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体特异性结合到人类TREM2蛋白。在一些实施方案中，抗TREM2抗体针对TREM2相对于其他TREM样受体(例如，TREM1)具有选择性。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是包含如本文所公开的一个或多个互补决定区(CDR)、重链可变区和/或轻链可变区序列的抗体。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含如本文所公开的一个或多个CDR、重链可变区和/或轻链可变区序列并且还包含如本文所公开的一种或多种功能特征，例如增强TREM2活性(例如，增强吞噬作用或增强细胞如髓系细胞、小神经胶质细胞或巨噬细胞的迁移、分化、功能或存活)的抗体或降低sTREM2水平的抗体。

抗TREM2抗体序列

在一些实施方案中，抗TREM2或其抗原结合片段包含来源于本文所述的以下抗TREM2抗体中的任一者的重链序列或其部分和/或轻链序列或其部分：克隆CL0020306、克隆CL0020188、克隆CL0020307和克隆CL0020123。这些克隆的CDR、重链可变区和轻链可变区氨基酸序列阐述于非正式序列表中。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是人源化和/或亲和力成熟抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自由以下组成的组的一个或多个CDR：

(a)与SEQ ID NO:4、12和29中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:4、12和29中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的重链CDR1(CDR-H1)序列；

(b)与SEQ ID NO:5、13、25、30、39、41和43中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:5、13、25、30、39、41和43中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的重链CDR2(CDR-H2)序列；

(c)与SEQ ID NO:6、14、17和31中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:6、14、17和31中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的重链CDR3(CDR-H3)序列；

(d)与SEQ ID NO:7、23和32中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:7、23和32中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的轻链CDR1(CDR-L1)序列；

(e)与SEQ ID NO:8和33中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:8和33中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的轻链CDR2(CDR-L2)序列；和

(f)与SEQ ID NO:9、18和34中任一者的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:9、18和34中任一者的氨基酸序列具有至多两个氨基酸取代的轻链CDR3(CDR-L3)序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(a)-(f)中的二、三、四、五、或全部六者。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(a)的CDR-H1、(b)的CDR-H2和(c)的CDR-H3。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(d)的CDR-L1、(e)的CDR-L2和(f)的CDR-L3。在一些实施方案中，具有至多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，具有至多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有两个氨基酸取代。在一些实施方案中，至多两个氨基酸取代是保守取代。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自由以下组成的组的一个或多个CDR：

(a)CDR-H1序列，其包含SEQ ID NO:4、12和29中任一者的氨基酸序列；

(b)CDR-H2序列，其包含SEQ ID NO:5、13、25、30、39、41和43中任一者的氨基酸序列；

(c)CDR-H3序列，其包含SEQ ID NO:6、14、17和31中任一者的氨基酸序列；

(d)CDR-L1序列，其包含SEQ ID NO:7、23和32中任一者的氨基酸序列；

(e)CDR-L2序列，其包含SEQ ID NO:8和33中任一者的氨基酸序列；和

(f)CDR-L3序列，其包含SEQ ID NO:9、18和34中任一者的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(a)-(f)中的二、三、四、五、或全部六者。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(a)的CDR-H1、(b)的CDR-H2和(c)的CDR-H3。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含(d)的CDR-L1、(e)的CDR-L2和(f)的CDR-L3。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-L3；或

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3；或

(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3；或

(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3；或

(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3；或

(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-L3；或

(g)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3；或

(h)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3；或

(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3；或

(j)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的CDR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3、包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:2、10、15、19、21、24、26、27、35、37、38、40、42、44、45、46和79中的任一者具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2、10、15、19、21、24、26、27、35、37、38、40、42、44、45、46和79中的任一者的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:3、11、16、20、22、28、36和68中的任一者具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3、11、16、20、22、28、36和68中的任一者的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含：含有与SEQ ID NO:2、10、15、19、21、24、26、27、35、37、38、40、42、44、45、46和79中的任一者具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:3、11、16、20、22、28、36和68中任一者具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2包含：含有氨基酸序列SEQ ID NO:2、10、15、19、21、24、26、27、35、37、38、40、42、44、45、46和79中的任一者的重链可变区，和含有氨基酸SEQ ID NO:3、11、16、20、22、28、36和68中的任一者的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含：

(a)与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(b)与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(c)与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(d)与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(e)与SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(f)与SEQ ID NO:19具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(g)与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(h)与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(i)与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:20具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(j)与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(k)与SEQ ID NO:26具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(l)与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(m)与SEQ ID NO:35具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(n)与SEQ ID NO:37具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(o)与SEQ ID NO:38具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(p)与SEQ ID NO:40具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(q)与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(r)与SEQ ID NO:44具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(s)与SEQ ID NO:45具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(t)与SEQ ID NO:46具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性的V_L序列；或

(u)与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的V_H序列和与SEQ ID NO:68具有至少85％序列同一性的V_L序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含由本文所公开的共有序列所涵盖的一个或多个序列。作为非限制性实例，共有序列可通过比对来自相同(或类似)种系的抗体的重链或轻链序列(例如CDR)来鉴定。在一些实施方案中，共有序列可由含有具有相同(或类似)长度并且/或具有至少一个高度类似CDR(例如，高度类似CDR3)的序列的抗体生成。在一些实施方案中，可比对并且比较这些抗体中的此类序列以鉴定保守性氨基酸或基序(即，其中序列的改变可改变蛋白质功能)和/或其中序列出现变化的区域(即，其中序列的变化不可能显著影响蛋白质功能)。或者，共有序列可通过比对结合到相同或类似(例如重叠)表位的抗体的重链或轻链序列(例如CDR)来鉴定以确定保守性氨基酸或基序(即，其中序列的变化可改变蛋白质功能)和在序列比对中出现变化的区域(即，其中序列的变化不可能显著影响蛋白质功能)。在一些实施方案中，可鉴定抗体中识别与如本文所公开的抗TREM2抗体相同或类似的表位的一个或多个共有序列。示例性共有序列包括SEQ ID NO:47-52。在共有序列SEQ ID NO:47-52中，大写字母表示在所比对序列(例如，所比对CDR序列)中绝对保守的氨基酸残基，而“X”或希腊字母(例如，“α”、“β”、“γ”、“δ”、“ε”或)表示在所比对序列内并非绝对保守的氨基酸残基。应理解，当选择氨基酸插入在由“X”或希腊字母标记的位置时，在一些实施方案中，所述氨基酸选自所比对序列中的相应位置处可见的那些氨基酸。

克隆CL0020123和CL0020123的变体

在一些实施方案中，抗TREM2抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR-H1序列，其包含序列GFSIEDFYIH(SEQ ID NO:29)；

(b)CDR-H2序列，其包含序列W-I-D-P-E-β₆-G-β₈-S-K-Y-A-P-K-F-Q-G(SEQ ID NO:47)，其中β₆是N或Q并且β₈是D或E；

(c)CDR-H3序列，其包含序列HADHGNYGSTMDY(SEQ ID NO:31)；

(d)CDR-L1序列，其包含序列HASQHINVWLS(SEQ ID NO:32)；

(e)CDR-L2序列，其包含序列KASNLHT(SEQ ID NO:33)；和

(f)CDR-L3序列，其包含序列QQGQTYPRT(SEQ ID NO:34)。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:30、39、41和43的CDR-H2序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:27、35、37、38、40、42、44、45和46中的任一者具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:27、35、37、38、40、42、44、45和46中的任一者的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:28和36中的任一者具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:28和36中的任一者的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:27的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:28的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQ ID NO:28具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:29、30和31的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:27具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:32、33和34的轻链CDR1-3并且与SEQID NO:28具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:29、30、31、32、33和34的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:27的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:28的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:43的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:29、43和31的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:32、33和34的轻链CDR1-3并且与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:29、43、31、32、33和34的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:42的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:41的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:45具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:45具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:29、41和31的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:45具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:32、33和34的轻链CDR1-3并且与SEQ ID NO:36具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:29、41、31、32、33和34的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:45的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:36的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

克隆CL0020188、CL0020306、CL0020307、和CL0020188的变体

在一些实施方案中，抗TREM2抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR-H1序列，其包含序列G-F-T-F-T-α₆-F-Y-M-S(SEQ ID NO:48)，其中α₆是D或N；

(b)CDR-H2序列，其包含序列V-I-R-N-β₅-β₆-N-β₈-Y-T-β₁₁-β₁₂-Y-N-P-S-V-K-G(SEQ ID NO:49)，其中β₅是K或R；β₆是A或P；β₈是G或A；β₁₁是A或T；并且β₁₂是G或D；

(c)CDR-H3序列，其包含序列γ₁-R-L-γ₄-Y-G-F-D-Y(SEQ ID NO:50)，其中γ₁是A或T；并且γ₄是T或S；

(d)CDR-L1序列，其包含序列Q-S-S-K-S-L-L-H-S-δ₁₀-G-K-T-Y-L-N(SEQ ID NO:51)，其中δ₁₀是N或T；

(e)CDR-L2序列，其包含序列WMSTRAS(SEQ ID NO:8)；和

(f)CDR-L3序列，其包含序列Q-Q-F-L-E-φ₆-P-F-T(SEQ ID NO:52)，其中φ₆是Y或F。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:4和12的CDR-H1序列。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:5、13和25的CDR-H2序列。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:6、14和17的CDR-H3序列。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:7和23的CDR-L1序列。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含选自SEQ ID NO:9和18的CDR-L3。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID No:2、10、15、19、21、24、26和79中的任一者具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2、10、15、19、21、24、26和79中的任一者的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:3、11、16、20、22和68中的任一者具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3、11、16、20、22和68中的任一者的轻链可变区。

克隆CL0020188和CL0020188的变体

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:15的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:16的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQ ID NO:16具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:4、5和17的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:15具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和18的轻链CDR1-3并且与SEQID NO:16具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:5、17、7、8和18的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:15的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:79的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:79的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:4、5和17的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:79具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:23、8和18的轻链CDR1-3并且与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:4、5、17、23、8和18的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:79的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:4、25和17的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:23、8和18的轻链CDR1-3并且与SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:4、25、17、23、8和18的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:22的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:68具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQID NO:68具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:4、25和17的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和9的轻链CDR1-3并且与SEQ ID NO:68具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、95％或97％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:4、25、17、7、8和9的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:24的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:68的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

克隆CL0020306

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQ ID NO:3具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:4、5和6的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:2具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和9的轻链CDR1-3并且与SEQ IDNO:3具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:4、5、6、7、8和9的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

克隆CL0020307

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的CDR-H1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的CDR-H2序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:14的CDR-H3序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-L1序列、含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-L2序列和含有氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-L3序列。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:10的重链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:11的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区，和含有与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸SEQ ID NO:12、13和14的重链CDR1-3并且与SEQ ID NO:10具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的重链可变区。在一些实施方案中，抗TREM2抗体包含含有分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:7、8和9的轻链CDR1-3并且与SEQ IDNO:11具有至少85％序列同一性(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体是与如本文所述的抗体(例如，包含分别含有氨基酸序列SEQ ID NO:12、13、14、7、8和9的重链CDR1-3和轻链CDR1-3的抗体，或包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的重链可变区和含有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区的抗体)竞争结合的抗体。

抗TREM2抗体的结合特征

在一些实施方案中，如本文所述的特异性结合到TREM2蛋白的抗体结合到细胞(例如，内源性表达TREM2的原代细胞或细胞系，例如人类巨噬细胞，或被工程化以表达TREM2的原代细胞或细胞系，例如，如以下实施例部分所述)上表达的TREM2。在一些实施方案中，特异性结合到如本文所述的TREM2蛋白的抗体结合到被纯化或重组TREM2蛋白或其部分或者结合到包含TREM2或其部分的嵌合蛋白(例如，包含TREM2的Fc-融合蛋白或包含TREM2胞外结构域的Fc-融合蛋白)。

在一些实施方案中，特异性结合到人类TREM2蛋白的抗体表现出与另一物种的一种或多种其他TREM2蛋白的交叉反应性。在一些实施方案中，特异性结合到人类TREM2蛋白的抗体表现出与食蟹猴(“cyno”)TREM2蛋白的交叉反应性。在一些实施方案中，特异性结合到人类TREM2蛋白的抗体表现出与小鼠TREM2蛋白的交叉反应性。在一些实施方案中，抗TREM2抗体表现出与人类TREM2、食蟹猴TREM2和小鼠TREM2的交叉反应性。

用于分析结合亲和力、结合动力学和交叉反应性的方法是本领域中已知的。这些方法包括但不限于固相结合测定(例如，ELISA测定)、免疫沉淀法、表面等离子体共振(例如，Biacore^TM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、动力排阻测定(例如，)、流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)、生物层干涉术(例如，Octet^TM(FortéBio,Inc.,MenloPark,CA))和蛋白质印迹分析。在一些实施方案中，使用ELISA来确定结合亲和力和/或交叉反应性。用于进行ELISA测定的方法是本领域中已知的，并且也描述于以下实施例部分中。在一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)来确定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用动力排阻测定来确定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用生物层干涉术确定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。

抗TREM2抗体所识别的表位

在一些实施方案中，抗TREM2抗体识别人类TREM2的表位与如本文所述的抗体克隆识别的表位相同或基本上相同。如本文所用，如关于由如本文所述的抗体克隆所识别的表位所用，术语“基本上相同”意指抗TREM2抗体识别的表位与由如本文所述的抗体克隆所识别的表位相同、或在所述表位内、或与所述表位几乎相同(例如，与所述表位具有至少90％序列同一性或相对于所述表位具有一个、两个或三个氨基酸取代，例如保守性取代)，或与所述表位具有显著重叠(例如，与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％重叠)。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体识别人类TREM2的表位与选自由以下组成的组的抗体克隆识别的表位相同或基本上相同：克隆CL0020306、克隆CL0020188、克隆CL0020307和克隆CL0020123。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体结合到人类TREM2的表位的TREM2柄区内。在一些实施方案中，抗TREM2抗体识别人类TREM2的表位，所述表位包含SEQ ID NO:1的残基129-172或残基131-169、在所述残基内、或由所述残基组成。在一些实施方案中，抗TREM2抗体识别人类TREM2的表位，所述表位包含SEQ ID NO:1的残基129-148、在所述残基内、或由所述残基组成。在一些实施方案中，抗TREM2抗体识别人类TREM2的表位，所述表位包含SEQ IDNO:1的氨基酸残基143-149、在所述残基内、或由所述残基组成。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是激活TREM2/DAP12信号传导(例如，通过诱导激酶如Syk的磷酸化)并结合到人类TREM2的表位的TREM2柄区内的激动剂。在一些实施方案中，抗TREM2抗体结合到人类TREM2的表位的TREM2柄区并抑制蛋白酶(例如，ADAM17)对TREM2的切割。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体结合到人类TREM2的表位的TREM2Ig可变(IgV)结构域内。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是激活TREM2/DAP12信号传导(例如，通过诱导激酶如Syk的磷酸化)并结合到人类TREM2的表位的TREM2IgV结构域的激动剂。在一些实施方案中，抗TREM2抗体结合到人类TREM2的表位，所述表位包含以下一者或多者或由以下一者或多者组成：(i)SEQ ID NO:1的氨基酸残基55-63(GEKGPCQRV(SEQ ID NO:70))，(ii)SEQID NO:1的氨基酸96-107(TLRNLQPHDAGL(SEQ ID NO:71))，和(iii)SEQ ID NO:1的氨基酸残基126-129(VEVL(SEQ ID NO:72))。

抗TREM2抗体的功能特征

在一些实施方案中，抗TREM2抗体(例如，具有一个或多个CDR、重链可变区和/或轻链可变区序列的如所公开的抗体)在如本文所公开的一种或多种TREM2活性方面起作用。例如，在一些实施方案中，抗TREM2抗体是调节sTREM2蛋白水平(例如，从细胞表面脱落到细胞外样品中的sTREM2水平)、调节与TREM2/DAP12信号传导复合物相互作用的激酶(例如，Syk激酶)的募集或磷酸化、和/或调节信号传导复合物下游的一种或多种活性(例如吞噬作用、细胞生长、细胞存活、细胞分化、细胞因子分泌、或细胞迁移)的抗体。在一些实施方案中，如本文所公开的抗TREM2抗体与参考抗体相比以更好的效能结合健康人类CSF或食蟹猴CSF中的可溶性TREM2蛋白(sTREM2)。在一些实施方案中，参考抗体由选自由以下组成的组的序列组合表示：SEQ ID NO:73和74；SEQ ID NO:75和76；和SEQ ID NO:77和78。在一些实施方案中，基本上如实施例11中所述进行效能测定。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强由配体诱导的一种或多种TREM2活性(例如，本文所述的那些)。在一些实施方案中，配体是脂质配体。TREM2脂质配体的实例包括但不限于1-棕榈酰基-2-(5'-氧代-戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POVPC)、2-花生四烯酸甘油(2-AG)、7-酮基胆固醇(7-KC)、24(S)羟基胆固醇(24OHC)、25(S)羟基胆固醇(25OHC)、27-羟基胆固醇(27OHC)、酰基肉碱(AC)、烷基酰基甘油磷酸胆碱(PAF)、α-半乳糖基神经酰胺(KRN7000)、双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)、心磷脂(CL)、神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸酯(C1P)、胆固醇酯(CE)、胆固醇磷酸酯(CP)、二酰基甘油34:1(DG 34:1)、二酰基甘油38:4(DG38:4)、二酰基甘油焦磷酸酯(DGPP)、二氢神经酰胺(DhCer)、二氢神经鞘磷脂(DhSM)、醚磷脂酰胆碱(PCe)、游离胆固醇(FC)、半乳糖基神经酰胺(GalCer)、半乳糖基鞘氨醇(GalSo)、神经节苷脂GM1、神经节苷脂GM3、葡糖基神经节苷脂(GlcSo)、汉克平衡盐溶液(Hank'sBalanced Salt Solution，HBSS)、Kdo2-脂质A(KLA)、乳糖基神经酰胺(LacCer)、溶血烷基酰基甘油磷酸胆碱(LPAF)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰甘油(LPG)、溶血磷脂酰肌醇(LPI)、溶血神经鞘磷脂(LSM)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、N-酰基-磷脂酰乙醇胺(NAPE)、N-酰基-丝氨酸(NSer)、氧化磷脂酰胆碱(oxPC)、棕榈酸-9-羟基-硬脂酸(PAHSA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰乙醇(PEtOH)、磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、二氢鞘氨醇、二氢鞘氨醇-1-磷酸酯(Sa1P)、神经鞘磷脂(SM)、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸酯(So1P)和硫酸脑苷脂。

sTREM2脱落的调节

在一些实施方案中，抗TREM2抗体改变样品中的sTREM2蛋白水平，例如从细胞表面脱落到细胞外样品中的sTREM2水平。在一些实施方案中，抗TREM2抗体降低sTREM2水平。

在一些实施方案中，如果经处理样品中sTREM2的量与对照值相比降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更大，则抗TREM2抗体降低sTREM2水平。在一些实施方案中，如果经处理样品中sTREM2的量与对照值相比降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则抗TREM2抗体降低sTREM2水平。在一些实施方案中，对照值是未经处理样品(例如，来自尚未用抗TREM2抗体处理的表达TREM2细胞的上清液，或来自尚未用抗TREM2抗体治疗的受试者的样品)或用适当非TREM2结合抗体处理的样品中的sTREM2的量。

在一些实施方案中，使用包含流体的样品测量sTREM2脱落，所述流体例如血液、血浆、血清、尿液或脑脊髓液。在一些实施方案中，样品包含脑脊髓液。在一些实施方案中，样品包含来自细胞培养物的上清液(例如，来自内源性表达TREM2的原代细胞或细胞系例如人类巨噬细胞或经工程化以表达TREM2的原代细胞或细胞系的上清液，例如，如以下实施例部分所述)。

在一些实施方案中，样品中sTREM2的水平使用免疫测定来测量。免疫测定是本领域中已知的并且包括但不限于酶免疫测定(EIA)，例如酶多因子免疫测定(EMIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、微粒酶免疫测定(MEIA)、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学、毛细管电泳免疫测定(CEIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光、化学发光免疫测定(CL)和电化学发光免疫测定(ECL)。在一些实施方案中，使用ELISA测定来测量sTREM2水平。在一些实施方案中，使用如以下实施例部分所述的ELISA测定来测量sTREM2水平。

激酶募集或磷酸化的调节

在一些实施方案中，抗TREM2抗体诱导与TREM2/DAP12信号传导复合物相互作用的激酶(例如但不限于Syk、ZAP70、PI3K、Erk、AKT或GSK3b)的磷酸化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体诱导与TREM2/DAP12信号传导复合物相互作用而不阻断天然TREM2配体的结合的激酶的磷酸化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强与TREM2/DAP12信号传导复合物相互作用的激酶的由TREM2配体(例如，脂质配体)诱导的磷酸化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体诱导或增强Syk的磷酸化。在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中Syk磷酸化水平与对照值相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更大，则抗TREM2抗体诱导或增强Syk磷酸化。在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中Syk磷酸化水平与对照值相比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则抗TREM2抗体诱导Syk磷酸化。在一些实施方案中，对照值是未经处理样品(例如，包含尚未用抗TREM2抗体处理的表达TREM2细胞的样品或来自尚未用抗TREM2抗体治疗的受试者的样品)、或已用TREM2配体而非抗TREM2抗体处理的样品、或用适当非TREM2结合抗体处理的样品中的Syk磷酸化水平。

为了检测和/或量化样品中的磷酸化(例如，Syk磷酸化)，在一些实施方案中，使用免疫测定。在一些实施方案中，免疫测定是酶免疫测定(EIA)、酶多因子免疫测定(EMIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、微粒酶免疫测定(MEIA)、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学、毛细管电泳免疫测定(CEIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光、化学发光免疫测定(CL)或电化学发光免疫测定(ECL)。在一些实施方案中，使用利用放大发光邻近均相测定(amplifiedluminescent proximity hom ogenous assay)(PerkinElmer Inc.)的免疫测定来检测和/或量化磷酸化。

在一些实施方案中，使用包含一种或多种细胞，例如一种或多种表达TREM2细胞(例如，内源性表达TREM2的原代细胞或细胞系，例如人类巨噬细胞或iPSC源性小神经胶质细胞，或被工程化以表达TREM2的原代细胞或细胞系，例如，如以下实施例部分所述)的样品测量磷酸化。在一些实施方案中，样品包含流体，例如血液、血浆、血清、尿液或脑脊髓液。在一些实施方案中，样品包含组织(例如，肺、脑、肾、脾、神经组织或骨骼肌)或来自此组织的细胞。在一些实施方案中，样品包含内源性流体、组织或细胞(例如，来自人类或非人类受试者)。

吞噬作用的调节

在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强对死细胞碎片、组织碎片、淀粉样蛋白β粒子或外来物质的吞噬作用。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强吞噬作用而不阻断天然TREM2配体的结合。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强由TREM2配体(例如，脂质配体)诱导的吞噬作用。在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中吞噬作用水平与对照值相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更大，则抗TREM2抗体增强吞噬作用。在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中吞噬作用与对照值相比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则抗TREM2抗体增强吞噬作用。在一些实施方案中，对照值是未经处理样品、已用TREM2配体而非抗TREM2抗体处理的样品、或用适当非TREM2结合抗体处理的样品中的吞噬作用水平。

在一些实施方案中，使用以经标记基质进行的吞噬作用测定来测量吞噬作用。吞噬作用测定是本领域中已知的。在一些实施方案中，对包含内源性表达TREM2的细胞，例如人类巨噬细胞或小神经胶质细胞的样品进行吞噬作用测定。在一些实施方案中，对包含已经工程化以表达TREM2的细胞的样品进行吞噬作用测定。在一些实施方案中，使用如以下实施例部分所述的人类巨噬细胞吞噬作用测定来测量吞噬作用。

细胞分化、功能、迁移和存活的调节

在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强细胞迁移、细胞存活、细胞功能或细胞分化(例如，关于髓系细胞、巨噬细胞和小神经胶质细胞，包括iPSC源性小神经胶质细胞和疾病相关小神经胶质细胞)。疾病相关小神经胶质细胞和检测疾病相关小神经胶质细胞的方法描述于Keren-Shaul等人,Cell,2017,169:1276-1290中。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强一种或多种细胞类型(例如，髓系细胞、巨噬细胞或小神经胶质细胞)的细胞迁移。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强一种或多种细胞类型(例如，髓系细胞、巨噬细胞或小神经胶质细胞)的细胞存活。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强一种或多种细胞类型(例如，髓系细胞、巨噬细胞或小神经胶质细胞)的细胞功能。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强一种或多种细胞类型(例如，髓系细胞、巨噬细胞或小神经胶质细胞)的细胞分化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强髓系细胞的迁移、存活、功能和/或分化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强巨噬细胞的迁移、存活、功能和/或分化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强小神经胶质细胞的迁移、存活、功能和/或分化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强小神经胶质细胞活化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强疾病相关小神经胶质细胞的迁移、存活、功能和/或分化。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强细胞迁移、细胞存活、细胞功能或细胞分化而不阻断天然TREM2配体的结合。在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强由TREM2配体(例如，脂质配体)诱导的细胞迁移、细胞存活、细胞功能或细胞分化。

在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中活性(例如，迁移、存活、功能或分化)水平与对照值相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更大，则抗TREM2抗体增强细胞迁移、细胞存活、细胞功能或细胞分化。在一些实施方案中，如果用抗TREM2抗体处理的样品中活性(例如，迁移、存活、功能或分化)水平与对照值相比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则抗TREM2抗体增强细胞迁移、细胞存活、细胞功能或细胞分化。在一些实施方案中，对照值是未经处理样品(例如，尚未用抗TREM2抗体处理的样品)、已用TREM2配体而非抗TREM2抗体处理的样品、或用适当非TREM2结合抗体处理的样品中的活性(例如，迁移、存活、功能或分化)水平。

在一些实施方案中，使用趋化性测定来测量细胞迁移。趋化性测定是本领域中已知的。在一些实施方案中，对包含内源性表达TREM2的细胞，例如人类巨噬细胞的样品进行细胞迁移测定(例如，趋化性测定)。在一些实施方案中，对包含已经工程化以表达TREM2的细胞的样品进行细胞迁移测定(例如，趋化性测定)。在一些实施方案中，使用如以下实施例部分所述的人类巨噬细胞趋化性测定来测量细胞迁移。

在一些实施方案中，使用细胞活力测定来测量细胞存活。细胞活力测定是本领域中已知的。在一些实施方案中，对包含内源性表达TREM2的细胞，例如人类巨噬细胞的样品进行细胞存活测定(例如，细胞活力测定)。在一些实施方案中，对包含已经工程化以表达TREM2的细胞的样品进行细胞存活测定(例如，细胞活力测定)。在一些实施方案中，使用如以下实施例部分所述的人类巨噬细胞活力测定来测量细胞存活。

在一些实施方案中，使用对于细胞而言适当的功能测定来测量细胞功能。例如，在一些实施方案中，使用吞噬作用测定(例如，如以下实施例部分所述)评估巨噬细胞功能。

在一些实施方案中，通过评估内源性表达TREM2的细胞分化的能力来测量细胞分化。例如，在一些实施方案中，通过评估巨噬细胞从单核细胞分化的能力(例如，如以下实施例部分所述)来测量细胞分化。

在一些实施方案中，体内测量小神经胶质细胞的活化。在一些实施方案中，使用TSPO-PET成像来测量小神经胶质细胞活化。TSPO-PET成像方法是本领域中已知的。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体增强小神经胶质细胞功能，而不增加神经炎症。神经炎症水平可通过测量细胞因子(例如，炎症性细胞因子)的水平来确定，所述细胞因子例如但不限于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-1ra、TGFβ、IL-15或IFN-γ。在一些实施方案中，使用免疫测定来测量细胞因子水平，所述免疫测定例如酶免疫测定(EIA)、酶多因子免疫测定(EMIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、微粒酶免疫测定(MEIA)、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学、毛细管电泳免疫测定(CEIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光、化学发光免疫测定(CL)或电化学发光免疫测定(ECL)。

IV.抗体的制备

在一些实施方案中，抗体通过以用于诱导抗体反应的抗原或抗原混合物免疫一只或多只动物(例如，小鼠、兔或大鼠)来制备。在一些实施方案中，施用抗原或抗原混合物以及佐剂(例如，弗氏佐剂)。在初始免疫后，可施用所述一种或多种抗原的一个或多个后续加强注射以提高抗体产生。在免疫后，例如从脾和/或淋巴组织收获抗原特异性B细胞。为了生成单克隆抗体，将B细胞与髓系细胞融合，随后针对抗原特异性进行筛选。制备抗体的方法也描述于以下实施例部分中。

编码目标抗体的重链和轻链的基因可从细胞克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可从杂交瘤克隆并且用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可从杂交瘤或浆细胞制备。或者，可使用噬菌体或酵母展示技术来鉴定特异性结合到所选抗原的抗体和Fab片段。抗体也可制成双特异性的，即能够识别两种不同抗原。抗体也可为杂缀合物，例如两个共价连接抗体或免疫毒素。

抗体可使用任何数目的表达系统产生，所述表达系统包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，例如杂交瘤或CHO细胞表达系统。许多此类系统可广泛获自商业供应商。在抗体包含V_H和V_L区的实施方案中，V_H和V_L区可使用单一载体，例如以双顺反子表达单元或在不同启动子控制下来表达。在其他实施方案中，V_H和V_L区可使用单独载体表达。如本文所述的V_H或V_L区可任选地在N末端包含甲硫氨酸。

在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。用于制造嵌合抗体的方法是本领域中已知的。例如，可制成嵌合抗体，其中来自一个物种例如小鼠的抗原结合区(重链可变区和轻链可变区)融合至另一物种例如人类的效应子区(恒定结构域)。作为另一个实例，可制成“类别转换”嵌合抗体，其中抗体的效应子区被不同免疫球蛋白类别或子类别的效应子区取代。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。一般来说，非人类抗体被人源化以便降低其免疫原性。人源化抗体通常包含一个或多个非人类(例如，源自小鼠可变区序列)可变区(例如，CDR)或其部分和可能一些非人类框架区或其部分，并且还包含一个或多个源自人类抗体序列的恒定区。用于使非人类抗体人源化的方法是本领域中已知的。转基因小鼠或其他生物体例如其他哺乳动物可用于表达人源化或人类抗体。使抗体人源化的其他方法包括例如可变结构域表面重整、CDR移植、移植特异性决定残基(SDR)、引导选择和框架改组。

作为人源化的替代方案，可生成完全人类抗体。作为非限制性实例，可产生如下转基因动物(例如小鼠)，它们一旦免疫就能在不存在内源性免疫球蛋白的情况下产生人类抗体的完整库。例如，已描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的纯合缺失使内源性抗体产生受到完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移至所述种系突变小鼠中，由此将会导致在抗原激发时产生人类抗体。作为另一个实例，可通过基于杂交瘤的方法，例如通过使用用于生成产生人类单克隆抗体的细胞系的原代人类B细胞来产生人类抗体。

也可使用噬菌体展示或酵母展示技术来产生人类抗体。在噬菌体展示中，可变重链和可变轻链基因库在噬菌体展示载体中被扩增并表达。在一些实施方案中，抗体文库是从人类来源扩增的天然库。在一些实施方案中，抗体文库是通过克隆重链和轻链序列并重组以生成具有不同抗原特异性的较大抗体池而制成的合成文库。噬菌体通常展示抗体片段(例如，Fab片段或scFv片段)，然后针对其与目标抗原的结合进行筛选。

在一些实施方案中，生成抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、V_H或V_HH)。已开发用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段经由蛋白水解消化完整抗体来获得。然而，这些片段现在可直接使用重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可从抗体噬菌体文库分离。或者，可直接从大肠杆菌细胞回收Fab'-SH片段并且化学偶联以形成F(ab')₂片段。根据另一种方法，F(ab')₂片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的其他技术将是本领域技术人员显而易知的。

在一些实施方案中，抗体或抗体片段缀合至另一分子，例如聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白，以提供延长的体外半衰期。

在一些实施方案中，提供包含如本文所述的抗TREM2抗体(或其抗原结合片段)的多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)对TREM2具有结合特异性并且对至少一个其他抗原具有结合特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)结合到两个不同TREM2表位。在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)能够在细胞表面处诱导TREM2聚集。用于使用共焦FRET显微术测量受体聚集的说明性方法描述于Wallrabe等人,Biophys.J.,2003,85:559-571。制成多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的方法包括但不限于在宿主细胞中重组共表达两对重链和轻链、“孔中结(knob-into-hole)”工程化、分子内三聚化，以及将抗体片段融合至另一抗体的N末端或C末端，例如串联可变结构域。

V.核酸、载体和宿主细胞

在一些实施方案中，使用重组方法制备如本文所公开的抗TREM2抗体。因此，在一些方面，本公开提供包含编码任一种如本文所述的抗TREM2抗体(例如，本文所述的CDR、重链可变区和轻链可变区中的任一者或多者)的核酸序列的分离核酸；包含此类核酸的载体；以及引入所述核酸以用于复制编码抗体的核酸和/或表达所述抗体的宿主细胞。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包含编码如本文所述的抗体或其抗原结合部分(例如，如以上标题为“抗TREM2抗体序列”的部分所述)的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码以下非正式序列表中公开的一个或多个氨基酸序列(例如，CDR、重链或轻链序列)的核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码与以下非正式序列表中所公开的序列(例如CDR、重链或轻链序列)具有至少85％序列同一性(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸可操作连接至异源核酸，例如异源启动子。

含有编码本公开的抗体的多核苷酸或其片段的适合载体包括克隆载体和表达载体。虽然所选的克隆载体可根据预期使用的宿主细胞而改变，有用的克隆载体通常具有自我复制能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单一靶标，并且/或可携带可用于选择含有所述载体的克隆的标志物的基因。实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)和其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA、和穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可获自商业供应商，例如BioRad、Strategene和Invitrogen。

表达载体通常是含有本公开的核酸的可复制多核苷酸构建体。表达载体可在宿主细胞中复制，呈附加体形式或作为染色体DNA的整体部分。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒)和任何其他载体。

适用于克隆或表达如本文所述的多核苷酸或载体的宿主细胞包括原核或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人类细胞，例如人类胚胎肾(HEK)细胞。

在另一方面，提供制成如本文所述的抗TREM2抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞(例如，表达如本文所述的多核苷酸或载体的宿主细胞)。在一些实施方案中，随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。

VI.使用抗TREM2抗体的治疗方法

在另一方面，提供使用如本文所公开的抗TREM2抗体(例如，如以上部分III中所述的抗TREM2抗体)的治疗方法。在一些实施方案中，提供治疗神经退行性疾病的方法。在一些实施方案中，提供调节一种或多种TREM2活性(例如，患有神经退行性疾病的受试者中)的方法。

在一些实施方案中，提供治疗神经退行性疾病的方法。在一些实施方案中，神经退行性疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、原发性年龄相关tau蛋白病、进行性核上性麻痹(PSP)、额颞叶痴呆、额颞叶痴呆伴与17号染色体相关的帕金森症、嗜银颗粒性痴呆、肌萎缩性侧索硬化、关岛型肌萎缩性侧索硬化/帕金森症-痴呆综合征(ALS-PDC)、皮质基底节变性、慢性创伤性脑病、克雅病、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、GSS氏病、球状胶质tau蛋白病、瓜德罗普岛帕金森症伴痴呆、瓜德罗普岛PSP、哈勒沃登-施帕茨病、遗传性弥漫性脑白质病变合并球样变(HDLS)、亨廷顿病、包涵体肌炎、多系统萎缩症、肌强直性营养不良、那-哈病、神经原纤维缠结优势型痴呆、C型尼曼-匹克病、苍白球-脑桥-黑质变性、帕金森病、皮克氏病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结性痴呆。在一些实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，神经退行性疾病是那-哈病。在一些实施方案中，神经退行性疾病是额颞叶痴呆。在一些实施方案中，神经退行性疾病是帕金森病。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用特异性结合到人类TREM2蛋白的分离抗体或其抗原结合片段(例如如本文所述的抗TREM2抗体)或包含如本文所述的抗TREM2抗体的药物组合物。

在一些实施方案中，如本文所述的抗TREM2抗体(或其抗原结合部分或药物组合物)用于治疗以TREM2的突变为特征的神经退行性疾病。在一些实施方案中，以TREM2的突变为特征的神经退行性疾病是阿尔茨海默病，例如以TREM2的R47H突变为特征的阿尔茨海默病。

在一些实施方案中，提供调节受试者中(例如，患有神经退行性疾病的受试者中)的一种或多种TREM2活性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括调节sTREM2的水平；调节与TREM2/DAP12信号传导复合物相互作用的激酶(例如，Syk激酶)的募集或磷酸化；调节吞噬作用(例如，对细胞碎片、淀粉样蛋白β粒子等的吞噬作用)；调节细胞迁移(例如，髓系细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞和疾病相关小神经胶质细胞的迁移)；和/或调节细胞分化(例如，关于髓系细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞和疾病相关小神经胶质细胞)。在一些实施方案中，提供增强患有神经退行性疾病的受试者中的一种或多种TREM2活性的方法。在一些实施方案中，提供降低患有神经退行性疾病的受试者的sTREM2水平的方法。在一些实施方案中，调节受试者中的一种或多种TREM2活性的方法包括向所述受试者施用特异性结合到人类TREM2蛋白的分离抗体或其抗原结合部分(例如，如本文所述的抗TREM2抗体)或包含如本文所述的抗TREM2抗体的药物组合物。

在一些实施方案中，待治疗受试者是人类，例如人类成人或人类儿童。

在一些实施方案中，提供减少患有神经退行性疾病的受试者中的斑块积聚的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用如本文所述的抗体或药物组合物。在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默病。在一些实施方案中，受试者是神经退行性疾病的动物模型(例如，5XFAD或APP/PS1小鼠模型)。在一些实施方案中，斑块积聚通过淀粉样蛋白斑块成像和/或Tau成像，例如使用正电子发射断层摄影(PET)扫描来测量。在一些实施方案中，施用抗TREM2抗体使斑块积聚与基线值(例如，在施用抗TREM2抗体之前受试者中的斑块积聚水平)相比减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量或剂量的抗TREM2抗体。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。然而，所述剂量可根据若干因素而变化，所述因素包括所选施用途径、组合物的配制、患者反应、疾患的严重程度、受试者体重和处方医师的判断。剂量可随时间推移按个别患者所需而增加或减少。在某些情况下，最初向患者给予低剂量，然后增加至患者可耐受的有效剂量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

如本文所述的抗TREM2抗体的施用途径可为口服、腹膜内、透皮、皮下、静脉内、肌肉内、鞘内、吸入、局部、病灶内、直肠、支气管内、经鼻、透粘膜、肠内、经眼或经耳递送，或本领域中已知的任何其他方法。在一些实施方案中，抗体是经口、静脉内或腹膜内施用的。

在一些实施方案中，经延长的时段向受试者施用抗TREM2抗体(和任选地另一种治疗剂)，例如持续至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350天或更长时间。

VII.药物组合物和药盒

在另一方面，提供包含特异性结合到人类TREM2蛋白的抗体的药物组合物和药盒。在一些实施方案中，所述药物组合物和药盒是用于治疗神经退行性疾病。在一些实施方案中，药物组合物和药盒是用于调节(例如，增强或抑制)一种或多种TREM2活性，例如Syk磷酸化。在一些实施方案中，所述药物组合物和药盒是用于调节(例如，降低)sTREM2水平。

药物组合物

在一些实施方案中，提供包含抗TREM2抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是以上部分III中所述的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的抗TREM2抗体并且还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体包括生理上相容并且不干扰或以其他方式抑制活性剂活性的任何溶剂、分散介质或包衣剂。各种药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的。

在一些实施方案中，载体适于静脉内、肌肉内、口服、腹膜内、鞘内、透皮、局部或皮下施用。药学上可接受的载体可含有一种或多种生理学上可接受的化合物，其例如用于使组合物稳定或增加或减少活性剂的吸收。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，例如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白；降低活性剂的清除率或水解的组合物；或赋形剂；或其他稳定剂和/或缓冲剂。其他药学上可接受的载体及其制剂是本领域中众所周知的。

本文所述的药物组合物可以本领域技术人员已知的方式，例如借助于常规混合、溶解、造粒、糖锭制备、乳化、囊封、覆埋或冻干工艺来制造。以下方法和赋形剂仅为示例性而绝非限制性。

对于口服施用，抗TREM2抗体可通过将其与本领域中众所周知的药学上可接受的载体组合来配制。此类载体能够将所述化合物配制成片剂、丸剂、糖锭、胶囊、乳液、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于所治疗的患者口服摄取。口服使用的药物制剂可通过以下获得：将化合物与固体赋形剂混合物、任选地研磨所得混合物、并且需要时在加入合适助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭核心。合适的赋形剂包括例如填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡唑烷酮(PVP)。需要时，可添加崩解剂，例如交联聚乙烯基吡唑烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

抗TREM2抗体可被配制用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用。对于注射，可通过以下将一种或多种化合物配制成制剂：将所述一种或多种化合物溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(例如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇)中；以及必要时利用常规添加剂，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，化合物可在水溶液中，例如在生理学上相容的缓冲液(例如汉克氏溶液(Hanks's)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液)中配制。用于注射的制剂可在添加防腐剂的情况下以单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中呈现。组合物可采用例如于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

在一些实施方案中，抗TREM2抗体被制备用于以持续释放、受控释放、延长释放、定时释放或延迟释放制剂，例如以含有活性剂的固体疏水性聚合物的可半渗透基质递送。各种类型的持续释放材料已得到确立并且是本领域技术人员众所周知的。当前延长释放制剂包括膜包衣片剂、多微粒或球粒系统、使用亲水性或亲脂性材料的基质技术和具有成孔赋形剂的基于蜡的片剂。持续释放递送系统可根据其设计在数小时或数天时程内，例如4、6、8、10、12、16、20、24小时或更长时间内释放所述化合物。通常，持续释放制剂可使用天然存在或合成聚合物来制备，所述聚合物例如聚合乙烯基吡唑烷酮，例如聚乙烯基吡唑烷酮(PVP)；羧基乙烯基亲水性聚合物；疏水性和/或亲水性水胶体，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；和羧基聚亚甲基。

通常，用于体内施用的药物组合物是无菌的。灭菌可根据本领域中已知的方法完成，所述方法例如热灭菌、蒸汽灭菌、无菌过滤或辐射。

本公开的药物组合物的剂量和所需药物浓度可根据预期的特定用途而变化。适当剂量或施用途径的确定完全在本领域技术人员的技能范围内。合适的剂量也描述于以上部分VI中。

药盒

在一些实施方案中，提供包含抗TREM2抗体或其抗原结合片段的药盒。在一些实施方案中，抗TREM2抗体是以上部分III中所述的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述药盒还包含一种或多种额外治疗剂。例如，在一些实施方案中，所述药盒包含如本文所述的抗TREM2抗体并且还包含用于治疗神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的一种或多种额外治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是用于治疗神经退行性疾病的认知或行为症状的药剂(例如，抗抑郁药、多巴胺激动剂、或抗精神病药)。在一些实施方案中，治疗剂是神经保护剂(例如，卡比多巴/左旋多巴、抗胆碱能药、多巴胺能药、单胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、谷氨酸能药、组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂、大麻素、半胱天冬酶抑制剂、褪黑激素、抗炎剂、激素(例如，雌激素或孕酮)、或维生素)。

在一些实施方案中，药盒包含如本文所述的抗TREM抗体并且还包含一种或多种用于测量sTREM2水平的试剂。在一些实施方案中，药盒包含如本文所述的抗TREM抗体并且还包含一种或多种用于测量TREM2活性(例如，用于测量Syk磷酸化)的试剂。

在一些实施方案中，药盒还包含含有用于实践本文所述的方法的指南(即方案)的说明性材料(例如，用于使用药盒进行如以上部分VI中所述的治疗方法的说明书)。虽然说明性材料通常包含书写或印刷材料，但它们不限于此类材料。本公开涵盖能够存储此类说明书并向最终用户传达所述说明的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、磁匣、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)等。此类介质可包括提供此类说明性材料的互联网网站。

VIII.实施例

本发明将借助于特定实施例更详细地加以描述。提供以下实施例以仅用于说明性目的，并且并非旨在以任何方式限制本发明。

实施例1.抗TREM2抗体的生成和初始表征

小鼠Fc融合的人类TREM2ECD的重组表达和纯化

将人类TREM2(UniProtKB ID-Q9NZC2)的胞外结构域(残基19-172)亚克隆到具有来自小鼠IgGκ链V-III的分泌信号的pRK载体中，将氨基酸1-20(UniProtKB ID–P01661)亚克隆在N末端区域，并且将小鼠Fc标签亚克隆在具有GGGGS(SEQ ID NO:64)的C末端区域的TREM2ECD与Fc之间。

使用Expi293F^TM表达系统试剂盒根据制造商说明书将纯化质粒转染到Expi293F^TM细胞(Thermo Fisher)中。为了抑制N-连接聚糖的成熟并减少糖基化异质性，在转染后立即将高甘露糖苷酶I抑制剂几夫碱(kifunensine)(Sigma)以1μg/mL浓度添加到培养基中。转染细胞在6％CO₂加湿气氛下在125rpm和37℃回转式振荡器(Infors HT Multitron)中孵育。在转染后16小时将ExpiFectamine^TM 293转染增强子1和2添加到细胞中，并且在转染后96小时收获培养基上清液。向澄清上清液中补充无EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)并将其储存于-80℃。

对于rhTREM2-Fc分离，将澄清培养基上清液装载在HiTrap MabSelect SuRe蛋白A亲和柱(GE Healthcare Life Sciences)上并以200mM精氨酸和137mM琥珀酸盐缓冲液pH5.0洗涤。在100mM QB柠檬酸盐缓冲液pH 3.0和50mM NaCl中洗脱融合蛋白。在洗脱后立即将1M Tris-HCl缓冲液pH 8.0添加到蛋白质溶液中以中和pH。通过尺寸排阻色谱法(SEC)在Superdex 200 increase 10/300 GL柱(GE Healthcare Life Sciences)上分离蛋白聚集物。将SEC流动相缓冲液保持在20mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl和50mM精氨酸下，其也是蛋白质储存缓冲液。在AKTA纯或AKTA Avant系统(GE Healthcare Life Sciences)上进行全部色谱法步骤。

His标记的TREM2 ECD的重组表达和纯化

将TREM2(UniProtKB-Q9NZC2)的胞外结构域(残基19-172)亚克隆到具有来自小鼠Igκ链V-III的分泌信号的pRK载体中，将氨基酸1-20(UniProtKB ID–P01661)亚克隆在N末端区域，并且将6X-His tag(SEQ ID NO:65)亚克隆在C末端区域。通过测序验证插入物并进行maxi制备型质粒纯化。

使用Expi293F^TM表达系统试剂盒根据制造商说明书将纯化质粒转染到Expi293F^TM细胞(Thermo Fisher)中。转染细胞在6％CO₂加湿气氛下在125rpm和37℃回转式振荡器(Infors HT Multitron)中孵育。在转染后16小时将ExpiFectamine^TM 293转染增强子1和2添加到细胞中，并且在转染后96小时收获培养基上清液。

向收获培养基中补充1M咪唑pH 8.0至10mM最终浓度并使用孔径为0.4微米的Nalgene^TM Rapid-Flow^TM一次性过滤单元(Thermo Fisher)过滤。将HisPur^TM Ni-NTA树脂(Thermo Fisher)用MQ水洗涤并用装载缓冲液(20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl和10mM咪唑)平衡。使用重力流动方法进行亲和纯化。将所收获培养基装载到树脂上并且将非特异性结合蛋白用补充50mM和100mM咪唑的装载缓冲液洗涤。将结合的His标记TREM2胞外结构域用20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl和200mM咪唑洗脱。使用Amicon 10kDa浓缩器浓缩洗脱蛋白并通过凝胶过滤色谱法使用AKTA Avant系统(GE Healthcare Life Sciences)进一步纯化所述浓缩蛋白。将所述蛋白装载到以1x PBS平衡的HiLoad Superdex 200 16/600(GEHealthcare Life Sciences)柱上并使用1x PBS作为电泳缓冲液洗脱和分级。通过在变性和天然条件下在聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶上进行电泳来分析洗脱级分。通过分析型尺寸排阻色谱法和完整蛋白质量测定进一步表征洗脱级分。使用来自PAGE和分析型表征的结果来合并高度糖基化蛋白级分并将这些级分等分并储存于-80℃。

抗体的生成

使用标准方案利用rhTREM2-Fc免疫原或表达全长Trem2受体的BWZ细胞使啮齿动物(小鼠和大鼠)免疫。在整个免疫中使用不同时间点收集的血清测量滴度。使用流式细胞术利用rhTREM2-Fc免疫原和表达全长TREM2的活BWZ细胞进行抗原特异性免疫反应的检测。候选抗体的选择标准包括啮齿动物抗体产生和与TREM2结合的特异性，如通过流式细胞术所检测。从动物免疫组织(包括脾、淋巴结和骨髓)分离抗体分泌细胞。

分析单细胞悬浮液以确定所分泌抗体的结合特性。将抗体分泌细胞装载到微流体装置并在纳升体积反应室中分离以便能够使用荧光和基于明场图像的显微术测定来检测所分泌抗体(参见例如美国专利第9,188,593号)。进行结合测定，其涉及检测抗体与抗原包被微珠的结合，检测可溶性荧光标记抗原与珠粒上固定的抗体的结合，以及检测抗体与细胞表面表达抗原的结合。细胞表面表达抗原包括细胞表面上呈递的抗原的重组形式和天然形式。

使用图像分析来鉴定展示阳性荧光信号的腔室，这指示产生具有所需特性的抗体的单细胞的存在，并且回收腔室内容物并在384孔板中裂解(参见例如美国专利第10,087,408号)。然后使单细胞裂解物进行RT-PCR以扩增重链和轻链可变区序列。然后对所得扩增子进行测序以确定来自所选单细胞的配对重链和轻链可变区的cDNA序列。手动检查所得序列并分析以确定序列多样性和体细胞高突变。基于筛选数据和序列多样性选择序列用于表达。对所表达抗体进行测试以证实抗原结合特异性。

抗TREM2抗体的初级筛选

如下在表达TREM2的HEK 293细胞、野生型iPSC和TREM2敲除iPSC中进行抗体的初级筛选。

1.在表达TREM2的HEK细胞中筛选TREM2结合

通过用分别表达野生型人类TREM2和DAP12和单独DAP12的载体转染细胞来生成稳定表达人类TREM2/DAP12的HEK 293细胞系。选择稳定表达克隆，并且通过流式细胞术评估细胞表面TREM2表达。使用APC结合的大鼠抗人类/小鼠TREM2单克隆抗体(R&D，目录号MAB17291)来检测表面TREM2表达。选择展示最高野生型TREM2表达水平的克隆并且将其命名为“HEK293-H6”。通过蛋白质印迹法分析稳定表达DAP12的克隆，并且将所选克隆命名为“HEK293-DAP12#1”。

通过0.05％胰蛋白酶收获过表达人类TREM2(HEK293-H6)的HEK 293和过表达GFP(B5)的HEK 293并且在37℃下孵育2小时。在孵育后，将细胞离心并以FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次。将混合细胞以每种细胞系10⁶/mL的密度重悬于具有人类TrustainFcX溶液(Biolegend，目录号422302)的FACS缓冲液中。将混合细胞系以200,000个细胞/孔接种在96孔圆底板中并在室温下孵育20分钟。在孵育后，将细胞离心并与约0–200nM剂量滴定的抗TREM2抗体一起在冰上孵育45分钟。在孵育后，将细胞离心并用FACS缓冲液洗涤三次。然后将细胞与二级抗体(Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人类IgG(H+L),Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号109-606-088，1:800稀释)一起在冰上孵育30分钟。在孵育后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，将其重悬于100μL FACS缓冲液中，并通过流式细胞术(BD FACSCanto II,San Jose,CA)分析，对于每个样品获得30,000个事件。通过FlowJo软件计算每种细胞的平均荧光强度并将其用于生成剂量反应结合曲线。

图1示出结合HEK293-H6细胞中的细胞表面受体TREM2的示例性抗体的代表性结果。

对TREM2依赖性pSyk信号传导的激活的评估

在人类巨噬细胞或HEK293-H6细胞中使用来自Perkin-Elmer的商用AlphaLisa测定来测量TREM2依赖性pSyk信号传导的激活。

对于涉及使用含有70％DOPC和30％POPS的脂质囊泡的所有实验，在实验的两周内如下制备脂质囊泡：将7mg DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和3mg POPS(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸)组合于玻璃小瓶的氯仿中并且在N₂气体流下干燥1-2小时或直至完全干燥。将脂质混合物重悬于1mL HBSS(最终脂质浓度为约10mg/mL)并涡旋2-3分钟。随后，使用以一个100-nm孔径膜构建的Avanti微型挤压机挤压脂质悬浮液以形成10mg/mL小单层囊泡。

1.细胞中抗体的给药

测定前一天，将人类巨噬细胞或HEK293-H6细胞分别以100,000个细胞/孔或40,000个细胞/孔接种在包被聚D-赖氨酸的96孔板上。将抗体以300nM开始稀释到PBS中并以10点连续稀释滴定继续，各点之间为3倍稀释。对于拮抗剂剂量反应曲线，在抗体/PBS混合物中还包括1mg/mL最终浓度的含有70％DOPC和30％POPS的脂质囊泡。使用Biotek 405/406板洗涤器将细胞用HBSS洗涤3次，之后使用Hamilton Nimbus液体处理器每孔添加50μL抗体/PBS(具有或不具有囊泡)。然后将板转移至37℃孵育器持续5分钟。通过轻击所述板来去除脂质体/抗体溶液，并且使用液体处理器添加含有1μM PMSF的40μL裂解缓冲液(CellSignaling Technologies,CST)。然后将裂解物冷冻在-80℃下或立即以AlphaLisa测定进行测定。

制备人类巨噬细胞用于如下测定。根据RosetteSep人类单核细胞富集混合方案(Stemcell Technologies,REF#15068)从新鲜血液分离人类单核细胞。将分离的单核细胞以洗涤缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤并重悬于10mL ACK裂解缓冲液(ThermoFisherScientific，目录号A10492)中以裂解红血细胞。添加20mL洗涤缓冲液以终止细胞裂解，并且将样品离心并再一次用培养基(RPMI、10％Hyclone FBS、1％丙酮酸钠、1％Glutamax、1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素)洗涤。然后在250-mL烧瓶中在培养基中在50ng/mL人类重组M-CSF(Gibco，目录号PHC9501)存在下使人类单核细胞分化成巨噬细胞。在第3天掺入新鲜人类M-CSF并且随后在第5天收获人类巨噬细胞并用于测定。

2.AlphaLisa测定

使用Perkin Elmer pSyk AlphaLisa试剂盒的标准方案测定细胞裂解物的pSyk。简言之，将10μL裂解物/孔转移至白色不透明384孔Optiplate(Perkin Elmer)。接着，每孔添加5μL Acceptor Mix(含有受体珠粒的工作溶液)，接着以箔密封物进行密封并在室温下孵育1小时。随后，在减少光照条件下向每个孔添加5μL Donor Mix(含有供体珠粒的工作溶液)。再次密封板并在室温下孵育1小时。最后，在Perkin Elmer EnVision板读取器上使用AlphaLisa设置读取所述板。

图2示出原代人类巨噬细胞中pSyk信号激活的代表性抗TREM2抗体剂量反应曲线。实心黑色圆圈(●)表示抗TREM2抗体，并且空心白色圆圈(°)表示同型对照。每条曲线表示三个独立实验的平均值，并且EC₅₀值提供于下表1中。结果指示抗TREM2抗体能够激活原代人类巨噬细胞中的TREM2-DAP12 ITAM信号传导。

iPSC小神经胶质细胞中的脂质体反应测定

TREM2激动剂抗体和含有磷脂酰丝氨酸的脂质体经由TREM2激活pSyk。为了理解在脂质体存在下抗TREM2抗体对Syk信号传导的作用，将iPSC小神经胶质细胞用抗TREM2抗体预处理，接着评定细胞中的脂质体反应。

在测定前，首先使用可商购获得的试剂盒(来自StemCell Technologies的STEMdiff Hematopoietic试剂盒)使iPSC分化成造血祖细胞(HPC)。将HPC转移至含有原代人类星形细胞的板中并共培养14-21天。一旦共培养物中的浮动细胞主要鉴定为成熟小神经胶质细胞(>80％)，则将所述小神经胶质细胞用于测定。

在测定前两天，将人类iPSC小神经胶质细胞以30,000个细胞/孔接种在包被聚D-赖氨酸的96孔板上。将抗体以100nM稀释到含有IMDM、10％Hyclone FBS和1％青霉素-链霉素的培养基中，并且向所述细胞给予抗体溶液持续24小时或在37℃下持续5分钟。随后，将细胞用HBSS洗涤一次并且然后在37℃下给予1mg/mL含有70％DOPC和30％POPS的脂质囊泡持续5分钟。通过轻击所述板来去除脂质体溶液，并且添加30μL含有1μM PMSF的裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies,CST)。然后将裂解物冷冻在-80℃或立即以AlphaLisa测定进行测定。如上文所述使用Perkin Elmer pSyk AlphaLisa试剂盒的标准方案测定细胞裂解物的pSyk。

图3A和图3B示出与抗TREM2抗体一起孵育、接着给予脂质囊泡并评定细胞中的脂质体反应的人类iPSC小神经胶质细胞中的pSyk信号激活。白色条指示使用PBS代替脂质囊泡作为对照进行的孵育。数据表示2-7个独立实验的平均值和标准误差。图3A示出用抗体预处理5分钟的iPSC小神经胶质细胞的数据，并且图3B示出用抗体预处理24小时的iPSC小神经胶质细胞的数据。结果显示用抗TREM2抗体预处理人类iPSC小神经胶质细胞使得由脂质体引发的磷酸Syk信号与同型对照相比增加，这表明抗TREM2抗体不会干扰反而会增强细胞中的pSyk信号传导的脂质活化。

人类TREM2 NFAT报告基因测定

如下生成人类TREM2/DAP12表达Jurkat NFAT细胞系。用表达人类TREM2和DAP12的慢病毒载体感染Jurkat NFAT报告基因细胞并在含有10％Hyclone FBS和1％亲霉素/链霉素的RPMI中培养。在嘌呤霉素和Zeocin存在下选择稳定表达的克隆。通过流式细胞仪使用生物素化抗TREM2抗体(SEQ ID NO:66和67)评估细胞表面TREM2表达。选择显示最高野生型TREM2表达水平的克隆并将其命名为hTrem2/NFAT Jurkat报告基因细胞以用于下文所述的测定。

在测定前一天，将96孔板用0-500nM剂量滴定(45μL/孔，总计12个点)的抗TREM2抗体或同型对照预包被，并在4℃下孵育过夜。在过夜孵育后，将预包被板用PBS洗涤两次并且然后装载200μL新鲜培养基(具有10％Hyclone FBS和1％亲霉素/链霉素的RPMI)中的hTrem2/NFAT Jurkat报告基因细胞(10⁶个细胞/孔)。将板在37℃下孵育24小时，之后向每个孔中添加50μL/孔quantlucia溶液，并充分混合。对于分析，从每个孔中移出20μL溶液并将其转移至384孔白色板以用于通过光度计(Perkin Elmer Envision)测量信号。

图4包括如通过检测报告基因荧光素酶所测量的用于活化NFAT的代表性抗TREM2抗体剂量反应曲线，并且活化的EC₅₀值提供于下表1中。图4中的结果说明相对于同型对照，候选抗TREM2抗体能够诱导NFAT活化和充分下游信号传导以激活转录反应。

人类巨噬细胞的存活测定

根据RosetteSep人类单核细胞富集混合方案(Stemcell Technologies，目录号15068)分离人类单核细胞。将分离的单核细胞以洗涤缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤并重悬于10mL ACK裂解溶液(ThermoFisher Scientific，目录号A10492)中以裂解红血细胞。添加20mL洗涤缓冲液以终止裂解。将细胞悬浮液离心并用培养基(RPMI1640+10％FBS+青霉素/链霉素)洗涤一次。将细胞以10⁶个细胞μL/mL的密度重悬于培养基中并用于下文所述的存活测定中。

在测定前一天，将96孔板用0-200nM剂量滴定(45μL/孔，总计12个点)的抗TREM2抗体或同型对照预包被，并且在4℃下孵育过夜。在过夜孵育后，将预包被板用PBS洗涤两次并且然后在低浓度人类M-CSF(5ng/mL,Gibco，目录号PHC9501)存在下装载人类单核细胞(10⁵个细胞/孔)。在37℃下5天后，抽吸培养基，并且向每个孔中添加100μL PBS+100μLCelltiter-glo培养基(Promega，目录号G7571)。在孵育10分钟后，将细胞培养基转移至对于光度计用途相容的多孔板，并且记录细胞活力的发光。

图5示出在低M-CSF条件下人类巨噬细胞中的细胞存活的代表性抗TREM2抗体剂量反应曲线，并且存活的EC₅₀值提供于下表1中。结果指示TREM2激动剂抗体具有诱导转录反应的充分受体活化能力以用于在M-CSF条件下调节细胞功能并促进人类巨噬细胞的存活。

抗体的Biacore动力学测量

使用表面等离子体共振(Biacore^TM 8K仪器)来测量抗TREM2抗体对人类和食蟹猴TREM2ECD的亲和力。使用人类Fab捕获试剂盒(GE Healthcare Life Sciences，目录号28958325)在Biacore系列S CM5传感器芯片(GE Healthcare Life Sciences，目录号29149604)上捕获抗TREM2抗体。以30μL/min流速注射重组人类或食蟹猴TREM2的连续3倍稀释液。在HBS-EP+电泳缓冲液(GE Healthcare Life Sciences，目录号BR100669)中，监测抗体结合持续300秒，接着监测抗体解离持续600+秒。通过从空白流动池减去RU值来校正结合反应。使用k_on和k_off的同时拟合的1:1Languir模型进行动力学分析。K_D结合值提供于下表1中。

表1.抗体的体外特征

NB:未检测到结合

ND：未测定

实施例2.人类巨噬细胞中可溶性TREM2水平和吞噬作用行为的调节

人类巨噬细胞中可溶性TREM2剂量反应测定

如上文所述生成人类巨噬细胞。在测定前一天，将人类巨噬细胞以100,000个细胞/孔接种在包被聚D-赖氨酸的96孔板上。将抗体以人类巨噬细胞培养基(RPMI、10％Hyclone FBS、1％丙酮酸钠、1％Glutamax、1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素)稀释，从300nM开始并且以10点连续稀释滴定继续，各点之间为3倍稀释。向细胞给予所述抗体并孵育24小时。在与抗体一起孵育后，将所述板离心以去除碎片，并且收集上清液以用于可溶性TREM2测量。

如下测量可溶性TREM2。简言之，在4℃下将MSD小斑点链霉素板(Meso ScaleDiscovery)用生物素化抗hTREM2单克隆抗体(R&D Systems)包被过夜。然后在室温下将板用3％BSA/TBST封闭1小时。通过加热至95℃持续5分钟来以含SDS缓冲液制备样品和标准物。在封闭后在测定板中以3％BSA/TBST 1:10稀释所制备样品和标准物。将以3％BSA/TBST稀释的TREM2-His蛋白用作用于绝对量化的标准物。在室温下孵育两小时后，用TBST洗涤板。将初级检测抗体经磺基标记的山羊抗人类TREM2(R&D Systems)以3％BSA/TBST稀释，添加到板中，并在室温下孵育一小时。在用TBST洗涤后，使用2x MSD读取缓冲液T使MSD板显影，接着使用MSD Sector板读取器进行检测。通过使用Prism 7.0软件(Graphpad)拟合标准曲线来将MSD值转换为sTREM2的绝对量。TREM2脱落的调节表示为来自与测试抗TREM2抗体一起孵育的细胞的可溶性TREM2归一化至来自未与特异性抗TREM2抗体一起在培养基中培养的细胞的可溶性TREM2的比率。

图6示出随着抗TREM2抗体浓度变化的代表性可溶性TREM2水平(sTREM2)。结果指示抗TREM2抗体能够在处理过夜后以剂量依赖性方式降低人类巨噬细胞中的sTREM2水平。

人类巨噬细胞中的吞噬作用测定

如上文所述生成人类巨噬细胞。在测定前两天，将人类巨噬细胞以80,000个细胞/孔接种在包被聚D-赖氨酸的96孔板上。将抗体以100nM稀释到含有RPMI、10％Hyclone FBS、1％丙酮酸钠、1％Glutamax、1％非必需氨基酸和1％青霉素-链霉素的培养基中。然后在37℃下向细胞给予抗体溶液持续24小时。然后将细胞核和细胞膜染色10分钟，此后添加5μg/mL的pHrodo-髓磷脂。然后将细胞在37℃下孵育4小时。在高容量共焦显微镜(OperaPhoenix)上测量每个细胞的pHrodo荧光，并且在仪器软件上量化荧光强度。

通过使用Safaiyan等人(2016,Nature Neuroscience 19(8):995-998)所述的方法从野生型C57Bl/6小鼠大脑(Jackson Laboratories)中纯化髓磷脂来制备pHrodo-髓磷脂。在纯化后，将髓磷脂重悬于PBS中并且使用DC Protein Assay试剂盒2(BioRad，目录号5000112)调节至1mg/mL蛋白质浓度。使用微量标记试剂盒(ThermoFisher，目录号P35363)根据制造商说明书用pHrodo-红标记髓磷脂。通过将髓磷脂以10,000g沉淀5分钟，去除上清液，并重复这些步骤3-5次来去除过量标记。

图7示出人类巨噬细胞中的吞噬作用测定的代表性结果。通过在经TREM2处理巨噬细胞的显微镜图像中检测并量化pHrodo荧光并且将所述测量值与同型对照的测量值相比较来测量髓磷脂吞噬作用。结果显示用示例性TREM2激动剂抗体处理的人类巨噬细胞相对于同型对照增加了pHrodo-髓磷脂吞噬作用，这表明抗TREM2抗体能够有益地清除细胞中的髓磷脂碎片。

实施例3.iPSC小神经胶质细胞中脂质积聚的调节

脂质储存测定

在测定之前，首先使用可商购获得的试剂盒(来自StemCell Technologies的STEMdiff Hematopoietic试剂盒)使iPSC分化成造血祖细胞(HPC)。将HPC转移至含有原代人类星形细胞的板中并且共培养14-21天。一旦共培养中的浮动细胞主要鉴定为成熟小神经胶质细胞(>80％)，则将所述小神经胶质细胞用于测定。

将细胞(iPSC小神经胶质细胞，30,000个细胞/孔)接种到PDL包被的96孔板的完全血清培养基中。在37℃下24小时后，经纯化未标记髓磷脂(50μg/mL最终浓度，使用Safaiyan等人(2016,Nature Neuroscience 19(8):995-998)中所述的方法从野生型C57Bl/6小鼠大脑(Jackson Laboratories)纯化)掺入到所述孔中。在37℃下脂质处理24小时后，将抗TREM2抗体或RSV对照掺入到孔中直至最终浓度为100nM。将细胞在37℃下再孵育48-72小时，然后收集细胞或对细胞成像。对于髓磷脂洗脱实验，在24小时孵育期之后去除髓磷脂，并且以含抗体培养基置换以用于后续24-48小时孵育。

对于尼罗红成像，去除上清液，并且在含有1μM尼罗红(ThermoFisher，目录号N1142)和1滴/mL Nucblue(ThermoFisher，目录号R37605)的活细胞成像缓冲液(LifeTechnologies，目录号A14291DJ)中将细胞在37℃下孵育30分钟。在孵育期后，去除染色溶液，并且将细胞固定在4％多聚甲醛中。然后在Opera Phoenix高容量共焦成像仪上使用Alexa 568和DAPI照射设置来对细胞成像。利用提供仪器的Harmony软件使用斑点发现算法分析液体斑点。图8A包括以媒介物或髓磷脂(50μg/mL最终浓度)处理24小时、接着与同型对照或示例性抗TREM2抗体(CL0020123)一起孵育72小时的iPSC小神经胶质细胞的代表性显微镜图像。图8B是用于图8A的显微镜图像中的相同抗TREM2抗体的代表性条形图。通过每个细胞的总斑点强度来对尼罗红染色进行量化，并且数据显示为相同显微术样品的不同领域内的三个技术性重复物的平均值和标准偏差。

对于脂质组学分析，在保持于冰上时将细胞用PBS洗涤一次。将含有1:100内部标准物的70μL体积的9:1甲醇:水溶液添加到96孔板的细胞中。在振荡器上在4℃和1200rpm下将板搅拌20分钟并且然后在300x g下离心5分钟。将50μL上清液样品转移至LCMS小瓶并保持在-80℃下，直至在仪器上分析。

通过与电喷雾质谱仪(QTRAP 6500+,Sciex,Framingham,MA,USA)耦合的液相色谱法(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)来分析液体水平。对于每项分析，在55℃下使用0.25mL/min流速将5μL样品注入BEH C18 1.7μm,2.1×100mm柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)。对于正电离模式，流动相A由60:40乙腈/水(v/v)和10mM甲酸铵+0.1％甲酸组成；流动相B由90:10异丙醇/乙腈(v/v)和10mM甲酸铵+0.1％甲酸组成。对于负电离模式，流动相A由60:40乙腈/水(v/v)和10mM乙酸铵组成；流动相B由90:10异丙醇/乙腈(v/v)和10mM乙酸铵组成。梯度如下程序化：0.0–8.0min从45％B至99％B，在99％B下8.0–9.0min，9.0–9.1min内至45％B，以及在45％B下9.1–10.0min。应用以下设置以正或负离子模式进行电喷雾电离：在30下的帘气；以中值设置的碰撞气体；在5500(正模式)或4500(负模式)下的离子喷雾电压；在250℃(正模式)或600℃(负模式)下的温度；在50下的离子源气体1；在60下的离子源气体2。使用Analyst1.6.3(Sciex)以多重反应监测模式(MRM)进行数据采集，其采用以下参数：停留时间(msec)和碰撞能量(CE)；在80下的去丛集电位(DP)；在10(正模式)或-10(负模式)下的入口电位(EP)；和在12.5(正模式)或-12.5(负模式)的碰撞室出口电位(CXP)。使用非内源性内部标准物的混合物量化液体。基于其保留时间和可商购获得的参考标准物(AvantiPolar Lipids,Birmingham,AL,USA)的MRM特性鉴定液体。

图8C和图8D示出在24小时髓磷脂处理后以示例性抗TREM2抗体处理72小时的iPSC小神经胶质细胞的细胞裂解物中如通过质谱法检测的胆固醇酯(CE)(图8C)和三酰甘油酯(TAG)脂质种类(图8D)的水平。图8E和图8F示出经历使用示例性抗TREM2抗体的髓磷脂洗脱实验的iPSC小神经胶质细胞的细胞裂解物中如通过质谱法检测的胆固醇酯(CE)(图8E)和三酰甘油酯(TAG)脂质种类(图8F)的水平。将图8C-8F中生成的LC/MS数据相对于CE数据的内部标准物归一化并且相对于TAG数据的每个个别脂质种类的髓磷脂+同型对照归一化。

iPSC小神经胶质细胞中的脂质积聚通过髓磷脂处理诱导，这由中性脂质染色(尼罗红)增加所反映并通过用于检测细胞裂解物中的特定脂质种类的LC/MS反映。图8A-8F中示出的数据总体指示在髓磷脂攻击后用示例性抗TREM2抗体处理iPSC小神经胶质细胞减少了脂质种类的积聚，如由细胞中的中性脂质染色的减少所指示并且由通过LC/MS测量的CE和TAG脂质种类的减少所指示。在24小时至72小时范围的不同时间点观测到由抗体处理引起的脂质水平降低。为了消除通过阻断脂质摄取引起脂质水平降低的可能性，进行髓磷脂洗脱实验，其中髓磷脂在添加抗TREM2抗体前去除。图8F示出在抗体处理前具有髓磷脂洗脱的iPSC小神经胶质细胞中相对于同型对照，抗TREM2抗体也降低脂质水平。

实施例4.抗体的功能表位分区

通过在TREM2蛋白上的竞争性结合来确定TREM2抗体表位小区(bin)。在CarterraLSA仪器上在25℃下使用经典夹心表位分区配置方法进行表位分区实验。通过胺偶联将所有测试抗体固定到HC30M芯片上。然后对测试抗体进行多个循环的夹心竞争结合。每个循环由抗原(His标记TREM2ECD)注射到固定抗体、接着分析物抗体注射到固定抗体组成。在每个循环结束时，通过注射含有1.25M NaCl的低pH缓冲液(pH＝3)再生固定抗体的表面。通过Carterra软件评估表位结合数据以创建竞争矩阵和表位分区。结果提供于表2中。

通过对抗TREM2抗体进行表位分区来鉴定两个激动剂小区：(1)柄结合激动剂和(2)IgV结构域结合激动剂。具有相同小区的抗体证实相同功能，例如通过脂质配体(拮抗剂抗体)抑制TREM2-DAP12pSyk活化、利用单独抗体(柄结合激动剂、IgV结构域结合激动剂)的pSyk活化。

表2.由功能类别标注的抗TREM2抗体小区

实施例5.抗体与TREM2柄肽的结合

评估TREM2抗体与人类和小鼠TREM2柄区肽的结合。测试肽包括：(1)全长柄区(人类TREM2的氨基酸129-172，UniProtKB Q9NZC2；小鼠TREM2的氨基酸131-169，UniProtKBQ99NH8)和(2)含有ADAM10/17裂解位点的截短柄肽(人类/小鼠TREM2的氨基酸149-163)。使用标准夹心ELISA检测抗体与TREM2柄肽的结合。简言之，在4℃下将96孔半区ELISA板用链霉素包被过夜。第二天，将以1％BSA/PBS稀释的生物素化TREM2柄肽添加到所述板中并孵育1小时。然后添加以1％BSA/PBS稀释的抗体并孵育1小时。使用以1％BSA/PBS稀释的抗人类κ-HRP二级抗体(Bethyl Laboratories,Inc.)检测与肽结合的抗体。通过与检测试剂(One-step TMB Ultra,Thermo)反应并且通过标准分光光度法仪器测量在450nm下的吸光度(A450)来测定板。结果提供于下表3中。数据展示为归一化值(相对于背景的倍数，其中背景＝同型对照)。

表3.抗TREM2抗体与TREM2柄肽的结合

表3描绘支持表2中的表位分区数据的人类和小鼠柄区肽-抗体结合相互作用。基于表3中的数据，某些抗TREM2抗体似乎结合的位点对应于TREM2细胞外柄区的氨基酸129-148。

还使用荧光极化测定分析抗TREM2抗体抑制ADAM17对TREM2柄肽切割的能力。首先以具有链霉素的测定缓冲液(25mM Tris pH 7.5、2.5μM ZnCl₂、0.005％Brij-35)制备TREM2柄肽。然后在室温下将抗TREM2抗体与TREM2柄肽预孵育30分钟。在预孵育期后，添加ADAM17(R&D systems，目录号930-ADB)并在37℃下与肽一起孵育20小时。第二天，以测定缓冲液进一步稀释样品并且将其转移至黑色不透光384孔板。随后在Perkin Elmer EnVision板读取器上测量荧光极化。将与抗TREM2抗体预孵育的TREM2柄肽的荧光极化与全长TREM2柄肽和酶对照(具有ADAM17的全长TREM2柄肽)的荧光极化相比较。

TREM2柄结合抗体显著增强荧光极化，这表明由ADAM17(克隆CL0020141、CL0020188、CL0020313、CL0020308)进行的柄肽切割的部分抑制。IgV结合抗体CL0020107并未结合TREM2柄区肽并且因此在荧光极化测定中未显示对肽切割的作用。

实施例6.抗TREM2抗体的药物动力学分析

在小鼠中评估抗TREM2抗体的药物动力学概况。C57BL/6J小鼠购自JacksonLaboratory(储备号000664)，2月龄，用于7天药物动力学(PK)研究和靶接合研究。使用3月龄的人类Trem2cDNA KI纯合小鼠(huTrem2^KI/KI)进行24小时靶接合研究。下文描述了人类Trem2cDNA KI小鼠的产生和繁殖。

人类Trem2cDNA KI小鼠模型的生成

如下生成人类TREM2cDNA KI小鼠(huTrem2^KI/KI)。将人类Trem2cDNA-pA序列插入在小鼠Trem2内源性ATG起始位点。插入人类Trem2cDNA-pA导致小鼠Trem2的外显子1序列的置换，这允许由内源性小鼠启动子驱动的人类Trem2cDNA的表达并且破坏内源性小鼠Trem2的表达。在C57BL/6遗传背景下使用同源重组生成huTrem2^KI/KI小鼠。

对于huTrem2^KI/KI靶向载体，长同源臂(LA)在人类Trem2cDNA-pA序列的5'端上游延长约3.6kb，并且短同源臂(SA)在FRT侧接Neo盒的3'下游延长约2.3kb。长同源臂和短同源臂都从C57BL/6BAC克隆(RP23:358G22)扩增并且然后亚克隆到含有氨苄青霉素选择盒的约2.4kb pSP72(Promega)骨架载体中。将hUBS-gb2FRT侧接的新霉素盒恰好插入在hTrem2-pA盒下游，从而产生大小约13.6kb的靶向载体。将10μg靶向载体用限制性酶Not I(NewEngland Biolabs)线性化并且随后通过电穿孔转染到FLP C57Bl/6(B6)胚胎干细胞(ES)。在以G418抗生素进行选择后，扩增存活克隆以用于PCR分析以鉴定阳性重组ES克隆。用于PCR筛选的引物序列(SEQ ID NO:53＝5'-AGG AAT GTG GGG AGC ACG GAG–3'并且SEQ IDNO:54＝5'-TGC ATC GCA TTG TCT GAG TAG GTG-3')扩增在3'区外部短同源臂(SA)下游含有来自bghpA元件的区域的2.81-kb片段。五个克隆被鉴定为阳性并选择用于进一步扩增。在ES克隆扩增期间通过Flp转基因去除Neo盒。

首先通过测序分析表征从五个阳性克隆提取的基因组DNA。扩增1.19-kb产物并通过引物(SEQ ID NO:55＝5'-ACC CTA GTC CTG ACT GTT GCT C-3'；SEQ ID NO:56＝5'-TATAGG AAC TTC GCGACA CGG ACA C-3')进行测序以证实5'基因组/neo盒接头区和3'KI盒接头区。测序结果证实将人类Trem2cDNA-pA序列引入所有五个克隆中。

通过南方印迹(Southern Blotting)分析使用靶向短臂和长臂的探针来进一步表征五个阳性克隆。将用Ssp I和Bam HI消化的ES细胞基因组DNA分别与短臂和长臂探针杂交。证实所有五个ES克隆在长臂和短臂二者中携带校正的同源重组事件。用于扩增短臂探针(658bp)的引物序列是(SEQ ID NO:57＝5'-ACA GGA GGG ACC TAC CTT CAG 3'；SEQ IDNO:58＝5'-GCC TGC CTT TCA GAG ACC TCA GTC-3)。用于扩增长臂探针(681bp)的引物序列是(SEQ ID NO:59＝5'-CCT CTC CGG CTG CTC ATC TTA CTC-3'；SEQ ID NO:60＝5'-GTCTCT CAG CCC TGG CAG AGT TTG-3')。

然后将所有五个ES细胞克隆注入C57BL/6胚泡中。来自一个克隆的幼崽通过PCR基因分型证实了种系传递。用于基因分型的引物是(SEQ ID NO:61＝pr1:5'-CGC CTA CCCTAG TCC TGA CTG TTG-3'、SEQ ID NO:62＝pr2:5'-AAA GCC TAC AGC ATC CTC ACC TC-3'；和SEQ ID NO:63＝pr3:5'-GCA TCA TGG GGT TGT AGA TTC CG-3')。野生型上pr1/pr2的PCR产物为658bp。KI等位基因上pr1/pr3的PCR产物为469bp。

抗体给药和血浆/CSF收集

对于PK分析，通过静脉内(IV)尾静脉注射向C57BL/6J小鼠给予10mg/kg抗TREM2抗体或对照IgG(给药体积为约200μL/小鼠，每个组n＝3)。在给药后1小时、24小时、4天和7天收集血液样品。通过使用3-mm刺血针(GoldenRod动物刺血针)经由颌下出血收集前三个时间点的血液样品。在第7天通过心脏穿刺收集最后和最终血液样品。将血液收集在EDTA管(Sarstedt Microvette 500K3E，目录号201341102)中，将其缓慢倒置以混合，并且在4℃下离心。将血浆(顶部)层转移至1.5-mL Eppendorf管并储存在-80℃，直至分析。

对于24小时靶接合研究，使用C57BL/6J小鼠测试小鼠替代品抗TREM2抗体，并使用huTrem2^KI/KI小鼠测试人类抗TREM2抗体。通过静脉内(IV)尾静脉注射向小鼠给予100mg/kg抗TREM2抗体或对照IgG(给药体积为约200μL/小鼠，每个组n＝5)。给药前24小时收集血液样品以确定TREM2基线水平。给药后24小时收集最终血液和CSF样品。如上文所述制备血浆制剂。为了收集CSF样品，在颅骨背面作矢状切口，并且分离皮下组织和肌肉以暴露出大池。使用预拉伸玻璃毛细管来穿刺大池并收集CSF样品。然后在4℃下离心CSF以去除血液残余物，并且将CSF上清液转移至0.5-mL Low Protein LoBind Eppendorf管(Eppendorf，目录号022431064)，以用于储存在-80℃，直至分析。

体内抗TREM2抗体血浆水平的分析

对于抗TREM2抗体PK分析，使用一般人类抗Fc夹心ELISA量化小鼠血浆中的总抗体浓度。将384孔MaxiSorp板用1μg/mL抗huFc驴多克隆抗体(Jackson Immunoresearch)包被过夜。在与测定缓冲液(PBST、1％BSA)中1:2,000或1:20,000稀释的血浆一起孵育后，添加结合到HRP的抗huFc驴抗体(Jackson Immunoresearch)作为检测试剂。使用3倍稀释使用五参数逻辑回归生成2nM至2.7pM的每个个别抗体的标准曲线。

图9示出某些抗TREM2抗体的代表性小鼠PK特征。提供在7天时段内每个代表抗体的抗体清除率(CL[mL/day/kg])并且将其与正常无效应子同型对照相比较。图9中示出的每个抗体表现出相对于同型对照相当的清除率。

体内靶接合：sTREM2血浆水平

为了测量可溶性TREM2(sTREM2)血浆水平，使人类TREM2cDNA KI小鼠(huTrem2^{KI /KI})出血并且然后用100mg/kg测试抗TREM2抗体或同型对照静脉内处理。给药后24小时使小鼠出血。从血液样品获得血浆并在如下进行的MSD测定中评估。将MSD SECTOR板用以PBS稀释的1μg/mL捕获抗体(R+D抗TREM2抗体，目录号MAB17291-100)包被并在4℃下孵育过夜。将样品孔用未经稀释MSD封闭剂A封闭1小时。将血浆样品以含有0.05％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBST)中的25％MSD封闭剂A 1:20稀释并且将其添加到所述板上的每个样品孔中，然后将其在室温下孵育2小时。随后将检测抗体(MSD磺基标记的山羊抗人类抗体，目录号R32AJ-1，1:1000)添加到每个样品孔，并且将板在室温下孵育1小时。使用Biotek板洗涤器对每个样品孔进行TBST洗涤。添加检测试剂(MSD读取缓冲液)并使用MSD Meso SectorS600读取器测量以获得sTREM2与抗体结合的结果。

图10A和图10B示出在huTrem2^KI/KI血浆中示例性抗TREM2抗体的总sTREM2水平(图10A)和抗体结合sTREM2水平(图10B)。对于总sTREM2和结合sTREM2测定，将数据相对于给药前sTREM2基线水平归一化。结果指示总循环sTREM2水平不会显著影响用抗TREM2抗体处理的小鼠与用所述抗体处理24小时后的同型对照相比的变化，这表明总循环sTREM2水平在抗体给药后的早期时间点未受影响。相比之下，抗体结合sTREM2水平在用抗TREM2抗体注射的小鼠中相对于同型对照更高。

实施例7.抗TREM2抗体的序列优化和人源化

对示例性抗TREM2抗体进行序列优化和人源化，接着对结合动力学和结合特异性进行表征。

通过在CDR序列内搜索易于化学修饰的残基(例如，天冬酰胺脱酰胺化基序(NG)、天冬氨酸异构化基序(DS)和潜在氧化残基(色氨酸(W)和甲硫氨酸(M))并且以保守性且种系残基进行氨基酸取代以去除此类序列文库来进行序列优化。然后使用Biacore和与HEK293-H6细胞的剂量滴定细胞结合分析抗TREM2抗体的人源化且序列优化的变体的结合动力学(关于代表性方案，参见实施例1)。

分析抗体CL0020188的人源化且序列优化的变体的结合特征的结果提供于表4中。修饰CL0020188CDR-H2序列(SEQ ID NO:5)和CDR-L1序列(SEQ ID NO:7)中的NG基序，将其移植到人类框架区，并分析。表4提供HEK293-H6细胞中的如通过Biacore测量的K_D值和如通过剂量滴定结合测定所测量的EC₅₀值。

表4.CL0020188的序列优化且人源化的变体的结合特征

3m＝V_H中的A24G/L45P/V48L

如表4所示，CL00201088的人源化且序列优化的克隆对hTREM2表现出的亲和力值类似于亲本抗体(K_D＝9.5nM)，如通过Biacore所测量。这与表4中所示的HEK293-H6细胞中的细胞结合结果一致。与亲本抗体(EC₅₀＝0.44nM)相比，人源化且序列优化的克隆对HEK293-H6细胞中所表达的TREM2表现出相当且亚纳摩尔的亲和力。总之，结果指示亲本抗体与人源化且序列优化的变体之间的相当结合动力学。

分析抗体CL0020123的人源化且序列优化的变体的结合特征的结果提供于表5中。修饰CL0020123CDR-H2序列(SEQ ID NO:30)中的NG和DS基序，将其移植到人类框架区，并分析。表5提供HEK293-H6细胞中的如通过Biacore测量的K_D值和如通过剂量滴定结合测定所测量的EC₅₀值。

表5.CL0020123的序列优化且人源化的变体的结合特征

1m＝V_H中的R71A

2m＝V_H中的V67A/R71A

与亲本抗体(K_D＝0.10nM)相比，人源化且序列优化的克隆表现出高约4倍的与hTREM2结合的K_D值，如通过Biacore所测量。另一方面，在HEK293-H6细胞的剂量滴定细胞结合测定中，人源化且序列优化的克隆对TREM2表现出相当且亚纳摩尔亲和力。

实施例8.序列优化、人源化抗TREM2抗体的体外表征

通过如实施例1和3中所述的体外方法评估示例性序列优化且人源化的抗TREM2抗体(实施例7)。评定抗体在表达TREM2的HEK细胞中的TREM2结合、HEK-H6细胞中的TREM2依赖性pSyk信号传导、促进人类巨噬细胞存活的能力和调节iPSC小神经胶质细胞中的脂质积聚的能力。图11至14示出代表性抗TREM2抗体的结果。抗TREM2抗体在使用表达TREM2的HEK293-H6细胞的测定中表现出良好细胞结合(EC50值为0.34nM(图11A)和0.08nM(图11B)。抗TREM2抗体也激活表达TREM2的HEK293-H6细胞中的pSyk磷酸化(图12A和图12B)。另外，抗TREM2抗体诱导巨噬细胞存活，其中对于CL0020188变体抗体观测到更好的存活活性(图13)。最后，抗TREM2抗体证实了减少经髓磷脂处理的iPSC小神经胶质细胞中的脂质积聚的能力(图14A和图14B)。

实施例9.序列优化、人源化抗TREM2抗体的小鼠PK

在类似于实施例6中所述的7天药物动力学(PK)研究的野生型小鼠中评估某些序列优化、人源化抗TREM2抗体(实施例7)的药物动力学特征。每个剂量组含有n＝3只小鼠。表6提供示例性序列优化且人源化抗TREM2抗体的PK特性(实施例7)。

表6.抗TREM2抗体的小鼠PK特性

实施例10.序列优化、人源化抗TREM2抗体的食蟹猴PK

在天然食蟹猴中评估抗TREM2抗体的药物动力学特征。经由静脉内推注向2-4岁(体重约2-3kg)的天然食蟹猴注射抗TREM2抗体。施用剂量包括3mg/kg和25mg/kg，其中每个剂量组n＝3只猴。在给药前和在给药后10分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时和24小时、以及3天、7天、10天、14天、17天、21天、24天和28天收集血液样品(约1mL)。将样品冷冻在约5℃，然后离心以获得血浆，并且将所获得血浆保持在干冰上，然后储存在-70℃，直至分析。如下分析血浆样品的抗TREM2抗体水平。

对于抗TREM2抗体PK分析，使用一般抗人类_IgG夹心电化学发光免疫测定(ECLIA)在Meso Scale Discovery(MSD)平台上量化猴血浆中的总抗体浓度。简言之，将1％基于酪蛋白的PBS封闭缓冲液(Thermo Scientific,MA)添加到MSD GOLD 96孔小斑点链霉素包被微量滴定板(Meso Scale Discovery,MD)并孵育约1h。在板封闭和洗涤步骤后，将工作溶液中的0.5μg/mL的生物素化抗人类_IgG山羊抗体(SouthernBiotech,AL)添加到测定板中并使其孵育1-2h。在孵育和洗涤步骤后，将血浆测试样品(即，具有抗TREM2人源化抗体的样品)添加到测定板中并孵育1-2h。注意测试样品必须以测定最小需要稀释(MRD)1:100、以0.5％基于酪蛋白的PBS测定缓冲液(Thermo Scientific,MA)稀释，从而得到最终1％血浆基质，然后添加到测定板中。在捕获抗TREM2抗体分析物和洗涤步骤之后，将工作溶液中的0.4μg/mL的二级钌化(SULFO-TAG)抗人类IgG山羊抗体(Meso Scale Discovery,MD)添加到测定板中并孵育约1h。最后，在孵育和洗涤步骤后，将测定读取缓冲液(1X MSD ReadBuffer T)添加到测定板中以生成测定样品信号。来自MSD板读取器的样品信号读数呈电化学发光(ECL)信号形式并且以ECL单位(ECLU)表示。先前所述的所有测定反应步骤均在周围温度下并且在板振荡器上振荡的情况下(在适当时)进行。所述测定具有19.5–2500ng/mL(或在1:100后MRD下为0.195–25ng/mL)的动态校准标准范围，其8个标准点以1:2连续稀释，再加上空白血浆样品。根据使用加权四参数非线性逻辑回归拟合的测定校准标准曲线反向计算血浆样品浓度。表7提供示例性序列优化且人源化抗TREM2抗体的药物动力学(PK)特性(实施例7)。

表7.抗TREM2抗体的食蟹猴PK特性

CL0020188表现出在不同剂量水平之间的类似低清除率水平和食蟹猴的线性药物动力学概况。另外，不存在与在食蟹猴中施用变体相关的临床病理学发现(数据未示出)。

实施例11.抗TREM2抗体的比较

通过Biacore(实施例1中所述)测量抗TREM2抗体对人类TREM2和食蟹猴TREM2的亲和力。通过MSD测定测量抗TREM2抗体在健康人类志愿者CSF样品(Innovative Research)和健康食蟹猴CSF样品(Worldwide Primates)中的效能。通过其EC50确定每个抗体的效能。简言之，在室温下将以捕获抗体(生物素化山羊抗人类TREM2，R&D Systems，目录号BAF1828)包被的MSD GOLD 96孔小斑点链霉素板(MSD，目录号L45SA)与以测定缓冲液(25％(v/v)MSD封闭剂A(MSD，目录号R93BA-A)、75％(v/v)TBST)1:3稀释的生物流体样品一起孵育一小时。在以TBST冲洗所述孔后，将经磺基标记的抗TREM2抗体以连续稀释液(在11个点间4x稀释)添加到所述板的孔中并在室温下孵育一小时。将所述孔用TBST稀释，并且将MSD读取缓冲液(MSD，目录号R92TC-3)添加到孔中。使用MSD Meso Sector S600装置测量来自样品的信号。通过四参数可变斜率非线性回归确定每个抗体的EC50值。参考抗体#1和#2对应于WO2018/195506中所述的4C5和6E7。参考抗体#3对应于WO2019/028292中所述的AL2p-58。参考抗体#1的可变区由SEQ ID NO:73和74表示。参考抗体#2的可变区由SEQ ID NO:75和76表示。参考抗体#3的可变区由SEQ ID NO:77和78表示。结果提供于表8中。

如表8所示，如本文所公开的CL0020188和CL0020123变体相对于参考抗体对人类TREM2具有更强亲和力并且更有效地结合从健康人类志愿者受试者分离的CSF样品中的sTREM2。另外，CL0020188变体相对于参考抗体对食蟹猴TREM2具有更强亲和力并且更有效地结合从健康食蟹猴受试者分离的CSF样品中的sTREM2。这通过达到在相同条件下结合给定量的sTREM2的半最大有效浓度(EC50)所需的抗体的相对量来证明。如表8所示，与CL0020188和CL0020123抗体相比，参考抗体#1、#2和#3达到EC50需要更高相对量。

表8.抗TREM2抗体的特性的比较

实施例12.抗TREM2抗体的表位定位

为了鉴定肽水平下的抗TREM2抗体的表位，使用氢氘交换(HDX)质谱法。在20℃下将单独或与抗TREM2抗体混合的重组人类TREM2与氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸钠、100mM氯化钠，pH 7.0)一起孵育0、60、600和3600秒。通过添加等体积4M盐酸胍、0.85M TCEP缓冲液(最终pH 2.5)来淬灭氢/氘交换。然后使淬灭样品进行胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化和LC-MS分析。简言之，将淬灭样品注入到保持在20℃的包装胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱(2.1x 30mm)，并且使用包含与Q Exactive^TM HF-Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher)耦合的Waters Acquity UPLC(Waters Corporation)的UPLC-MS系统分析所得肽。所述肽在保持于-6℃的50mm x 1mm C8柱上使用16.5分钟从2％至31％溶剂B的梯度(溶剂B：乙腈中的0.2％甲酸；溶剂A：水中的0.2％甲酸)分离。仅在MS模式下记录质谱。使用HDX Workbench(Pascal等人2012.Journal of The American Society for Mass Spectrometry 23:1512-1521)处理原始MS数据。使用氘化肽与其天然形式之间在t0时的平均质量差异计算氘水平。经由使用Mascot软件(Matrix Science)对人类TREM2序列搜索MS/MS数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为10ppm和0.02Da。

基于HDX质谱法结果，CL0020188和CL0020188的变体结合到人类TREM2(SEQ IDNO:1)的氨基酸残基143-149(FPGESES(SEQ ID NO:69))，而CL0020123和CL0020123的变体结合到人类TREM2的(i)氨基酸残基55-63(GEKGPCQRV(SEQ ID NO:70))、(ii)氨基酸96-107(TLRNLQPHDAGL(SEQ ID NO:71))和(iii)氨基酸残基126-129(VEVL(SEQ ID NO:72))。

IX.非正式序列表

序列表

<110> 戴纳立制药公司(DENALI THERAPEUTICS INC.)

<120> 抗TREM2抗体及其使用方法

<130> 102342-003310PC-1173316

<140>

<141>

<150> 62/808,141

<151> 2019-02-20

<160> 83

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 230

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 2

Glu Val Lys Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

85 90 95

Leu Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 5

Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 6

Ala Arg Leu Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 7

Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

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<211> 7

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 8

Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 9

Gln Gln Phe Leu Glu Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 10

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

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Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Ala Pro Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Arg Asn Arg Pro Asn Gly Tyr Thr Thr Asp Tyr Asn Pro

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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Ile

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100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Val Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

85 90 95

Leu Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 13

Val Ile Arg Asn Arg Pro Asn Gly Tyr Thr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 14

Thr Arg Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 15

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 15

Glu Val Lys Leu Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

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Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu

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Gly Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Ile

65 70 75 80

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Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Leu Pro Asn Pro Val Pro Ser Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Thr Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser

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65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 17

Ala Arg Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 18

Gln Gln Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 19

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

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<210> 21

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

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Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

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<211> 16

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 23

Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<211> 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 25

Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu

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Ser Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 27

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

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65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 28

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln His Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asp His Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Arg

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 29

Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe Tyr Ile His

1 5 10

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 30

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 31

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 32

His Ala Ser Gln His Ile Asn Val Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 33

Lys Ala Ser Asn Leu His Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 34

Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 35

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

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Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln His Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Arg

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 39

Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 40

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 41

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 42

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 43

Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 46

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Gln Gly Glu Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

His Ala Asp His Gly Asn Tyr Gly Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Gln"

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /替代="Glu"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(17)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 47

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Asn"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(10)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 48

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 49

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(5)

<223> /替代="Arg"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Pro"

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /替代="Ala"

<220>

<221> VARIANT

<222> (11)..(11)

<223> /替代="Thr"

<220>

<221> VARIANT

<222> (12)..(12)

<223> /替代="Asp"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(19)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 49

Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> /替代="Thr"

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /替代="Ser"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(9)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 50

Ala Arg Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 51

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)..(10)

<223> /替代="Thr"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(16)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 51

Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Phe"

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(9)

<223> /注释="序列中给出的变异残基相对于变异位置

注解中的残基没有偏好"

<400> 52

Gln Gln Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 53

aggaatgtgg ggagcacgga g 21

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 54

tgcatcgcat tgtctgagta ggtg 24

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 55

accctagtcc tgactgttgc tc 22

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 56

tataggaact tcgcgacacg gacac 25

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 57

acaggaggga cctaccttca g 21

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 58

gcctgccttt cagagacctc agtc 24

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 59

cctctccggc tgctcatctt actc 24

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 60

gtctctcagc cctggcagag tttg 24

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 61

cgcctaccct agtcctgact gttg 24

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 62

aaagcctaca gcatcctcac ctc 23

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成引物"

<400> 63

gcatcatggg gttgtagatt ccg 23

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 64

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成6xHis标签"

<400> 65

His His His His His His

1 5

<210> 66

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 66

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ser Asp Pro Thr Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Thr Ser Gly Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr

130 135 140

<210> 67

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 67

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe

130 135 140

<210> 68

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 68

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe

85 90 95

Leu Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 69

Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 70

Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val

1 5

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 71

Thr Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu

1 5 10

<210> 72

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 72

Val Glu Val Leu

1

<210> 73

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Val Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Arg

85 90 95

Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 74

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly His Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 75

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 76

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Arg Thr Phe Tyr Tyr Asp Ser Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 77

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 77

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Arg Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 78

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Gln

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gly Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Val Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Ala Gly Tyr Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 80

Asn Gly Asp Ser

1

<210> 81

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 81

Gln Gly Asp Ser

1

<210> 82

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 82

Asn Gly Glu Ser

1

<210> 83

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"

<400> 83

Gln Gly Glu Ser

1