针对SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的抗体及其用途
阅读说明：本技术 针对SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的抗体及其用途 (Antibodies against SARS-CoV-1 or SARS-CoV-2 and uses thereof ) 是由 袁权 巫洋涛 熊华龙 张天英 王邵娟 蒋艺超 侯汪衡 施洋 张雅丽 罗文新 夏宁 于 2021-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域,特别是冠状病毒(例如SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1)的诊断、预防和治疗领域。具体而言,本发明涉及抗冠状病毒的单克隆抗体,以及包含所述抗体的组合物(例如,诊断剂和治疗剂)。此外,本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。(The present invention relates to the fields of immunology and molecular virology, in particular the fields of diagnosis, prevention and treatment of coronaviruses (e.g. SARS-CoV-2 and/or SARS-CoV-1). In particular, the invention relates to monoclonal antibodies against coronaviruses, and compositions (e.g., diagnostic and therapeutic agents) comprising the antibodies. Furthermore, the invention relates to the use of said antibodies. The antibodies of the invention are useful for the diagnosis, prevention and/or treatment of coronavirus infection and/or diseases caused by said infection.)
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是冠状病毒的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗冠状病毒的单克隆抗体，以及包含所述抗体的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
背景技术
冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。
目前，尚无批准用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的特效药物。应对SARS-CoV-2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗，氧疗措施和抗病毒治疗，如α-干扰素、洛匹那韦/利托那韦、磷酸氯喹等，这些措施带来的临床效果有限。研究发现，在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的SARS-CoV-2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明，对确证患有COVID-19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ARDS)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后，病人体内的病毒载量迅速降低，患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在SARS-CoV-2中的重要性，且表明了除了疫苗研发外，应当研制一种能够高效和特异性中和SARS-CoV-2的单克隆抗体，用于COVID-19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治COVID-19具有重要意义。
发明内容
本申请的发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，分别获得了能够特异性高效中和SARS-CoV-2的鼠源抗体，以及对SARS-CoV-2和SARS-CoV-1具有广谱性的鼠源抗体。在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对这些鼠源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了这些鼠源抗体的人源化抗体。本发明的人源化抗体不仅保留了与鼠源亲本抗体类似(甚至更优)的功能和性质，而且具有较高的人源化程度，不易引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。
本发明的抗体
在第一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD)，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(b)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：序列为SEQ ID NO：5的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：6的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：7的VH CDR3；和/或，如下3个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：序列为SEQID NO：8的VL CDR1，序列为SEQ ID NO：9的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：10的VL CDR3。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:1所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。在某些实施方案中，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO：2所示的序列；
(v)与SEQ ID NO：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
在某些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的，例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的CDR区移植入人源框架序列。
在某些实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可以包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列，所述框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的鼠源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列(即，人重链胚系基因所编码的氨基酸序列)的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列(即，人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列)的轻链框架区序列，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的鼠源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：来源于重链胚系序列IGHV1-3*01的重链框架区FR1、FR2和FR3，以及来源于重链胚系序列IGHJ5*02的重链框架区FR4；和，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：来源于轻链胚系序列IGKV4-1*01的轻链框架区FR1、FR2和FR3，以及来源于轻链胚系序列IGKJ2*01的轻链框架区FR4。所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的鼠源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：17所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：17所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NOs：18、19任一项所示的序列；
(v)与SEQ ID NOs：18、19任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NOs：18、19任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)包含如SEQ ID NO:17所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:18所示的序列的VL；或
(2)包含如SEQ ID NO:17所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:19所示的序列的VL。
在某些实施方案中，第一方面所述的抗体或其抗原结合片段是36H6或其抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
在某些实施方案中，第一方面所述的抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的一项或多项：
在某些实施方案中，第一方面所述的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项多多项：
(1)特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD；
(2)不结合或基本不结合SARS-CoV-1的S蛋白的RBD；
(3)阻断或抑制SARS-CoV-2对Ace2受体的结合，和/或阻断或抑制SARS-CoV-2对细胞的感染；
(4)不影响或基本上不影响SARS-CoV-1对Ace2受体的结合；
(5)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2；
(6)预防和/或治疗SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染所导致的疾病(例如COVID-19)。
在第二方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的S蛋白的受体结合区(RBD)，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(b)包含下述3个根据Kabat编号系统定义的互补决定区(CDRs)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如下3个根据Kabat编号系统定义的重链CDRs：序列为SEQ ID NO：11的VH CDR1，序列为SEQ ID NO：12的VH CDR2，序列为SEQ ID NO：13的VH CDR3；和/或，如下3个根据Kabat编号系统定义的轻链CDRs：序列为SEQ ID NO：14的VL CDR1，序列为SEQ ID NO：15的VL CDR2，序列为SEQ ID NO：16的VLCDR3。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:3所示的重链可变区(VH)中含有的3个CDR；和/或，如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区(VL)中含有的3个CDR。在某些实施方案中，所述VH中含有的3个CDR和/或所述VL中含有的3个CDR由Kabat、IMGT或Chothia编号系统定义。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：3所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO：4所示的序列；
(v)与SEQ ID NO：4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如SEQ ID NO:3所示的序列的VH和包含如SEQ ID NO:4所示的序列的VL。
在某些实施方案中，本发明抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的，例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的CDR区移植入人源框架序列。
在某些实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可以包含来源于人免疫球蛋白的框架区序列，所述框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的鼠源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：来源于人重链胚系序列(即，人重链胚系基因所编码的氨基酸序列)的重链框架区序列，以及来源于人轻链胚系序列(即，人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列)的轻链框架区序列，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至相应的鼠源残基的回复突变。
在某些实施方案中，第二方面所述的抗体或其抗原结合片段是2B4或其抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。
在某些实施方案中，第二方面所述的抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的一项或多项：
在某些实施方案中，第二方面所述的抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的一项多多项：
(1)特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的RBD；
(2)特异性结合SARS-CoV-1的S蛋白的RBD；
(3)阻断或抑制SARS-CoV-2对Ace2受体的结合，和/或阻断或抑制SARS-CoV-2对细胞的感染；
(4)阻断或抑制SARS-CoV-1对Ace2受体的结合，和/或阻断或抑制SARS-CoV-1对细胞的感染；
(5)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1；
(6)预防和/或治疗SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1感染或由SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1感染所导致的疾病(例如COVID-19、SARS)。
在某些实施方案中，本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。
在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，
本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在一些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体与其所源自的序列相比可以具有一个或多个氨基酸的保守置换。在此类实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体与其所源自的野生型序列相比可以具有相同或基本相同的效应子功能。
在另一些实施方案中，所述重链恒定区(CH)的变体可以包含一个或多个氨基酸突变以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。可以通过将抗体恒定区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低)。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、吞噬作用、CDC等。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是鼠κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:20所示的重链恒定区(CH)；和/或，SEQ ID NO:21所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)。
在某些实施方案中，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在本文中，本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。
抗体的制备
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核苷酸序列，和/或编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。
在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列，和/或编码本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHODG44)。
在另一个方面，提供了制备本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
药物组合物及治疗用途
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、瑞德西韦等)。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
在另一个方面，本发明提供了用于中和SARS-CoV-2的方法，其包括使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含SARS-CoV-2的样品与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物接触。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2病毒感染相关的疾病(例如COVID-19)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在另一个方面，本发明涉及本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2；和/或
(2)用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在另一个方面，本发明提供了用于中和SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1的方法，其包括使用本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1。
在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1的样品与本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物接触。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1感染或与SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1病毒感染相关的疾病(例如COVID-19、SARS)的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在另一个方面，本发明涉及本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)在体外或受试者(例如人)体内中和SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1；和/或
(2)用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1感染或与SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1感染相关的疾病(例如COVID-19、SARS)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。
本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
在本文中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
在本文中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
缀合物
本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对SARS-CoV-2的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
因此，在某些实施方案中，本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。
在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
在某些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，所述可检测的标记可以选自酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白，如FITC、TRITC或PE)、放射性核素或生物素。
在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
试剂盒及检测用途
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、或本发明的缀合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的缀合物。
在另一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含特异性识别本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。
在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人或鼠的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠IgG抗体或抗人IgG抗体。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
在另一个方面，本发明提供了检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被SARS-CoV-2感染的细胞在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的缀合物，其包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一些实施方案中，所述方法包括使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述方法还包括使用带有可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。
在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人或鼠的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠IgG抗体或抗人IgG抗体。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的细胞。
在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，提供了本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被SARS-CoV-2感染的细胞在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测SARS-CoV-2或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被SARS-CoV-2感染的细胞在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在另一个方面，本发明提供了检测冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的缀合物，其包含本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一些实施方案中，所述方法包括使用本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述方法还包括使用带有可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。
在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人或鼠的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠IgG抗体或抗人IgG抗体。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明第二方面所述的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在所述冠状病毒或被所述冠状病毒感染的细胞。
在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据所述冠状病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了所述冠状病毒。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，提供了本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了冠状病毒，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测所述冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被所述冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了所述冠状病毒。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 1，SARS-CoV-1)”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：AAP13567.1。由SARS-CoV-1所导致的肺炎被称为SARS。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure2:1121-1123(1994))。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。在某些实施方案中，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体CDR被供体CDR替换。提供CDR的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(例如鼠)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(例如鼠)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性B细胞中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。
为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物(例如鼠)的CDR区移植入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”，由重链胚系基因所编码的氨基酸序列称为重链胚系序列，由轻链胚系基因所编码的氨基酸序列称为轻链胚系序列。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，SARS-CoV-2感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如SARS-CoV-2感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如SARS-CoV-2感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
发明的有益效果
本发明提供了中和SARS-CoV-2的单克隆抗体。具体而言，这些单克隆抗体与SARS-CoV-2的S蛋白RBD区域上的表位结合并中和SARS-CoV-2。本发明的单克隆抗体能够抑制SARS-CoV-2的RBD蛋白与受体ACE2的结合。本发明提供的单克隆抗体具有以下优势：(1)单克隆抗体36H6具有强中和能力，在SARS-CoV-2假病毒SARS-CoV2-LvPP的中和试验中半抑制浓度(IC50)为0.041nM。(2)单克隆抗体2B4能交叉结合SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的RBD，并且能交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV-1，在假病毒SARS-CoV1-LvPP和SARS-CoV2-LvPP的中和试验中半抑制浓度分别为0.739nM和0.503nM，具有广谱性。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了SARS-CoV-2的RBD蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图2显示了单抗36H6和2B4对SARS-CoV-2(图2A)、SARS-CoV-1(图2B)和RaTG13-CoV(图2C)的RBD蛋白结合活性的ELISA检测结果。
图3显示了单抗36H6和2B4对SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和RaTG13-CoV的RBD蛋白的亲和力测定(Biacore)结果。
图4显示了不同剂量的SARS-CoV1-LvPP假病毒对H1299ACE2hR细胞的感染能力测试。
图5显示了不同剂量的SARS-CoV2-LvPP假病毒对H1299ACE2hR细胞的感染能力测试。
图6显示了单抗2B4和36H6对SARS-CoV1-LvPP(图6A)和SARS-CoV2-LvPP(图6B)的感染中和(NAT)剂量效应关系。
图7显示了单抗2B4和36H6的在SARS-CoV2 VSVpp假病毒感染模型中的中和活性测定结果。
图8显示了单抗2B4和36H6的Fab片段对SARS-CoV-2RBD结合ACE2的阻断能力分析。其中，图8A为单抗2B4；图8B为单抗36H6；图8C为无关对照抗体。
图9显示了人源化抗体36H6-10和36H6-12对RBD-His的结合活性的ELISA检测结果。
图10显示了人源化抗体36H6-10和36H6-12在SARS-CoV2VSVpp假病毒感染模型中的中和活性测定结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：抗SARS-CoV-2受体结合区RBD基因的合成与表达载体的构建
参考SARS-CoV2-2全基因序列(MN908947.3)，将编码SARS-CoV2-2受体结合域RBD蛋白(对应于S蛋白的第316-550位氨基酸)的核苷酸序列，按人类密码子偏好性进行优化。并且，在优化的核酸序列的N端连接上信号肽编码序列(人类B2M的引导序列)，C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His)，将此蛋白命名为RBD-His，其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。采用NEBuilder HiFi DNA AssemblyMaster Mix(NEB公司)将上述核苷酸序列连接至表达载体EIRBsMie-C18hA2dtSCT(酶切位点为AgeI/BglII)，经过DNA测序证明序列完全与设计一致，最终获得SARS-CoV-2的RBDhis的表达载体EIRBsMie-RBDhis。
实施例2：SARS-CoV-2的RBD抗原的表达与纯化
1.SARS-CoV-2的RBD抗原的表达
以3x106的密度将ExpiCHO细胞以适量的培养基ExpiCHOTM Expression Medium(Thermo Scientific公司)培养于三角摇瓶中，置于37℃、8％CO2、转速适当的恒温摇床中培养24h，待细胞密度达到6x106的密度。
按照试剂盒的说明书使用ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit(ThermoScientific公司)将实施例1中得到的载体EIRBsMie-RBDhis转染至ExpiCHO细胞中。继续以相同的条件培养17-24h后，添加试剂盒中提供的补料和增强剂，将细胞更换至32℃、5％CO2，转速适当的恒温摇床中，继续培养6天。
2.SARS-CoV-2的RBD抗原的纯化
培养6天后，收集ExpiCHO表达细胞悬液，12000rpm，室温离心30min，留取上清并在PBS中透析，然后通过0.22μm滤膜过滤。
将透析至PBS中的上清样品经中压Ni-excel层析(GE介质)纯化，30mM咪唑去除杂蛋白，250mM咪唑洗脱目的蛋白。目的蛋白即为SARS-CoV-2的RBD抗原，将其命名为SARS-CoV-2RBD。SDS-PAGE电泳结果显示SARS-CoV-2RBD的纯度达90％以上(图1)。将得到的目的蛋白透析至PBS缓冲液并置于-20℃保存。
实施例3：鼠源单克隆抗体的获得
1.小鼠免疫
使用标准的体内免疫方式，详细方法参见Ed Harlow et al.,“Antibodies ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory 1988.简要过程如下：
使用实施例2中获得的SARS-CoV-2RBD蛋白与弗氏佐剂等体积混合并乳化。对6-8周龄BALB/c雌鼠进行双侧腹股沟皮下多点注射免疫，初次免疫后间隔2周加强免疫一次。用间接ELISA测定血清抗体滴度，4周后进行融合实验。
小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合前72小时进行脾脏最后加强免疫，此次免疫的抗原为无佐剂抗原，浓度稀释至1mg/mL。沿脾脏纵向注射蛋白50μL。同时，复苏小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基养至对数生长期，以备融合使用。
2.杂交瘤细胞的制备与筛选
取脾脏加强免疫72小时后的小鼠，取脾脏制成细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以获得杂交瘤细胞。并制备饲养细胞与杂交瘤细胞共同培养，本实验室使用小鼠腹腔巨噬细胞和小周龄的小鼠胸腺细胞作为饲养细胞。
通过间接ELISA筛选杂交瘤细胞，包被实施例2中的SARS-CoV-2RBD蛋白50ng/孔，封闭后加入60μL融合细胞培养上清，37℃反应1小时，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(GAM-HRP)，37℃反应30min后进行显色，并挑选出阳性克隆孔。
取BALB/C小鼠5只，经腹腔注射得到腹水。将腹水高速离心后取上清，加入等体积饱和硫铵溶液，在冰上沉淀30min后，25000rpm离心10min，沉淀用0.2M十二水合磷酸氢二钠缓冲液溶解起来，然后用Protein A亲和层析柱纯化(购自美国GE公司)，获得了两株纯化的小鼠单克隆抗体(表2)，分别命名为36H6(也可称为m36H6)和2B4(也可称为m2B4)。
表2.单抗信息
实施例4：鼠源单克隆抗体序列的获得
将培养至对数生长期的36H6和2B4杂交瘤细胞利用Trizol法(Invitrogen)提取RNA，最终提取到的RNA沉淀溶于50μl DEPC水中。接着，将重链可变区和轻链可变区分别进行反转录PCR，将PCR产物回收后进行测序。序列经blast比对后确定抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。最终确定的36H6和2B4的可变区的氨基酸序列如表1和表2所示。
进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了小鼠单克隆抗体36H6和2B4的CDR序列。最终确定的36H6和2B4的可变区的CDR的氨基酸序列如表1和表3所示。
表3.抗体36H6和2B4的序列
表3：单抗可变区序列
实施例5：单克隆抗体2B4和36H6对SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和RaTG13的ELISA结合活性
分别参考Genebank上已经公布的病毒基因组序列SARS-CoV-1(AAP13567.1)、RaTG13(MN996532.1)，将上述2种冠状病毒的RBD序列参考实施例1中的方式构建各自RBD表达载体，并参考实施例2的方法制备重组蛋白。其中，SARS-CoV-1的RBD重组蛋白命名为SARS-CoV1-RBD，RaTG13-CoV的RBD重组蛋白命名为RaTG13-RBD。
将实施例2和上述获得的SARS-CoV2-RBD，SARS-CoV1-RBD和RaTG13-RBD蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL。在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时。用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次，然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
取实施例3中获得的小鼠单克隆抗体36H6和2B4以含20％新生牛血清的PBS溶液稀梯度释至10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL，按如下步骤进行ELISA检测：
(1)样品反应：取已分别包被SARS-CoV2-RBD，SARS-CoV1-RBG和RaTG13-RBG蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应30分钟。
(2)酶标记物反应：完成样品反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(GAM)反应液，置于37℃温箱反应30分钟。
(3)显色反应：完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15分钟。
(4)终止反应及读值测量：完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。小鼠单克隆抗体36H6和2B4与SARS-CoV2-RBD，SARS-CoV1-RBG和RaTG13-RBG的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。
结果分析：结果如图2所示，36H6在浓度为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL时，对SARS-CoV2-RBD均具有较强结合活性，对SARS-CoV1-RBD和RaTG13-RBD无结合活性。2B4在浓度为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL时，对SARS-CoV2-RBD和SARS-CoV1-RBD均具有较强结合活性，对RaTG13-RBD无结合活性。结果表明，36H6能够特异性识别SARS-CoV-2的RBD，而2B4能够交叉识别SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的RBD，具有一定的广谱性。
实施例6：单抗2B4和36H6对SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和RaTG13的受体结合区蛋白RBD的亲和力常数检测
本研究使用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术检测单抗2B4和36H6分别与SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和RaTG13的RBD蛋白的亲和力。本实施例使用的检测方法为捕获法，使用Protein G芯片(GE公司)对鼠单克隆抗体进行捕获。根据鼠单抗分子量及三种RBD分析物的分子量，利用配体偶联水平计算公式计算得出配体响应值约1000RU左右。将两株抗体2B4和36H6分别用PBS稀释至合适的浓度，其中2B4为50μg/ml，36H6为40μg/mL，使其与Protein G芯片结合的响应值稳定在1000RU左右。SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和RaTG13的RBD蛋白分别从200nM的初始浓度开始依次往下进行2倍稀释(共测试11个稀释梯度，最高测试浓度为200nM，最低测试浓度为0.19nM)，使用表面等离子共振检测仪Biacore 8000(GE公司)对抗原抗体亲和力进行检测。
结果如图3所示，2B4对于SARS-CoV-2的RBD蛋白的亲和力最高，平衡解离常数(KD)为3.05nM(图3A)，2B4对于SARS-CoV-1和RaTG13的RBD蛋白也具有一定程度的亲和力，平衡解离常数(KD)为34.1nM(图3B)和67nM(图3C)。36H6仅对于SARS-CoV-2的RBD蛋白具有较好的亲和力，平衡解离常数(KD)为5.84nM(图3D)。说明单抗36H6是特异性针对SARS-CoV-2的RBD的抗体，而2B4对其他两种冠状病毒RBD具有一定的交叉结合活性。
实施例7：单抗2B4和36H6对SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的假病毒中和实验
1.假病毒包装细胞准备
复苏293T细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基养至对数生长期，以7×106的密度将293T细胞接种于10cm细胞培养板上，置于5％CO2细胞培养箱37℃培养12h，待细胞至95-99％汇合时转染。
按照试剂盒的说明书使用LipofectamineTM 3000(ThermoFisher Scientific公司)将质粒psPAX2(慢病毒包装质粒)，pLvEF1αmNGNL(携带绿色荧光报告基因的慢病毒穿梭质粒)和pCMV-SARS1-S(表达SARS-CoV-1的全长Spike蛋白)共转染293T细胞，包装SARS-CoV-1假病毒(简称为SARS-CoV1-LvPP)；将质粒psPAX2，pLvEF1αmNGNL和EIRBsMie-SARS2-SFL质粒共转染293T细胞，包装SARS-CoV-2假病毒(简称为SARS-CoV2-LvPP)。转染6小时后，去除并更换包装培养基。转染24小时后，第一次收集假病毒，收集全部细胞上清液，置于4℃保存。并替换入预热的新鲜培养基，在37℃、5％CO2细胞培养箱培养24小时。即转染48小时后，第二次收集假病毒，收集全部的细胞上清液与第一次收集的上清液混合。2000rpm离心30分钟，用0.45μm孔径的滤器过滤上清液。利用过表达人ACE2的H1299细胞株(H1299ACE2hR)测定病毒滴度，分装并置于-80℃保存。两种假病毒感染滴度的测定方法如下：
(1)将对数生长期的H1299ACE2hR细胞，以1.2×104/100μL/孔的密度接种于96孔板，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
(2)SARS-CoV1-LvPP和SARS-CoV2-LvPP两种假病毒上清，每孔加入30μL感染细胞。按照系列3倍稀释的条件实施不同滴度的病毒感染，共5个稀释梯度，分别为原倍(30μL)、3倍稀释(10μL)、9倍稀释(3.3μL)、27倍稀释(1.1μL)、81倍稀释(0.37μL)。
(3)感染H1299ACE2hR细胞36-48小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像(20倍水浸镜头，拍摄25视野)。完成后采用Columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光(mNeonGreen)阳性细胞数量。两种假病毒梯度稀释感染H1299ACE2hR细胞结果如图4和图5所示。该结果证明，获得的假病毒SARS-CoV1-LvPP和SARS-CoV2-LvPP均能高效感染H1299-hAce2细胞，绿色荧光阳性细胞数、绿色荧光阳性细胞百分率均与感染的病毒量线性相关。
(4)通过线性回归分析，结合不同剂量假病毒感染后可以“点亮”的细胞数，可以测算出SARS-CoV1-LvPP的首孔感染滴度为1.4×105TU/mL(假病毒原始浓度为4.67×105TU/mL)，而SARS-CoV2-LvPP假病毒首孔感染3.03×105TU/mL(假病毒原始浓度为1.01×106TU/mL)。
2.单抗2B4和36H6对SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的假病毒中和能力
为测试本发明发展的两株单克隆抗体是否能在体外中和SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，我们使用SARS-CoV1-LvPP和SARS-CoV2-LvPP两种假病毒在H1299ACE2hR细胞上进行测试。具体测试方法如下：
(1)将对数生长期的H1299ACE2hR细胞，以1.2×104/100μL/孔的密度接种于96孔板，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
(2)将两种抗体使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基制成不同浓度的稀释液，最高浓度为1000nM，按照2倍系列稀释。
(3)将不同浓度的抗体稀释液60μL分别于1.0×105TU/mL的SARS-CoV1-LvPP和SARS-CoV1-LvPP等量混合，在37℃孵育1小时，使抗体与假病毒充分结合。
(4)取上一步骤获得的病毒抗体孵育液100μL加入已经铺好H1299ACE2hR细胞，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养感染。
(5)感染36-48小时后，用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像(20倍水浸镜头，拍摄25视野)。完成后采用Columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析计算每个细胞孔中绿色荧光蛋白(mNeonGreen)表达阳性细胞数量。
(6)对比未加抗体的感染对照孔平均阳性细胞数，计算每孔感染抑制率。计算公式如下：(阳性对照孔绿色荧光阳性细胞数-待测孔绿色荧光阳性细胞数)/阳性对照孔绿色荧光阳性细胞数×100％。计算获得两种抗体不同剂量条件下的抑制率后，采用GraphpadPrism 8软件，绘制抑制曲线，并采用4参数曲线拟合模型，计算半数最大抑制浓度(IC50)。
结果如图6所示，单抗2B4和36H6对SARS-CoV-2均有较强的中和活性，其中36H6强于2B4，其IC50达0.041nM，但该抗体对SARS-CoV-1并无中和作用；单抗2B4对SARS-CoV-1和SARS-CoV-2均有较强中和活性，该抗体对两种病毒的IC50分别达到0.739nM和0.503nM。上述结果说明，36H6是专一性针对SARS-CoV-2的高效中和抗体，而2B4是针对SARS-CoV-1/2通用的中和抗体。
实施例8：单抗2B4和36H6与SARS-CoV2 VSVpp假病毒的中和能力分析
SARS-CoV2-VSVpp假病毒中和方法参考文献方法进行(doi:https://doi.org/10.1101/2020.04.08.026948)。主要实验过程简述如下，为构建携带SARS-CoV-2spike蛋白的VSV假病毒，将SARS-CoV-2的spike基因(序列来源GenBank：MN908947)的C末端截短18个氨基酸的SARS-CoV-2的spike基因克隆到真核表达载体pCAG中，获得pCAG-nCoVSde18。将质粒pCAG-nCoVSde18转染到Vero-E6中。转染48小时后，将VSVdG-EGFP-G(Addgene，31842)病毒接种到表达SARS-CoV-2Sde18截短蛋白的细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的VSVdG-EGFP-G病毒，并加入抗VSV-G大鼠血清以阻断残留的VSVdG-EGFP-G的感染。子代病毒将携带SARS-CoV-2 Sde18截短蛋白，获得假病毒VSV-SARS-CoV2 VSVpp。VSVdG-EGFP-G感染后24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45-μm，Millipore，SLHP033RB)以去除细胞碎片，并在-80℃下保存备用。通过梯度稀释的上清感染过表达人ACE2的BHK21细胞株BHK21-hACE2。通过感染后GFP阳性细胞的数目来确定病毒滴度。
将抗体36H6和2B4分别稀释到106.4nM作为梯度1，2倍往下梯度稀释，共16个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的SARS-CoV2VSVpp病毒(MOI＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％FBS-DMEM稀释。将80μL混合物加入预先铺板的BHK21-hACE2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用Columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。
利用非线性回归分析计算抗体的IC50。抗体m36H6和m2B4对SARS-CoV2 VSVpp病毒抑制的结果如图7所示，IC50分别为0.021nM和0.893nM。
实施例9：单抗2B4和36H6阻断SARS-CoV-2RBD结合受体ACE2的能力测试
为评估单克隆抗体2B4和36H6是否能在体外阻断SARS-CoV-2 spike蛋白与ACE2受体间的结合，我们采用Biacore 8000(GE公司)进行分析。方法如下：
(1)使用木瓜蛋白酶(购自Sigma公司)对2B4、36H6和无关对照抗体(controlmAb)，进行酶切处理，酶切后样品使用MabSelect SuRe进行层析，成功酶切的Fab片段不能结合到MabSelect SuRe介质上，而未被酶切的残余抗体和Fc片段被MabSelect SuRe介质捕获去除。MabSelect SuRe层析穿透样品，透析至20mM PB7.4，再使用Millipore的10kd浓缩管进行浓缩，浓缩后样品备用。
(2)将C端融合IgG抗体Fc段的ACE2重组蛋白(ACE2-Ig)稀释至合适浓度，使用Protein A芯片(GE公司)对ACE2-Ig进行捕获。
(3)将实施例2中制备的SARS-CoV-2RBDhis抗原稀释至20mM PB7.4，浓度为200nM，并分别于2B4、36H6、对照抗体Fab的不同浓度样品(800nM、400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM)等体积混合后，孵育60分钟。
(4)对步骤(3)中配制的系列蛋白样品进行Biacore测试，获得各自结合和解离动力学数据，并制图展示如图8所示。
结果如图8所示，2B4和36H6的Fab能均能直接阻断SARS-CoV-2RBD与ACE2的结合，其中36H6 Fab的阻断作用较强，在与RBD摩尔浓度比为1:2的条件下即可表现出显著阻断效应，在与RBD摩尔浓度比为1:1或者更高的条件下，几乎可完全阻断；同时2B4抗体的Fab在在与RBD摩尔浓度比为1:1的条件下亦表现出显著阻断效应，而在更高摩尔比条件下可实现完全阻断。相比之下，对照抗体的Fab片段即使在高浓度条件下，也无明显阻断效应体现。上述结果证明，2B4和36H6抗体能直接阻断SARS-CoV-2RBD与ACE2的结合，这可能是其高中和活性的原因。
实施例10：36H6人源化抗体的制备
通过IMGT搜索基因数据库，找出与鼠源抗体36H6的FR区同源性最高的人胚系基因可变区序列。经同源性分析，确定IGHV1-3*01及IGKV4-1*01胚系基因序列分别作为人源化抗体的重链和轻链改造模板，同时由于胚系基因不包含改造部分所需的FR4，因此FR4部分需要单独比对，最终确定IGHJ5*02及IGKJ2*01胚系基因序列分别作为人源化抗体的重链和轻链FR4的改造模板。将鼠抗36H6的重链和轻链CDR区分别移植到人源模板vH和vK的FR框架上，同时将鼠抗与胚系基因的FR区进行序列比对，对差异氨基酸进行选择性的回复突变，最终设计1条人源化重链和2条人源化轻链，共2株人源化抗体，可变区序列如下表所示：
采用重叠延伸PCR(splicing overlapping extension-PCR,SOE-PCR)方法获得36H6人源化抗体轻、重链可变区基因。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒(TianGen,DP118-02)回收纯化PCR产物。采用Gibson装配方法，将鼠源抗体的重链可变区片段构建到含有人重链恒定区(SEQ ID NO:20)编码序列的PTT5-H载体(酶切位点AgeI/SalI)，将轻链可变区片段构建到含有人轻链恒定区(SEQ ID NO:21)编码序列的PTT5-K载体(酶切位点AgeI/BsiWI)。将重组载体转化入DH5α感受态细胞(深圳康体)，在氨苄抗性的LB板上生长12h后挑取单克隆，送测序(上海生工)。利用无内毒素质粒大提试剂盒(TianGen,DP117)大量提取测序正确的重组质粒。经表达纯化后获得h36H6-10和h36H6-12人源化抗体。
实施例11：h36H6-10和h36H6-12人源化抗体的表达与纯化
11.1 36H6人源化抗体真核表达
利用双质粒瞬时转染Expi-293F细胞表达h36H6-10和h36H6-12人源化抗体。准备活率高于95％的Expi-293F细胞，以4×106的密度取200ml接种于1L细胞培养瓶中。取0.5mgPTT5-36H6-H3重组质粒与0.5mg PTT5-36H6-K1重组质粒，作为表达h36H6-10的轻重链质粒；0.5mg PTT5-36H6-H3重组质粒与0.5mg PTT5-36H6-K1重组质粒，作为表达h36H6-10的轻重链质粒。将混合后的1mg轻重链质粒与2mg PEI混合，剧烈震荡8s后静置8min，将混合物加入200ml细胞中。4h后补充200mL Freestyle培养基，置于5％CO2培养箱37℃表达7天。收集细胞上清，10000rpm离心30min,取上清并进行后续的纯化。
11.2 36H6人源化抗体的纯化与制备：
用0.22μm滤器过滤上述细胞上清；打开AKTA仪器，先分别用A液(200mM十二水合磷酸氢二钠)和B液(100mM一水柠檬酸)冲洗A管道和B管道，装上protein A柱子；用A液以8mL/min的流速平衡protein A柱子15min以上，待仪器检测的UV值、pH值和电导率稳定后进行下一步；以6-10mL/min流速上样，随后UV值会上升，该峰为穿透峰，并继续用A液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待pH值不再变化后用B液以6-10mL/min流速进液，随后pH值下降，UV值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中，并收取洗脱峰样品待检测；用A液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和protein A柱子，取下柱子，4℃保存。纯化的抗体用20mM PBS缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者BCA测取浓度分装至1.5mL管中，存放于-20℃备用。
实施例12：h36H6-10和h36H6-12人源化抗体对SARS-CoV-2的ELISA结合活性
12.1反应板的制备
将SARS-CoV2-RBD(His标签)蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
12.2 36H6人源化抗体的ELISA检测
取实施例11中获得的人源化抗体h36H6-10、h36H6-12，以SD-1溶液从10ug/mL为起始浓度开始梯度稀释，共稀释7个梯度。取已包被SARS-CoV2-RBD蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60分钟。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗人IgG反应液，置于37℃温箱反应30分钟。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15分钟。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。36H6人源化抗体与SARS-CoV2-RBD的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。
结果如图9所示，两株36H6人源化抗体在浓度为10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL和0.12μg/mL时对SARS-CoV2-RBD均具有较强结合活性。结果表明，人源化改造后的h36H6-10和h36H6-12能够保持与SARS-CoV-2RBD较强的结合活性。
实施例13：h36H6-10和h36H6-12人源化抗体在SARS-CoV2 VSVpp假病毒感染模型中的中和活性测定
通过实施例8所述的检测方法分别在假病毒感染模型中测定人源化抗体h36H6-10和h36H6-12、嵌合抗体36H6-Cab(其重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21所示的重链恒定区和SEQ ID NO:22所示的轻链恒定区)、以及亲本鼠源单抗36H6(mAb-36H6)的中和活性。
将待测抗体分别稀释到1.333nM作为梯度1，3倍往下梯度稀释，共6个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的SARS-CoV2 VSVpp病毒(MOI＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％FBS-DMEM稀释。将80μL混合物加入预先铺板的BHK21-hACE2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用Columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。利用非线性回归分析计算抗体的IC50。
结果如图10所示，两株36H6人源化抗体对SARS-CoV-2均有较强的中和活性。其中，鼠源单抗36H6的IC50为0.017nM(与实施例8中测得的结果基本相当)，人源化抗体h36H6-10的IC50为0.026nM，而h36H6-12甚至强于h36H6-10，其IC50达0.016nM。上述结果说明，两株36H6人源化抗体的中和活性均不弱于亲本鼠源单抗36H6。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 养生堂有限公司；厦门大学
<120> 针对SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的抗体及其用途
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<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 36H6 CDR-L3
<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-H1
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-H2
<400> 12
Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-H3
<400> 13
Ala Arg Trp Gly Thr Val Glu Trp Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-L1
<400> 14
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Tyr Asn Gln Glu Asn Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-L1
<400> 15
Phe Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 2B4 CDR-L1
<400> 16
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> h36H6-10/h36H6-12 VH
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> h36H6-10 VL
<400> 18
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> h36H6-12 VL
<400> 19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 20
<211> 330
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 人κ轻链恒定区
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 792
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 编码RBD-His蛋白的核苷酸序列
<400> 22
Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala
1 5 10 15
Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys
35 40 45
Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala
50 55 60
Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly
85 90 95
Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala
100 105 110
Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Thr
115 120 125
Cys Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys
130 135 140
Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala
145 150 155 160
Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala
165 170 175
Cys Cys Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys
180 185 190
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr
195 200 205
Ala Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala
210 215 220
Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys
225 230 235 240
Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr Ala Cys Gly
245 250 255
Gly Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala
260 265 270
Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys
275 280 285
Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly
290 295 300
Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr
305 310 315 320
Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly
325 330 335
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly
340 345 350
Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr
355 360 365
Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys
370 375 380
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Thr
385 390 395 400
Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr
405 410 415
Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys
420 425 430
Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly
435 440 445
Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala
450 455 460
Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly
465 470 475 480
Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys
485 490 495
Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Cys Gly
500 505 510
Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly
515 520 525
Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala
530 535 540
Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Gly
545 550 555 560
Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys
565 570 575
Thr Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys
580 585 590
Ala Gly Ala Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala
595 600 605
Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly
610 615 620
Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys
625 630 635 640
Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly
645 650 655
Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys
660 665 670
Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr
675 680 685
Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly
690 695 700
Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly
705 710 715 720
Ala Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr
725 730 735
Thr Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Thr
740 745 750
Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Ala
755 760 765
Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
770 775 780
Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys
785 790
<210> 23
<211> 264
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> RBD-His蛋白的氨基酸序列
<400> 23
Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
20 25 30
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
35 40 45
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
50 55 60
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
65 70 75 80
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
85 90 95
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
100 105 110
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
115 120 125
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
130 135 140
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
165 170 175
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
180 185 190
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
195 200 205
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
210 215 220
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
225 230 235 240
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Arg
245 250 255
Ser Gly His His His His His His
260
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