一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
阅读说明：本技术 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法 (Method for preparing chiral 2-chloro-3, 4-difluorophenethyl alcohol ) 是由 周硕 赖敦岳 王瑞玲 张双玲 陈振明 于 2015-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法,该方法以2-氯-3,4-二氟苯乙酮为底物,利用酮还原酶催化还原底物,生成手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇,所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明以价廉易得的2-氯-3,4-二氟苯乙酮为底物,采用生物催化剂酮还原酶进行不对称还原反应,获得手性纯度高的2-氯-3,4-二氟苯乙醇,得率高、反应条件温和、操作简便,避免了化学还原法存在的反应条件苛刻、催化剂制备复杂、成本高、易燃和产物手性纯度不够高等问题,具有良好的实际工业应用价值。(The invention discloses a method for preparing chiral 2-chloro-3, 4-difluorophenyl ethanol, which takes 2-chloro-3, 4-difluorophenyl acetophenone as a substrate and utilizes ketoreductase to catalyze and reduce the substrate to generate the chiral 2-chloro-3, 4-difluorophenyl ethanol, wherein the amino acid sequence of the ketoreductase is shown as SEQ ID No. 9. The method takes cheap and easily-obtained 2-chloro-3, 4-difluoroacetophenone as a substrate, adopts a biocatalyst ketoreductase to carry out asymmetric reduction reaction to obtain the 2-chloro-3, 4-difluorophenethyl alcohol with high chiral purity, has high yield, mild reaction conditions and simple and convenient operation, avoids the problems of harsh reaction conditions, complex catalyst preparation, high cost, flammability, insufficient chiral purity of the product and the like in a chemical reduction method, and has good practical industrial application value.)
技术领域
本发明涉及生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法。
背景技术
替卡格雷(Ticagrelor)是由美国阿斯利康(AstraZeneca)公司研发的一种新型小分子抗凝血药物。该药对ADP引起的血小板聚集有明显的抑制作用，且口服使用后起效迅速，因此能有效改善急性冠心病患者的症状。在多条替卡格雷的合成路线中(WO2008018822，WO2013150495)，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇(3)都是关键中间体。例如，其中一条的合成路线如下(中国医药工业杂志，2014,45.4：315-321):
现有技术中，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇[(S)-3]由2-氯-3,4-二氟苯乙酮进行化学不对称还原合成，该方法常受到产物光学纯度不够高、得率低、催化剂制备复杂、成本高和易燃等因素的限制，从而不利于实际的生产利用。
利用生物催化实现还原反应生产手性仲醇是一种高效的绿色催化技术。通过文献检索，没有生物酶催化该还原反应的实例。因此，通过广泛筛选，获得能高效催化目标反应的酮还原酶，并据此建立产率高且操作简单的手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的绿色生产工艺，将具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法，与现有化学合成工艺相比，该方法的产物得率高、光学选择性好且环境友好。
一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法，以2-氯-3,4-二氟苯乙酮为底物，利用酮还原酶(KRED)催化还原底物，生成手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
反应的合成路线为：
上述酮还原酶的氨基酸序列均可通过商业化的全基因合成制得。
所获得的产物2-氯-3,4-二氟苯乙醇均具有手性。所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示时，酮还原酶催化还原底物生成的2-氯-3,4-二氟苯乙醇主要为S型。
所述酮还原酶可采用本领域常规的技术手段进行制备，具体为：将含酮还原酶基因的基因片段与pET28a质粒的酶切产物连接，转入感受态的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得转化的重组子；将重组子进行诱导表达，细胞破碎，离心获得酮还原酶，经冻干后，获得酮还原酶酶粉。
现有技术中，手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇采用化学合成法制备获得，未有生物催化制备的相关报道，而本发明发现氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的酮还原酶可以催化2-氯-3,4-二氟苯乙酮还原成手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇。
优选地，反应起始时的反应体系中，底物的质量百分浓度为1％～25％(w/v)，更优选，1～20％；所述酮还原酶的用量为底物质量的1％～30％，更优选，5～20％。
作为优选，所述反应的温度为10～45℃，更优选，20～30℃；所述反应的时间为20～25h。
作为优选，反应液的pH值为6.0～10.0；更优选，pH值为7.0～8.0。
上述反应体系还包括辅因子及其再生体系；所述的辅因子为NAD+/NADH或NADP+/NADPH；而辅因子的再生体系则是指能够将氧化型辅因子NAD+/NADP+转换成还原型辅因子NADH/NADPH的过程。
优选地，所述辅因子用量为底物质量的0.02％～2％。
上述反应结束后，反应液需经后处理才能获得成品，所述后处理为：向反应液中加入硅藻土，过滤，采用正己烷萃取滤液，获得的有机相经洗涤、浓缩后，获得成品手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以2-氯-3,4-二氟苯乙酮为底物，采用特定的酮还原酶进行不对称还原反应，获得得率高、手性纯度高的2-氯-3,4-二氟苯乙醇，反应条件温和，操作简便，避免了目前纯粹的化学合成方法存在的反应条件苛刻、催化剂制备复杂、成本高、易燃和产物手性纯度不够高等问题，具有良好的实际工业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例3中反应0h后取样所得的样品的HPLC图谱。
图2为本发明实施例3中反应20h后取样所得的样品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1酮还原酶(KRED)酶粉的摇瓶生产工艺
将编码SEQ ID NO.9所示氨基酸序列的基因片段(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，与pET28a质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到4mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。
取过夜的培养物，以1/100的接种量转接到100mL含氨苄青霉素抗体的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6，加入IPTG，于30℃下继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(2mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干36h，即得冻干粉状的酮还原酶(KRED)酶粉。
实施例2酮还原酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)毫克级反应
在5mL反应瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL TEA-HCl缓冲液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD+、0.1mgNADP+(溶于0.1mL缓冲液)，再加入20mg葡萄糖以及2mg葡萄糖脱氢酶，最后，分别加入2mg实施例1中获得的酮还原酶KRED酶粉(0.5U/mg，溶于0.1mL缓冲液)，在30℃下摇床反应20h。
取反应后的产物进行HPLC分析，检测产物的产率和产物ee值，结果如表1所示：
表1酮还原酶反应的产率和产物ee值
产率标记说明：+代表产率1％-20％，++代表产率20％-50％，+++代表产率50％-80％，++++代表产率80％-95％，+++++代表产率>95％；
ee值标记说明：ee值指产物2-氯-3,4-二氟苯乙醇的对映体过量(enantiomericexcess)，计算公式如下：eeS＝(CS-3-CR-3)/(CS-3+CR-3)*100％，CS-3指样品中S-2-氯-3,4-二氟苯乙醇的浓度，CR-3指样品中R-2-氯-3,4-二氟苯乙醇的浓度。
+代表ee值<50％，++代表ee值50％-80％，+++代表ee值80％-90％，++++代表ee值90％-99％，+++++代表ee值>99％。
实施例3百毫克级制备工艺
在5mL反应瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL TEA-HCl缓冲液(0.1M，pH7.0)、7.5mg酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，溶于0.1mL缓冲液)、0.75mgNAD+(溶于0.1mL缓冲液)，在30℃下，进行磁力搅拌反应，设置两个反应时间：0h和20h。
反应后取样对产物进行HPLC分析，结果如图1和图2所示；
图1为反应0小时后获得的产物的分析结果，图中7.67分钟的物质为底物；
图2为反应20小时后获得的产物的分析结果，图中保留时间为6.47分钟的物质为产物，最终转化率大于99.5％。
实施例4不同温度和pH下反应
在5mL反应瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3mL异丙醇，待底物完全溶解后，分别加入1.2mL0.1M不同pH(6.0～10.0)的TEA-HCl缓冲液、7.5mg酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，溶于0.1mL缓冲液)、0.75mgNAD+(溶于0.1mL缓冲液)，在不同温度(10～45℃)，磁力搅拌下，进行反应20h。反应后取样对产物进行HPLC分析。各组产率结果如下表：
表2不同温度和pH下反应的产率
从上表可以看出：反应体系的温度为10～45℃，优选20～30℃。反应液的pH值为6.0～10.0，优选pH值为7.0～8.0。
实施例5不同酶量和辅酶量下反应
在5mL反应瓶中，加入150mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL0.1M pH7.0的TEA-HCl缓冲液、分别加入不同量的(底物量的1～30％)酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，溶于0.1mL缓冲液)、分别加入不同量的(底物量的0.02％～2％)NAD+(溶于0.1mL缓冲液)，在30℃，磁力搅拌下，进行反应20h。反应后取样对产物进行HPLC分析。各组产率结果如下表：
表3不同酶量和辅酶量下反应产率
从上表可以看出：反应体系中，酮还原酶的用量为底物质量的1％～30％，优选5～20％。辅因子用量为底物质量的0.02％～2％。
实施例6不同底物浓度反应
在5mL反应瓶中，分别加入(15～375mg)的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.3mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL0.1M pH7.0的TEA-HCl缓冲液、按底物量的5％加入不同量的酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，溶于0.1mL缓冲液)、0.75mgNAD+(溶于0.1mL缓冲液)，在30℃，磁力搅拌下，进行反应20h。反应后取样对产物进行HPLC分析。各组产率结果如下表：
表4不底物浓度下反应产率
从上表可以看出：反应体系中，底物的质量百分浓度为1％～25％(w/v)，优选1～20％。
实施例7百克级制备工艺
将450g的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮加至20L反应釜中，加入1.5L异丙醇，搅拌至完全溶解；加入8.5L Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH7.0)，于30℃下搅拌(450rpm)均匀；然后依次加入22.5g酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)、2.25g NAD+后，进行反应。HPLC监控，反应24h后，产物转化率为99.3％，终止反应。
向反应液中加入50g硅藻土搅拌0.5h，过滤，滤液用正己烷萃取(3.0L×2)，滤饼返回反应釜，加入正己烷搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤两次，浓缩后得到0.37kg的2-氯-3,4-二氟苯乙醇，收率81.4％，GC纯度98.7％，ees值99.5％。
实施例8公斤级制备工艺
将1.35kg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮加至20L反应釜中，加入3L异丙醇，搅拌至完全溶解；加入7.0L Tris-HC缓冲液(0.1M，pH7.0)，于30℃下搅拌(450rpm)均匀；然后依次加入67.5g酮还原酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)与6.75g NAD+后，进行反应。HPLC监控，反应24h后，产物转化率为99.2％，终止反应。
向反应液中加入150g硅藻土搅拌0.5h，过滤，滤液用正己烷萃取(9.0L×2)，滤饼返回反应釜，加入正己烷搅拌过滤，合并有机相；有机相用饱和食盐水洗涤两次，浓缩后得到1.09kg 2-氯-3,4-二氟苯乙醇，收率80.1％，GC纯度99.2％，ees值99.5％。
对比例1
在5mL反应瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL TEA-HCl缓冲液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD+、0.1mgNADP+(溶于0.1mL缓冲液)，最后，分别加入2mg酮还原酶KRED酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，溶于0.1mL缓冲液)，在30℃下摇床反应20h。
取反应后的产物进行HPLC分析，检测产物的产率和产物ee值，结果没有2-氯-3,4-二氟苯乙醇产生。
对比例2
在5mL反应瓶中，加入10mg的底物2-氯-3,4-二氟苯乙酮和0.1mL异丙醇，待底物完全溶解后，加入1.2mL TEA-HCl缓冲液(0.1M，pH7.0)、0.1mgNAD+、0.1mgNADP+(溶于0.1mL缓冲液)，最后，分别加入2mg酮还原酶KRED酶粉(氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，溶于0.1ml缓冲液)，在30℃下摇床反应20h。
取反应后的产物进行HPLC分析，检测产物的产率和产物ee值，结果没有2-氯-3,4-二氟苯乙醇产生。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
<130> SZP213236CN
<141> 2021-08-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 9
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Ala Ser Phe His Gln Gln Phe Phe Thr Leu Asn Asn Gly Asn Lys
1 5 10 15
Ile Pro Ala Ile Ala Ile Ile Gly Thr Gly Thr Arg Trp Tyr Lys Asn
20 25 30
Glu Glu Thr Asp Ala Thr Phe Ser Asn Ser Leu Val Glu Gln Ile Val
35 40 45
Tyr Ala Leu Lys Leu Pro Gly Ile Ile His Ile Asp Ala Ala Glu Ile
50 55 60
Tyr Arg Thr Tyr Pro Glu Val Gly Lys Ala Leu Ser Leu Thr Glu Lys
65 70 75 80
Pro Arg Asn Ala Ile Phe Leu Thr Asp Lys Tyr Ser Pro Gln Ile Lys
85 90 95
Met Ser Asp Ser Pro Ala Glu Gly Leu Asp Leu Ala Leu Lys Lys Met
100 105 110
Gly Thr Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Phe Val Ser
115 120 125
Lys Glu Ala Asn Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Trp Lys Asp Met Glu
130 135 140
Gln Leu Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe
145 150 155 160
Ala Val Glu Asp Leu Gln Arg Ile Leu Lys Val Ala Glu Val Lys Pro
165 170 175
Gln Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro
180 185 190
Gly Ile Tyr Lys Phe Cys Gln Glu His Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr
195 200 205
Ser Pro Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Thr Ala Gln Asp Asp Ser Gln
210 215 220
Pro Phe Phe Glu Tyr Val Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Ile Lys Ser
225 230 235 240
Glu Ala Gln Ile Ile Leu Arg Trp Val Thr Lys Arg Gly Val Leu Pro
245 250 255
Val Thr Thr Ser Ser Lys Pro Gln Arg Ile Ser Asp Ala Gln Asn Leu
260 265 270
Phe Ser Phe Asp Leu Thr Ala Glu Glu Val Asp Lys Ile Thr Glu Leu
275 280 285
Gly Leu Glu His Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Trp Asn Lys Leu Tyr Asp
290 295 300
Lys Tyr Asn Tyr Ala Ala Gln Lys Val Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu
305 310 315 320
His His His His His His
325
<210> 22
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Met Glu Pro Ala Thr Leu His Asp Ser Thr Lys Ile Leu Ser Leu Asn
1 5 10 15
Thr Gly Ala Gln Ile Pro Gln Ile Gly Leu Gly Thr Trp Gln Ser Lys
20 25 30
Glu Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr
35 40 45
Arg His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gln Val Gly
50 55 60
Gln Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr
65 70 75 80
Thr Lys Leu Trp Cys Thr Gln His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp
85 90 95
Gln Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met
100 105 110
His Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile
115 120 125
Leu Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr
130 135 140
Asn Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys
145 150 155 160
Thr Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn
165 170 175
Leu Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gln Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala
180 185 190
Asn Gln Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Asn
195 200 205
Phe Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly
210 215 220
Ser Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Ile Ile Leu Glu Ile Ala
225 230 235 240
Lys Lys Asn Asn Val Gln Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val
245 250 255
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260 265 270
Lys Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala
275 280 285
Ile Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro
290 295 300
Asn Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Leu Glu His His His His His His
325
<210> 23
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Ser
1 5 10 15
Gln Gly Arg Lys Ala Ala Glu Arg Leu Ala Lys Lys Thr Val Leu Ile
20 25 30
Thr Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu Tyr Leu
35 40 45
Glu Ala Ser Asn Gly Asp Met Lys Leu Ile Leu Ala Ala Arg Arg Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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165 170 175
Pro Thr Gly Ser Ile Tyr Cys Ala Ser Lys Phe Ala Val Gly Ala Phe
180 185 190
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195 200 205
Leu Ile Ala Pro Gly Leu Val Glu Thr Glu Phe Ser Leu Val Arg Tyr
210 215 220
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245 250 255
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275 280