具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明涉及到的检测方法如下：

(1)植物甾醇酯含量测定-气相色谱法

采用气相色谱法进行检测样品中植物甾醇酯的含量，具体方法为：色谱条件：HP-5毛细管柱，分流比为30：1，进样量1μL，采用程序升温，初始温度120℃，保持2min，以15℃/min升至240℃，保持2min，以5℃/min升至280℃，保持10min，总耗时30min。

标准曲线制作：配制植物甾醇油酸酯标准溶液，浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL，进行同样的色谱程序，获得气相图谱，进行积分处理并绘制标准曲线。

样品处理：取待测样品加入到溶剂二氯甲烷中，封盖后，在超声波仪中进行超声处理，离心，得到待测液，气相检测后按照标准曲线计算植物甾醇酯含量。

(2)动物实验-小鼠耳肿模型的抗炎活性实验

参照(药理实验方法学)第四版的方法执行。

一、实验方法：

1.致炎剂配制：100％二甲苯。

2.实验或对照样品溶解于致炎剂中，为1mL/mL。

3.在实验小鼠的右耳的前后两面涂布致炎剂(对照)或含有样品的致炎剂(实验组)。致炎剂的体积为0.02mL/只。左耳不做任何处理。

4.1h后，将动物麻醉处死，剪下双耳用9mm直径打孔器分别用同一部位打下圆耳片，称重。

5.每鼠右耳片重量减去左耳片重即为肿胀度，将样品组、对照组及阳性组的肿胀程度进行统计学处理，及求出肿胀抑制率(％)。

二、试验材料：

1.试验动物：ICR小鼠(雄性)，体重：22g～25g，50只，分5组。

2.丙酸氯倍他索乳膏(10g：2mg)：江苏远恒药业19010701#(阳性物)。

3.二甲苯：国药试剂公司AR20161810#(造模型试剂)。

三、试验条件：

1.实验室温度：20～24℃；

2.相对湿度：60～70％。

实施例1

一种植物甾醇发酵物的制备方法，包括以下步骤：

1)培养基的配制：各组分按照质量分数计算，具体为葡萄糖1.0％，大豆蛋白胨0.2％、磷酸氢二钾0.1％、氯化镁0.1％，剩余部分用水补足，调节pH至6.5，并于121℃下灭菌15min，灭菌结束后冷却至40℃；

2)配制植物甾醇酯混合体系：各组分按照司班-40、吐温-20、植物甾醇酯和丙三醇的质量比为9:14:9:68的比例混合后，于温度为40℃、搅拌转速为200rpm条件下充分搅拌1h；

3)转化体系制备：将步骤2)所获得植物甾醇酯混合体系加入步骤1)所获得培养基中，植物甾醇酯混合体系和培养基的质量比是1:50，期间不断搅拌，搅拌时间1h，降温至30℃；

4)发酵：于无菌操作下，按照质量分数向步骤3)获得的转化体系中加入0.1％的酵母菌菌粉，于培养温度为35℃条件下，静置发酵6h；

5)灭活：将步骤4)获得的发酵液于80℃条件下灭活，灭活时间为2min，后冷却至室温；

6)均质：将步骤5)获得的灭活发酵液进行均质处理，均质转速为15000rpm，均质时间为10min，即获得最终产品植物甾醇酯发酵物。

实施例2

1)培养基的配制：各组分按照质量分数配制，具体为葡萄糖2.5％，大豆蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.3％、氯化镁0.2％，剩余部分用水补足，调节pH至5.5，并于121℃下灭菌15min，灭菌结束后冷却至60℃；

2)配制植物甾醇酯混合体系：各组分按照司班-40、吐温-20、植物甾醇酯和丙三醇的质量比为5:9:26:60的比例混合后，于温度为60℃、搅拌转速为350rpm条件下充分搅拌2h；

3)转化体系制备：将步骤2)所获得植物甾醇酯混合体系加入步骤1)所获得培养基中，植物甾醇酯混合体系和培养基的质量比是1:9，期间不断搅拌，搅拌时间1h，降温至37℃；

4)发酵：于无菌操作下，按照质量分数向步骤3)获得的转化体系中加入0.3％的酵母菌菌粉，于培养温度为37℃条件下，静置发酵24h；

5)灭活：将步骤4)获得的发酵液于90℃条件下灭活，灭活时间为10min，后冷却至室温；

6)均质：将步骤5)获得的灭活发酵液进行均质处理，均质转速为20000rpm，均质时间为15min，即获得最终产品植物甾醇酯发酵物。

实施例3

1)培养基的配制：各组分按照质量分数配制，具体为葡萄糖3.0％，大豆蛋白胨0.7％、磷酸氢二钾0.4％、氯化镁0.3％，剩余部分用水补足，调节pH至6.5，并于121℃下灭菌15min，灭菌结束后冷却至90℃；

2)配制植物甾醇酯混合体系：各组分按照司班-40、吐温-20、植物甾醇酯和丙三醇的质量比为1:5:47:47的比例混合后，于温度为90℃、搅拌转速为500rpm条件下充分搅拌3h；

3)转化体系制备：将步骤2)所获得植物甾醇酯混合体系加入步骤1)所获得培养基中，植物甾醇酯混合体系和培养基的质量比是1:5，期间不断搅拌，搅拌时间2h，降温至40℃；

4)发酵：于无菌操作下，按照质量分数向步骤3)获得的转化体系中加入0.3％的酵母菌菌粉，于培养温度为40℃条件下，静置发酵36h；

5)灭活：将步骤4)获得的发酵液于100℃条件下灭活，灭活时间为20min，后冷却至室温；

6)均质：将步骤5)获得的灭活发酵液进行均质处理，均质转速为30000rpm，均质时间为20min，即获得终产品植物甾醇酯发酵物；

对比例1

1)培养基的配制：各组分按照质量分数配制，具体为葡萄糖2.5％，大豆蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.3％、氯化镁0.2％，剩余部分用水补足，调节pH至5.5并于121℃下灭菌15min，灭菌结束后冷却至60℃；

2)配制植物甾醇酯混合体系：各各组分按照司班-40、吐温-20、植物甾醇酯和丙三醇的质量比为5:9:26:60的比例混合后，于温度为60℃、搅拌转速为350rpm条件下充分搅拌2h；

3)转化体系制备：将步骤2)所获得植物甾醇酯混合体系加入步骤1)所获得培养基中，植物甾醇酯混合体系和培养基的质量比是1:9，期间不断搅拌，搅拌时间1h，降温至37℃；

4)接种及灭活：于无菌操作下，按照质量分数向步骤3)获得的转化体系中加入0.3％的酵母菌菌粉，于90℃条件下灭活，灭活时间为10min，后冷却至室温；

5)均质：将步骤4)获得的灭活液进行均质处理，均质转速为20000rpm，均质时间为15min，即获得未发酵植物甾醇及培养基混合物；

实施例4

取实施例2制备所得的植物甾醇酯发酵物样液，配制成一种具有抗炎修复功能护肤乳液，具体成分如表1所示。

表1护肤乳液的成分(含量以质量分数计)

上述的护肤乳液的配制方法为：

用均质机将A相植物甾醇油酸酯发酵物均质10min处理，将B相缓慢加入A中，400r/min搅拌30min；将C相卡波加至60℃的蒸馏水中，使其完全溶解，再将上述两种混合体系混合，400r/min搅拌60min，搅拌冷却至室温，获得护肤乳液。

实施例5

取实施例2制备所得的植物甾醇酯发酵物样液，配制成一种具有抗炎修复功能的护肤霜，具体成分如表2所示。

表2护肤霜成分(含量以质量分数计)

上述的护肤霜的配制方法为：

用均质机将A相植物甾醇酯发酵物均质10min处理，将B相缓慢加入A中，400r/min搅拌30min；将C相卡波加至60℃的蒸馏水中，使其完全溶解，再将上述两种混合体系混合，400r/min搅拌60min，搅拌冷却至室温，获得护肤霜。

对比例2

由对比例1未发酵的植物甾醇酯与培养基混合物配制的一种护肤霜，具体成分如表3所示。

表3护肤霜成分(含量以质量分数计)

上述的护肤霜的配制方法为：

用均质机将A相植物甾醇油酸酯生物发酵液均质10min处理，将B相缓慢加入A中，400r/min搅拌30min；将C相卡波加至60℃的蒸馏水中，使其完全溶解，再将上述两种混合体系混合，400r/min搅拌60min，搅拌冷却至室温，获得护肤霜。

检测结果

(1)气相检测结果

将实施例2所得的植物甾醇酯发酵物和对比例1所得的植物甾醇酯与培养基混合物进行气相色谱检测，具体结果如表4所示：

表4植物甾醇酯发酵前后转化率对比

由表4及图1检测结果可以看出，植物甾醇酯经过酵母菌发酵后，组分发生明显变化。

(2)动物实验结果

将实施例4-5和对比例2所得护肤乳液或护肤霜进行小鼠耳肿模型的抗炎活性测试，结果如表5所示：

表5小鼠耳廓肿胀的影响实验结果

实施例4样液与模型组相比较有一定的抑制小鼠耳廓肿胀作用(50.1％，P＜0.01)；实施例5样液与模型组相比较有一定的抑制小鼠耳廓肿胀作用(54.2％，P＜0.01)；对照组与模型组相比较有一定的抑制小鼠耳廓肿胀作用(26.4％，P＜0.05)。即实施例4-5及对比例2对小鼠耳廓肿胀均有抑制作用，与模型组相比抑制率分别为50.1％、54.2％、26.4％。结果显示，植物甾醇酯发酵物的抗炎活性相比未发酵的植物甾醇酯增加1倍左右，与阳性对照药物丙酸氯倍他索接近。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。