具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请实施例的富锌酵母多肽及其制备方法、应用进行具体说明。

本申请提供一种富锌酵母多肽的制备方法，主要包括酵母菌株的培养、酵母细胞的分离、酵母细胞破壁、酶解以及最终收集酶解产物。

具体地，先进行酵母菌株的培养，在本申请中，采用含有ZnSO₄的培养基培养酵母菌株ATCC204508。

经过发明人的多次实验后发现，采用含有ZnSO₄的培养基酵母菌株ATCC204508最终得到的富锌酵母多肽在抗氧化和酪氨酸酶抑制活性等方面有较佳的效果。其显然优于同条件培养酵母菌株ATCC9763、酵母菌株ATCC9080、酵母菌株ATCC9987、酵母菌株ATCC4021258、酵母菌株ATCC22023等等。

此外，培养基中ZnSO₄的加入显著增加了最终得到的多肽的抗氧化活性以及酪氨酸酶抑制活性。

作为示例性地，含有ZnSO₄的培养基包括ZnSO₄和YPD培养基。

YPD：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基。

作为示例性地，ZnSO₄的浓度为100～300mg/L，例如可以为100mg/L、120mg/L、130mg/L、150mg/L、160mg/L、190mg/L、200mg/L、210mg/L、240mg/L、250mg/L、280mg/L、290mg/L、300mg/L等等。

作为示例性地，酵母菌株ATCC204508的种子液与含有ZnSO₄的培养基的体积比为1：(50～200)；例如，两者的体积比可以为1：50、1：60、1：80、1：90、1：100、1：110、1：130、1：150、1：180、1：190、1：200等等。

作为示例性地，培养条件为：培养温度为27～30℃，培养时间为24～72h；例如，培养温度可以为27℃、28℃、29℃、30℃等等，培养时间可以为24h、28h、30h、32h、34h、40h、46h、50h、60h、70h、72h等等。

需要说明的是，在本申请的其他实施例中，含有ZnSO₄的培养基可以为其他组成，并不限于上述的ZnSO₄和YPD培养基，其可以根据酵母菌株的生长和代谢进行配置。相应地，在不考虑原料利用率以及产率等情况下，酵母菌株ATCC204508的接种量也可以为其他值，培养条件可以根据酵母菌株ATCC204508的生长习性做出适应性调整。

酵母菌株的培养完成后进行酵母细胞的分离，将酵母细胞和培养基、代谢产物分离获取酵母细胞。

作为示例性地，采用离心的方式分离，在8000r/min～12000r/min的条件下离心3-8min；转速可以为8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min等等。

需要说明的是，在其他实施例中，在不考虑分离效率和产率的基础上，可以采用过滤等方式分离。

分离得到酵母细胞之后，进行酵母细胞破壁以及酶解最终收集酶解产物。

作为示例性地，先干燥酵母细胞然后粉碎酵母细胞得到粉末，粉末与水超声破壁，粉末与水的比例为1：(10～100)；例如可以为1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100等等。

超声破壁在冰浴中进行，超声破壁的时间可以为40-80min，例如可以为60min、80min等等。

超声破壁结束后加入蛋白酶进行酶解。

作为示例性地，蛋白酶包括菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以及复合蛋白酶中的至少一种；

例如，蛋白酶为木瓜蛋白酶。

酶解的温度为50℃-70℃，例如可以为50℃、55℃、60℃、67℃、70℃等等。酶解时间为100-120min，例如可以为100min、110min、120min等等；pH自然。

承上所述，酶解过程中的酶解条件和时间可以根据蛋白酶的反应活性进行设置。

酶解完成后收集酶解产物。在一些实施例中，可以将酶解产物冻干为粉末；需要说明的是，在本申请的其他实施例中，酶解产物也可以为液态的形式存在。

本申请提供的富锌酵母多肽的制备方法至少具有以下优点：

在含有ZnSO₄的培养基培养酵母菌株ATCC204508，使酵母吸收结合锌离子，培养成富锌酵母，再对富锌酵母进行酶解，得到含锌的酵母源多肽提取物。该方法制备过程简单，工艺条件温和，能得到富锌酵母多肽。

本申请还提供一种富锌酵母多肽，富锌酵母多肽通过上述的富锌酵母多肽的制备方法制得。

本申请得到的富锌酵母多肽，具有较佳的抗氧化活性以及酪氨酸酶抑制活性，如果将其用于护肤品，能起到抗衰老以及美白的功效。

基于本申请提供的富锌酵母多肽的前述优点，本申请还提供一种应用，富锌酵母多肽在制备护肤品中的应用。

例如，一种护肤品，其包括辅料和上述富锌酵母多肽；或者，一种护肤品，其有效成分包括上述富锌酵母多肽。

需要说明的是，在本申请的实施例中，不对护肤品的形式进行限定，例如其可以是油状、膏体、乳液、溶液等等。相应地，本申请也不对护肤品中除了富锌酵母多肽之外的其余物质进行限定。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

酵母菌株ATCC204508、酵母菌株ATCC9763、酵母菌株ATCC9080、酵母菌株ATCC9987、酵母菌株ATCC4021258、酵母菌株ATCC22023均购买于ATCC菌种保存中心；

实施例1

本实施例提供一种富锌酵母多肽，主要通过以下步骤制得：

(1)使用含ZnSO₄的YPD培养基培养ATCC204508菌种；ZnSO₄的浓度为300mg/L；菌种和含ZnSO₄的YPD培养基的体积比为1：100；培养温度为28℃，培养时间为48h。

(2)发酵完成后，以10000r/min离心5min分离发酵液与菌体，舍去发酵液，酵母细胞在60℃烘干至恒重。

(3)取步骤(2)处理得到的干酵母进行粉碎，粉碎后按水和粉料体积比20：1溶解酵母粉，在冰浴中以600w超声破壁60min，超声后加入wt1‰木瓜蛋白酶，在60℃酶解120min，pH自然。

(4)取步骤(3)得到的酶解液冻干，得到富锌酵母多肽。

实施例1活得的富锌酵母多肽的实验数据如表1所示，表1中多肽含量是采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量，锌含量是采用锌(Zn)测定试剂盒测量得到。

表1

实验例1

取实施例1中得到的富锌酵母多肽，对不同浓度的富锌酵母多肽进行DPPH自由基清除率实验；

实验过程如下：

配制0.2mmol/L的DPPH·甲醇(或无水乙醇)溶液；配制200mg/mL浓度的待测样品(富锌酵母多肽)溶液；以VC作为阳性对照样品。

分别吸取2mL样品溶液和2mLDPPH·溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A1；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A2；分别吸取2mLDPPH·溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A0；每个样品做3个平行样。

实验结果如图1所示。

根据图1可以看出，实施例1中得到的富锌酵母多肽DPPH自由基清除率的IC₅₀为1.854mg/mL。

实验例2

取实施例1中得到的富锌酵母多肽，对不同浓度的富锌酵母多肽进行ABTS自由基清除率实验；

实验过程如下：

分别配置以下试剂：①2.45mmol/L过硫酸钾溶液；②10mmol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；③7mmol/L的ABTS储备液(用已制备的溶剂①配制)。

取ABTS储备液，用无水乙醇获10mmol/L的PBS(pH＝7.4)稀释60～70倍，使其在734nm处的吸光值为0.7±0.02，得到ABTS工作液；吸取6mLABTS工作液加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A₁；吸取6mL无水乙醇或PBS缓冲液加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A₂；吸取6mLABTS工作液加入60μL无水乙醇或PBS缓冲液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A₀。以VC作为样品的阳性对照，每个样品做三次平行。

实验结果如图2所示。

根据图2可以看出，实施例1中得到的富锌酵母多肽ABTS自由基清除率的IC₅₀为0.6727mg/mL。

实验例3

取实施例1中得到的富锌酵母多肽，对不同浓度的富锌酵母多肽进行羟自由基清除率实验；

实验过程如下：

取25mL试管，分别加2mmol/L FeSO₄、6mmol/L水杨酸各3mL，最后加入3mL 1mmol/LH₂O₂启动反应，置于37℃水浴中加热15min，测510nm处吸光度(A₀)。取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL待测液和0.8、0.6、0.4、0.2、0mL的蒸馏水共1mL，稀释成相应浓度，加入2mmol/LFeSO₄、6mmol/L水杨酸各3mL，最后加入3mL 1mmol/L H₂O₂启动反应，置于37℃水浴中加热15min，测510nm处吸光度(A₁)，和待测液吸光值(A₂)。每个样品做3个平行。

实验结果如图3所示。

根据图3可以看出，实施例1中得到的富锌酵母多肽羟自由基清除率的IC₅₀为4.516mg/mL。

实验例4

取实施例1中得到的富锌酵母多肽，对不同浓度的富锌酵母多肽进行酪氨酸酶抑制率实验；

检测方法参见程树军.化妆品评价替代方法标准实施指南[M].北京：中国质检出版社和中国标准出版社,2017中关于酪氨酸酶抑制率检测的方法。

实验结果如图4所示。

根据图4可以看出，实施例1中得到的富锌酵母多肽酪氨酸酶抑制率的IC₅₀为6.347mg/mL。

对比例1

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例对采用酵母菌株ATCC9763替换ATCC204508菌种并进行实施例1和实验例1-4的实验，实验结果如表2所示。

表2

对比例2

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例采用酵母菌株ATCC9080替换ATCC204508菌种并进行实施例1和实验例1-4的实验，实验结果如表3所示。

表3

对比例3

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例采用酵母菌株ATCC9987替换ATCC204508菌种并进行实施例1和实验例1-4的实验，实验结果如表4所示。

表4

对比例4

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例采用酵母菌株ATCC4021258替换ATCC204508菌种并进行实施例1和实验例1-4的实验，实验结果如表5所示。

表5

对比例5

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例采用酵母菌株ATCC22023替换ATCC204508菌种并进行实施例1和实验例1-4的实验，实验结果如表6所示。

表6

对比例6

请参阅实施例1以及实验例1-4。本对比例与实施例1的区别在于，培养基中不含有ZnSO₄；实验结果如表7所示。

表7

从实施例1、实验例1-实验例4、对比例1-对比例6可以看出：

对比例1-6得到的富锌酵母多肽DPPH自由基清除率IC₅₀远大于实施例1；对比例1-6得到的富锌酵母多肽ABTS自由基清除率IC₅₀远大于实施例1；对比例1-6得到的富锌酵母多肽羟自由基清除率IC₅₀远大于实施例1；对比例1-6得到的富锌酵母多肽酪氨酸酶抑制率的IC₅₀远大于实施例1；说明培养基中加入ZnSO₄可以提高酵母多肽的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制率；也说明同条件培养酵母菌株ATCC9763、酵母菌株ATCC9080、酵母菌株ATCC9987、酵母菌株ATCC4021258、酵母菌株ATCC22023得到的酵母多肽在抗氧化能力和酪氨酸酶抑制率方面的性能低于酵母菌株ATCC204508。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。