一种环肽的合成方法
阅读说明：本技术 一种环肽的合成方法 (Synthetic method of cyclic peptide ) 是由 宓鹏程 王亮 潘俊锋 于 2021-07-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种环肽的合成方法,属于多肽药物生物化学技术领域,以解决传统线形肽偶联过程中出现的Asp形成酰亚胺的杂峰的问题。方法包括选择氨基树脂,制备Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂、按照Fmoc固相合成策略,依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OAll)-OH；一次性脱除Lys和Asp上的Alloc和OAll基团；固相环化；脱除Asp的N端的Fmoc基团,继续偶联Fmoc-Nle-OH,然后乙酰化,完成偶联；将多肽从树脂上切除下来,得到MT-II粗肽；纯化。(The invention discloses a synthetic method of cyclic peptide, belongs to the technical field of polypeptide drug biochemistry, and aims to solve the problem that hetero-peaks of imide are formed by Asp in the conventional linear peptide coupling process. The method comprises selecting amino resin, preparing Fmoc-Lys (alloc) -amino resin, coupling Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH, Fmoc-D-Phe-OH and Fmoc-His (Trt) -OH in sequence according to Fmoc solid phase synthesis strategy; Fmoc-Asp (OAll) -OH; removing Alloc and OAll groups on Lys and Asp in one time; solid phase cyclization; removing the Fmoc group at the N end of Asp, continuing coupling Fmoc-Nle-OH, and then performing acetylation to complete coupling; cutting off the polypeptide from the resin to obtain MT-II crude peptide; and (5) purifying.)
技术领域
本发明属于多肽药物生物化学技术领域，具体涉及一种环肽的合成方法。
背景技术
在Fmoc固相合成中，影响Asp的最常见的副反应就是天冬酰亚胺的形成，每个循环过程选用强碱如哌啶和DBU作为Fmoc的有效脱除试剂，Asp的α-酰胺键上的N与侧链β-羰基形成一个环，同时失去侧链脂类保护基。天冬酰亚胺很容易受碱催化影响产生立体异构和容易发生开环反应，导致形成各种形式的副产物。
形成天冬酰亚胺的多少主要由接触碱的时间和碱的强度决定，使用DBU比哌啶更容易导致形成天冬酰亚胺。克服这个副反应有部分方法，如在Asp前一个氨基酸引入用Hmb保护，但是Hmb保护的氨基酸偶联后一个氨基酸进行的酰化反应较为困难，且相关原料价格昂贵，不利于规模化生产。
MT-II在合成过程中也会出现这种情况。MT-II(MelanotanII，中文名：美拉诺坦II)肽序为：Ac-Nle-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-NH2，分子量1024.2，需要形成侧链酰胺环化的结构，其结构图见附图1。
MT-II的常规合成方法是首先合成Ac-Nle-Asp(OAll)-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)- Lys(Alloc)-RinkResin，然后同时脱除OAll和Alloc保护基，然后进行固相侧链环化。专利 CN101195654B《一种美拉诺坦-Ⅱ的固相合成方法》就是通过先合成线性肽，然后在树脂上进行环化得到MT-II的。
但线性肽合成过程中，当Asp脱Fmoc，偶联Nle后会出现一个明显的杂峰(13.533)，该峰是Asp形成酰亚胺的峰，如图2所示。
偶联完线性肽树脂后，采用四三苯基膦钯/苯硅烷脱除OAll和Alloc保护基，然后再加入偶联剂进行固相环化，最终粗肽中形成两个分子量为1024的峰，其中杂峰的含量约含 25％(RT13.318)，目的峰含量约38％(RT13.4.653)。证明在线形肽偶联过程中，由于Fmoc脱除过程中强碱的使用，使Asp出现了天冬酰亚胺现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环肽的合成方法，以解决传统线形肽偶联过程中出现的Asp 形成酰亚胺的杂峰，影响美拉诺坦Ⅱ品质的问题。
为了解决以上问题，本发明技术方案为：
一种环肽的合成方法，按以下步骤次和进行合成：
步骤A、选择氨基树脂，制备Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂；
步骤B、将步骤A中所得产物按照Fmoc固相合成策略，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OAll)-OH；
步骤C、将步骤B中所得产物采用四三苯基膦钯和苯硅烷一次性脱除Lys和Asp上的Alloc和OAll基团；
步骤D、将步骤C中所得产物在树脂上进行固相环化；
步骤E、将步骤D中所得产物脱除Asp的N端的Fmoc基团，继续偶联Fmoc-Nle- OH，然后乙酰化，完成偶联；
步骤F、将步骤E中所得产物采用裂解反应将多肽从树脂上切除下来，得到MT-II(MelanotanII，中文名：美拉诺坦II)粗肽；
步骤G、纯化步骤F中制备所得MT-II，得到MT-II精肽。
进一步的，步骤A中所述氨基树脂为RinkAmide Resin，RinkAmide-AM Resin，RinkAmide-MBHAResin；其氨基酸替代度为0.2-0.6mmol/g。
进一步的，氨基树脂为RinkAmide-AM Resin；氨基酸替代度为0.4mmol/g。
进一步的，步骤B中所述的依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D- Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OAll)-OH的过程中，通过茚三酮检测来确定是否偶联完全；需要保证在偶联完Fmoc-Asp(OAll)-OH后，其N端Fmoc基团不能脱除。
进一步的，步骤D中所述环化的条件为：偶联时，Lys和Asp的侧链偶联体系为HATU/HOAt/DIPEA。
进一步的，步骤F中裂解反应的裂解液为TFA，EDT和水的混和液，其体积比为：TFA：EDT：水＝90：8：2。
进一步的，步骤F中纯化采用反相高压液相色谱法，以反相十八烷基硅烷为固定相，以 0.1％醋酸水溶液和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干即得MT-II精肽。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明针对在合成MT-II过程中形成天冬酰亚胺的情况，通过改变合成策略有效避免天冬酰亚胺的形成。该策略打破常规的先进行线性全链合成，再进行环化的常规思路。在Asp合成以后就先进行环化然后再继续合成。具体是通过线性肽树脂偶联到Asp(OAll) 后，不脱Fmoc，加入四三苯基膦钯和苯硅烷脱除OAll和Alloc保护基，再加入偶联剂进行固相环化，然后脱除Asp主链上的Fmoc保护，继续偶联其他的氨基酸。这就从根源上有效的解决了天冬酰亚胺现象。进而解决了线形肽偶联过程中出现的Asp形成酰亚胺的杂峰，使得最终制得的产物--美拉诺坦Ⅱ纯度更高。
(2)本发明加工全程没有采用高价原料，而是巧妙的通过改变合成次序，减少了Asp 侧链在强碱环境的暴露次数与时间，降低了天冬酰亚胺形成的风险，可大大减少美拉诺坦Ⅱ的合成成本。
附图说明
图1为MT-II(MelanotanII，中文名：美拉诺坦II)的结构图；
图2为采用传统的先线性偶联的方式合成时，当Asp脱Fmoc，偶联Nle后产物的色谱图；其中明显的杂峰(RT 13.533min)是Asp形成酰亚胺的峰；
图3为采用线性偶联后环化的方式制备的粗肽的色谱图；其中杂峰的含量约含25％(RT 13.318min)，目的峰含量约38％(RT 13.4.653min)；
图4为实施例4中步骤E中制得的MT-II粗肽树脂的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
为证明本发明合成方法的可行性和效果，将各步骤分开实施。
实施例1
一种环肽的合成方法的步骤A：选择氨基树脂，制备Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂。
选择替代度为0.60mmolFmoc-Lys(Alloc)-RinkAmide Resin树脂的制备，具体过程如下：
称取替代度为1.0mmol/g的RinkAmide Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；
称取Fmoc-Lys(Alloc)-OH45.3克(100mmol)、HOBt16.2克(120mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mLDIC,活化5分钟，加入反应柱；
反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.58mmol/g。
实施例2
一种环肽的合成方法的步骤A：选择氨基树脂，制备Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂。
选择替代度为0.40mmolFmoc-Lys(Alloc)-RinkAmide-AM Resin树脂的制备，具体过程如下：
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；
称取Fmoc-Lys(Alloc)-OH31.7克(70mmol)、HOBt11.3克(84mmol)，用DMF溶解，0℃下加入14.2mLDIC,活化5分钟，加入反应柱；
反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.40mmol/g。
实施例3
一种环肽的合成方法的步骤A：选择氨基树脂，制备Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂。
选择代度为0.20mmolFmoc-Lys(Alloc)-RinkAmide-MBHA Resin树脂的制备具体过程如下：
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；
称取Fmoc-Lys(Alloc)-OH15.9克(35mmol)、HOBt5.7克(42mmol)，用DMF溶解， 0℃下加入7.1mLDIC,活化5分钟，加入反应柱；
反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.22mmol/g。
实施例1-实施3最终得到的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂的检测替代度结果与各树脂氨基酸替代度没有超差，证实了本发明选择的氨基树脂及其氨基酸替代度定在0.2-0.6mmol/g 之间是可行的。
由于3个实施例最终制备的Fmoc-Lys(Alloc)-氨基树脂性能还是相近，故在其后的实施例4中任意选择使用，最终选定实施例2中制备的Fmoc-Lys(Alloc)-RinkAmide-AMResin树脂参与后续合成。
实施例4
一种环肽的合成方法，步骤A之后的各个步骤如下：
步骤B、将步骤A中所得产物按照Fmoc固相合成策略，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OAll)-OH。
具体的：
称取实施例2制备的替代度为0.40mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Rink Amide-AMResin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用DBLK脱保护 6min+8min，DMF洗涤6次。
称取63.2g(120mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH和22.5g(144mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入25mL(144mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。
反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6 次，茚三酮检测树脂有颜色。
重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Asp(OAll)-OH。
步骤C、将步骤B中所得产物采用四三苯基膦钯和苯硅烷一次性脱除Lys和Asp上的Alloc和OAll基团。
具体的：
将步骤B中所得的肽树脂用DCM溶胀，加入98.5ml苯基硅烷(800mmol)，再加入5.6g四三苯基膦钯(8mmol)，室温反应60min，采用茚三酮检测显色证明Alloc和OAll已脱除。
步骤D、将步骤C中所得产物在树脂上进行固相环化。
具体的：
进行Fmoc-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-Rink Amide-AM Resin的制备：
称取15.2gHATU(40mmol)，6.5gHOAt(48mmol)，用200mLDMF溶解，冰水浴下加入13.9mLDIPEA(80mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。
用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-Rink Amide-AM Resin肽树脂。
步骤E、将步骤D中所得产物脱除Asp的N端的Fmoc基团，继续偶联Fmoc-Nle- OH，然后乙酰化，完成偶联。
具体的：
进行Ac-Nle-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-RinkAmide-AM Resin树脂的制备：
将步骤D中的Fmoc-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-Rink Amide-AM Resin用DBLK 处理6+8min，脱除Fmoc基团，DMF洗涤6次。
称取42.4g(120mmol)Fmoc-Nle-OH和22.5g(144mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入25mL(144mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。
量取76.1ml(800mmol)乙酸酐和66.1ml(800mmol)吡啶混合加入树脂中，反应2h，茚三酮检测树脂无色透明。DMF洗涤树脂6次，然后用甲醇收缩树脂，真空干燥，得MT-II 肽树脂182.4g。
偶联完Nle后裂解小样片段进行分析，其色谱图如图4所示，对比传统的线形肽偶联方法(如图3所示)，可见：
图3采用传统的线性偶联后环化的方式制得粗肽的色谱图，其中杂峰的含量约含25％(RT 13.318min)，目的峰含量约38％(RT 13.4.653min)；
图4为按照本实施例制备得到的粗肽色谱图，该片段的纯度约65％，比原方法提高了 27％。
可见本发明方法确实从根源上有效的解决了天冬酰亚胺现象。进而解决了线形肽偶联过程中出现的Asp形成酰亚胺的杂峰，使得最终制得的产物--美拉诺坦Ⅱ纯度更高。
步骤F、将步骤E中所得产物采用裂解反应将多肽从树脂上切除下来，得到MT-II(MelanotanII，中文名：美拉诺坦II)粗肽。
将步骤E得到的肽树脂182.4克加入到3L三口瓶中，加入预先配置好预冷至0摄氏度以下的TFA:EDT:H2O＝90：8：2(V:V)1.82L，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢加入18.4L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得粗肽39.7克，重量收率96.9％。
步骤G、纯化步骤F中制备所得MT-II，得到MT-II精肽。
将步骤F得到39.7g固体直接用高效液相纯化制备。
以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品18.8g，纯度大于99.0％，收率45.9％。