一种大黄素高纯度分离工艺
阅读说明：本技术 一种大黄素高纯度分离工艺 (High-purity separation process for emodin ) 是由 周春 杨志平 孙伟 胥雯 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大黄素高纯度分离工艺,涉及大黄素分离工艺领域,旨在解决现有技术中,使用的试剂还为有毒性的溶剂,对人身和环境均构成威胁的问题,采用的技术方案是,通过向蒸馏水和虎杖粉的混合物内加酶,能够将虎杖粉外部细胞壁分解,从而使虎杖粉中的大黄素更容易被提取出,提高了大黄素的产率；使用乙酸乙酯进行萃取,能够将大黄素从混合物中分离出,且乙酸乙酯无毒无刺激性气味,保护了人员健康和环境安全；使用蒸馏水洗脱能够去除水溶性杂质,提高产品纯度；将过滤得到大黄素粗提取物上层析柱层析后洗脱、减压蒸馏、重结晶,洗脱液采用酒精不仅洗脱效果好,提高了大黄素产率,且无污染、易分离,进一步保护了人员健康和环境安全。(The invention discloses an emodin high-purity separation process, which relates to the field of emodin separation processes and aims to solve the problem that in the prior art, a used reagent is a toxic solvent and poses threats to both human bodies and the environment; the emodin can be separated from the mixture by using ethyl acetate for extraction, and the ethyl acetate is non-toxic and has no pungent smell, so that the health of personnel and the environmental safety are protected; the water-soluble impurities can be removed by using distilled water for elution, so that the purity of the product is improved; the emodin crude extract obtained by filtering is subjected to chromatographic column chromatography, elution, reduced pressure distillation and recrystallization, and the eluent is prepared from alcohol, so that the elution effect is good, the emodin yield is improved, the emodin crude extract is pollution-free and easy to separate, and the personnel health and the environmental safety are further protected.)
技术领域
本发明涉及大黄素分离工艺领域，具体为一种大黄素高纯度分离工艺。
背景技术
大黄素是一种有机物，化学式为C15H10O5，橙黄色长针状结晶，在丙酮中结晶为橙色，甲醇中结晶为黄色，熔点256～257℃，具有蒽醌的特殊反应，几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液。
大黄素为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根。掌叶大黄的根茎，属植物型药剂。
大黄素的生理活性决定它不仅可用于医疗，亦可以用于保健和日用化工品中，如有人把它用于护发和护肤品中，亦有人把它编入天然色素中去。国外，人们把它作为轻泻剂。
在临床上，用大黄素纯品治疗肿癌，主要用于白血病、胃癌等肿瘤，而最常用的则用于抑菌。它对很多细菌如各种葡萄球菌、溶血性链球菌、白喉杆菌、霍乱孤菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、皮肤真菌、枯草杆菌、草分枝杆菌、淋球菌、炭宜杆菌、草状菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用。其中对葡萄球菌、淋球菌、链球菌更为有效。本品对真菌、病毒、原虫也有效。同时，还具有利尿、利胆、解痉、降低血压抑制免疫功能等作用。
大黄素可用作泻药，虽有泻下活性，但由于体内易被氧化破坏，实际上泻下作用很弱，如与糖结合成苷类，则可发挥泻下作用。大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素葡萄糖苷者是大黄素与葡萄糖结合的苷，二者只是结合的位置不同，同时存在于大黄中。另有抗菌、止咳、抗肿瘤、降血压的功效。
大黄素是一种经基葱酮的衍生物，是荟大黄素、芦荟酸等葱酮类化合物，与浸渍法、回流提取法、超大黄的有效成分之一，存在于大黄、何首乌、决明子、首乌藤、虎杖等多种药材中，其药理作用广泛，具有较好的临床应用价值。
虎杖，中药名。为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根。春、秋二季采挖，除去须根，洗净，趁鲜切短段或厚片，晒干。分布于西北、华东、华中、华南及西南等地。具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效。用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，经闭，症瘕，趺打损伤，肺热咳嗽。
现有的大黄素提取大量使用苯等溶剂进行提取，这种方式不仅成本高昂，使用的试剂还为有挥发性和毒性的溶剂，对人身和环境均构成威胁。
发明内容
鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了大黄素高纯度分离工艺，包括以下步骤：
步骤1，取2-5g虎杖粉，添加25-35ml蒸馏水，得混合物A；
步骤2，向所述步骤1中得到的混合物A中添加4-10mg酶，根据混合物A的体积控制酶含量为2mg/g，并酶解40-90分钟，得混合物B；
步骤3，将所述步骤2中得到的混合物B进行萃取和浓缩后，使用蒸馏水洗脱水溶性杂质，得产物C，提高大黄素产率；萃取采用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯无毒无污染；
步骤4，将所述步骤3中得到的产物C进行离心分离、干燥后得白藜芦醇粗品；
步骤5，将所述步骤4中得到的所述白藜芦醇粗品使用60％酒精溶解后过滤，得大黄素提取物；
步骤6，将所述步骤5中得到的大黄素粗提取物经层析柱层析后，使用乙醇溶液洗脱，将洗脱液收集减压蒸馏、重结晶，得大黄素精提取物。
虎杖植物化学成份研究已较为深入，迄今已从中分离得到的化学成分有：蒽醌类、二苯乙烯类、萘醌类、黄酮类等。其中蒽醌类化合物主要有：大黄素一6一甲醚(Physcion)，大黄素(ernodin)，fallacinol，大黄素一8一甲醚(questin)，大黄素一8—0一B—D一葡萄吡喃糖甙(emoain一8—0—8一D—glucopyranoside)，2一甲氧基一6一乙酰基一7一甲基胡桃醌(PC一16)，白藜芦醇(resveratro)和白藜芦醇甙(piceid)。另外，通过光学异构化，得到了相应的顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇甙。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤2中添加的酶采用纤维素酶，纤维素酶的酶解作用破坏了植物细胞壁，使虎杖中白藜芦醇等活性成分更容易溶出，提高了产率。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤2中，在40℃、pH为3.0的环境下进行酶解，在酶解反应中，温度不仅影响反应速度，而且影响酶的活性。当温度升高时，反应速度加快，有利于酶解的进行，但温度过高会使酶失活，反应速度降低，因此，酶反应存在一个最适温度。大部分酶的活性受其环境pH的影响，pH的改变可以破坏酶空间构象，引起酶活性的损失，还能影响酶活性中心催化基团的解离，使底物转变成产物的过程受影响，同时pH的改变还影响酶活性中心结合基团的解离状态和底物解离状态，使底物不能与其结合，或结合后不能生成产酶解过程中使用搅拌装置进行间歇搅拌，能够使酶与混合物A均匀混合。
作为本发明的一种优选方案，所述间歇搅拌为搅拌3min，暂停5min；不仅能够使酶与混合物A充分均匀接触，还留有静置降解时间，使虎杖细胞细胞壁分解的更加彻底。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中使用乙醇溶液萃取重复3次，并将3次的萃取液合并；因萃取剂对大黄素溶解度有限制，多次萃取可以充分提取大黄素，提高大黄素产量。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中的所述浓缩采用恒温加热浓缩，浓缩过程中不仅能够蒸发多余的水分，还能够使乙醇挥发，从而使大黄素析出浓缩，将浓缩液装在梨形漏斗内，便于后续的洗脱操作。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中的洗脱步骤为，向梨形漏斗内添加蒸馏水，上下翻倒震荡，使蒸馏水与浓缩液内的水溶性杂质充分混合，利用大黄素不溶于水的性质，将梨形漏斗静置分层，分离洗脱水，重复洗脱3次，提高产率。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤4中，因静置分层分离并不能做到完全分离，故增加离心分离以进一步提纯，所述离心分离采用在30000r/min的转速下离心10min，将分离出的固体物质烘干。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤5中的过滤采用真空抽滤机抽滤，能够在滤材的一侧形成真空度，利用压差使待滤液快速通过滤材，提高过滤效果。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤6中的所述层析柱采用聚酰胺柱。
本发明的有益效果：本明通过向蒸馏水和虎杖粉的混合物内加酶，能够将虎杖粉外部细胞壁分解，从而使虎杖粉中的大黄素更容易被提取出，提高了大黄素的产率；使用乙酸乙酯进行萃取，能够将大黄素从混合物中分离出，且乙酸乙酯无毒无刺激性气味，保护了人员健康和环境安全；使用蒸馏水洗脱能够去除水溶性杂质，提高产品纯度；将过滤得到大黄素粗提取物上层析柱层析后洗脱、减压蒸馏、重结晶，洗脱液采用酒精不仅洗脱效果好，提高了大黄素产率，且无污染、易分离，进一步保护了人员健康和环境安全。
进一步的，使用虎杖粉、乙醇和乙酸乙酯进行大黄素的分离，虎杖粉、乙醇和乙酸乙酯成本低廉，研发、生产成本低。
具体实施方式
实施例1
本实施例公开了本发明的第一种实施方式，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取2虎杖粉，添加25ml蒸馏水，将虎杖粉和蒸馏水混合均匀，得混合物A；
步骤2，向所述步骤1中得到的混合物A中添加4mg酶，并酶解40分钟，以便于大黄素的提取，得混合物B；
步骤3，将所述步骤2中得到的混合物B进行萃取，对萃取液进行浓缩后，使用蒸馏水洗脱浓缩液，去除水溶性杂质，得产物C；萃取采用乙酸乙酯进行萃取；
步骤4，将所述步骤3中得到的产物C进行离心分离，以进一步提纯产物，将离心所得固体干燥后得白藜芦醇粗品；
步骤5，将所述步骤4中得到的所述白藜芦醇粗品使用60％酒精溶解，利用大黄素溶于酒精的特性从白藜芦醇粗品中提取大黄素，溶解后过滤，得大黄素粗提取物；
步骤6，将所述步骤5中得到的大黄素粗提取物经层析柱层析后，使用乙醇溶液洗脱，将洗脱液收集减压蒸馏、重结晶，得大黄素精提取物。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤2中添加的酶采用纤维素酶，分解虎杖细胞壁，便于后续萃取操作中能够提取出更多的大黄素。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤2中，在40℃、pH为3.0的环境下进行酶解，采用水浴恒温加热升至40℃，使用稀硫酸调节pH，酶解过程中使用搅拌装置进行间歇搅拌。
作为本发明的一种优选方案，所述间歇搅拌为搅拌3min，暂停5min。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中萃取重复3次，并将3次的萃取液合并；萃取过程中需上下充分振荡，以保证大黄素的产率。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中的所述浓缩采用恒温加热浓缩，将水分和酒精蒸发，将浓缩液装在梨形漏斗内。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤3中的洗脱步骤为，向梨形漏斗内添加蒸馏水，上下翻倒震荡后静置分层，利用乙醇易溶于水，而大黄素不溶于水的性质，将大黄素与酒精分离，分离洗脱水，重复洗脱3次。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤4中，所述离心分离采用在30000r/min的转速下离心10min，取出固体物后使用烘箱将分离出的固体物质烘干。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤5中的过滤采用真空抽滤机抽滤。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤6中的所述层析柱采用聚酰胺柱。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，
步骤1，取5虎杖粉，添加35ml蒸馏水，得混合物A；
步骤2，向所述步骤1中得到的混合物A中添加10mg酶，并酶解90分钟，得混合物B。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，
步骤1，取3.5g虎杖粉，添加30ml蒸馏水，得混合物A；
步骤2，向所述步骤1中得到的混合物A中添加7mg酶，并酶解60分钟，得混合物B。
上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
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