一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用
阅读说明：本技术 一种靶向nkg2a和pd-l1的双特异性抗体及应用 (Bispecific antibody targeting NKG2A and PD-L1 and application thereof ) 是由 王双 桂勋 王晋 王荣娟 蔺利娟 焦莎莎 徐晓红 张畅 朱戬 李祥烽 吴建 任 于 2021-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明根据现有技术已报道的抗NKG2A抗体轻重链氨基酸序列为基础,通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力成熟获得的亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体,将突变抗体的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中,将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对,筛选获得抗NKG2A的突变Fab抗体,连接人抗体Fc段。将第二抗原结合分子(如抗PD-L1抗体)通过linker连接到Fc段的C端,获得双特异性抗体。(According to the invention, based on the light and heavy chain amino acid sequence of an anti-NKG2A antibody reported in the prior art, a mutant antibody with improved affinity and/or improved dissociation constant is obtained by constructing a light and heavy chain mutant antibody library for affinity maturation, CDRs (complementary deoxyribonucleic acid) regions of the mutant antibody are constructed into a human Fab heavy chain gene expression vector and a mammalian cell expression vector containing human kappa subclass light chain constant region genes, the heavy chain vector and the light chain vector of the affinity matured antibody are in cross pairing, and a mutant Fab antibody of anti-NKG2A is obtained by screening and is connected with a human antibody Fc segment. A second antigen-binding molecule (e.g., an anti-PD-L1 antibody) is linked to the C-terminus of the Fc fragment via a linker to obtain a bispecific antibody.)
本专利申请要求于2020年4月30日提交的申请号为CN202010369911.7的中国发明专利申请的优先权权益，再次将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，特别是肿瘤治疗性抗体领域。具体而言，本发明涉及一种靶向人NKG2A的高亲和力人源化抗体，以及其与抗人PD-L1纳米抗体组成的双特异性抗体的制备及用途。
背景技术
近几年来，肿瘤免疫治疗取得了前所未有的成功，仍只有少数患者表现出持久的疗效。改善临床响应以及克服耐药机制是肿瘤免疫治疗领域正面临的挑战，而阻断其它抑制性免疫受体可能是一种可行的策略。
NKG2A(killer cell lectin like receptor C1)又名KLRC1或CD159A，是一类II型跨膜蛋白，属于NKG2/CD94自然杀伤细胞凝集素受体家族。NKG2A在胞外具有识别碳水化合物的结构域CRD(Carbohydrate-recognitiondomain，通常由115-130个氨基酸组成，含2-3个二硫键，有2-3个N连接的糖基化位点，其配体识别的过程往往是Ca2+依赖性的)。NKG2A主要在NK细胞、NKT细胞以及T细胞中表达；相对分子质量为43000，由233个氨基酸组成，其胞外区有135个氨基酸。NKG2A通过与其配体HLA-E的相互作用来抑制免疫细胞的激活。HLA-E广泛表达于头颈癌、肺癌、前列腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞表面，而免疫细胞释放的IFN-γ会进一步上调HLA-E的表达(J Clin Invest.2019；129(5):2094-2106)。与其它受体-配体(如PD-1/PD-L1)类似，NKG2A/HLA-E这对免疫检查点也是肿瘤免疫逃逸的重要信号通路，阻断NKG2A/HLA-E之间的相互作用成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的靶点。目前有多家公司(如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca和ChemPartner)开发了针对NKG2A的单克隆抗体，通过阻断NKG2A/HLA-E的相互作用来提高NK细胞以及T细胞的免疫活性来杀伤肿瘤细胞。
最新的研究发现，NKG2A与PD-1在头颈癌及黑色素瘤浸润性的CD8+T细胞上共表达，同时阻断NKG2A/HLA-E及PD-1/PD-L1两条信号通路有很强的协同抗肿瘤作用(Cell.2018；175:1-13,Cell.2018；175:1744-1755)。同时针对多种靶点进行治疗对提高肿瘤免疫治疗的响应率及降低免疫耐受有积极的作用。目前针对NKG2A的治疗性抗体对抗原的亲和力不足、结合NKG2A单靶点对肿瘤的治疗效果不佳，全球范围内尚没有针对NKG2A的上市药物。法国Paoli-Calmettes研究院正在推进一项人源化抗NKG2A单抗IPH2201与同种异体干细胞移植联用治疗血液恶性肿瘤的I期临床安全性实验(NCT02921685)。
发明内容
为解决上述问题，本发明根据现有技术已报道的抗NKG2A抗体轻重链氨基酸序列为基础，通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力成熟获得的亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体，将突变抗体的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中，将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，筛选获得抗NKG2A的突变Fab抗体，连接人抗体Fc段。将抗PD-L1抗体通过linker连接到Fc段的C端，获得对NKG2A和PD-L1具有双特异性的抗体。具体而言：
一方面，本发明提供一种抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其是在hum270基础上通过构建突变抗体库进行亲和力成熟获得的亲和力提高和/或解离常数改善的抗体，其中所述hum270的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:6所示。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体的CDRs区与hum270的CDRs区相比区别在于重链CDRs区，其中所述抗体HCDR1-3的序列如表3中H0-H6任一的所示。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体的CDRs区与hum270的CDRs区相比区别在于轻链CDRs区，其中所述抗体LCDR1-3的序列如表4中K0-270KX任一的LCDR1-3所示。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体的重链可变区CDRs选自表3中H0-H3任一的HCDR1-3，和/或所述抗体的轻链可变区选自表4中K0-K2任一的LCDR1-3。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体的重链可变区选自由SEQ ID NO:6、12、13组成的组，轻链可变区选自由SEQ ID NO:4、14、15组成的组；
并且，所述抗体不包括重链可变区为SEQ ID NO:4，同时轻链可变区为SEQ ID NO:6的情况。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵阳、骆驼、羊驼、人，或是源于上述物种的嵌合抗体。
进一步，本发明所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv和单结构域片段。
第二方面，本发明提供一种多特异性抗体或其抗原结合片段，其包括至少一个结合第一抗原的第一抗原结合部分，以及至少一个结合第二抗原的第二抗原结合部分；其中所述结合第一抗原的第一抗原结合部分为本发明第一方面所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为抗体治疗靶点，包括但不限于CD19、CD3、CD80、CD86、CD25、OX40、PD-L1、PD-1、VEGF、CTLA4、RANKL、EGFR、HER2、TNF-α。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为肿瘤治疗相关抗原，优选PD-L1、PD-1。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分选自人源抗体、人源化抗体、人嵌合抗体；所述第二抗原结合部分选自单链抗体、单域抗体。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗原结合部分包括完整的抗体Fc段；并且，所述第二抗原结合部分共价偶连于第一抗原结合部分的Fc段。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合部分通过Linker融合至第一抗原结合部分重链的C端。
进一步，本发明所述的多特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述Linker为(GnS)m，其中n、m为1-6。
第三方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明第一方面所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段，和/或本发明第二方面所述多特异性抗体或其抗原结合片段。
进一步，本发明所述组合物，其特征在于还包含药学上可接受的载体，并作为药物组合物使用，优选所述药物组合物为水剂、针剂、粉针剂。
第四方面，本发明还提供第一方面所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段、第二方面所述多特异性抗体或其抗原结合片段、或第三方面所述组合物在制备治疗肿瘤和/或提高机体免疫应答药物中的用途。
第五方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明第一方面所述的抗NGK2A抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述多特异性抗体或其抗原结合片段。
第六方面，本发明提供一种载体，其包含本发明第五方面所述的多核苷酸。
第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第五方面所述的多核苷酸或本发明第六方面所述的载体。
第八方面，本发明提供一种制备抗NGK2A抗体或其抗原结合片段、或制备包含抗NGK2A抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体或其片段的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达抗NGK2A抗体或其抗原结合片段、或包含抗NGK2A抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体或其片段的条件下培养本发明第七方面所述宿主细胞；
(2)从细胞培养物中分离纯化抗NGK2A抗体或其抗原结合片段、或包含抗NGK2A抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体或其片段。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿
具体实施方式
部分而列出。
术语“NKG2A”是存在于NK、NKT和T细胞亚组中的抑制性受体，NKG2A(OMIM 161555，其全部公开内容通过引用结合于本文中)是转录物的NKG2组的成员(Houchins,等(1991)J.Exp.Med.173:1017-1020)。NKG2A由跨度25kb显示出一些差别剪接的7个外显子编码。NKG2A与CD94一起形成发现于NK细胞、α/βT细胞、γ/δT细胞和NKT细胞的亚组的表面上的异二聚体抑制性受体CD94/NKG2A。与抑制性KIR受体类似，其在其胞质结构域具有ITIM。如用于本文中，“NKG2A”指NKG2A基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型(isoform)。还包括与野生型全长NKG2A共享一个或多个生物学性质或功能，并共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。人NKG2A在3个结构域中包含233个氨基酸，其中胞质结构域包含残基1-70，跨膜区包含残基71-93，和胞外区包含残基94-233。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与NKG2A抗原的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒RBD的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。
“单结构域片段”由对冠状病毒RBD显示出足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如，Riechmann，1999，JournalofImmunological Methods 231:25–38)。
本发明的抗NKG2A抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol.13(10):1011-2)。
“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.(Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903)。
术语“嵌合抗体”，指这样的抗体：它的轻链和重链基因已通常通过基因工程，由源自不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因而构建。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段与人恒定区段连接。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(KD)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD＝kd/ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用的KD值，来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如SPR，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x10-6M以下，优选5.0x10-8M以下，更优选1.0x10-8M以下、5.0x10-9M以下，更优选1.0x10-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
第一，本发明在现有技术已知具有治疗活性的抗NKG2A抗体的基础上进行改造，进一步提高了亲和力、特异性等关键性能。对轻重链抗体的CDRs区分别进行突变建库，筛选单条链CDRs突变且特异性结合能力改善的突变体，进一步交叉配对筛选获得比初始抗体结合能力强、特异性提高的突变抗体。
第二，本发明将优化结构、性能提高的抗NKG2A抗体与PD-L1靶向片段融合，构建了NKG2A/PD-L1双特异性抗体，经过FACs和ELISA检测，所述NKG2A/PD-L1双特异性抗体针对两个靶点NKG2A、PD-L1都具有高亲和力和强特异性。
第三，本发明所述NKG2A/PD-L1双特异性抗体在肿瘤动物模型上的治疗效果超出了本领域技术人员的合理预期。在荷瘤小鼠模型中，NKG2A/PD-L1双特异性抗体的治疗效果不仅显著优于两种单特异性抗体单独使用的效果，还能够达到甚至优于两种抗体以更高的总剂量联合使用的治疗效果，即本发明所述NKG2A/PD-L1双特异性抗体的两个靶向部分产生了协同效应。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：hum270对人NKG2A-CD94重组蛋白亲和力分析。
图2：用于构建CDR突变库的引物。
图3：解离常数有改善的突变体克隆。
图4：突变体抗体轻重链可变区基因。
图5：各突变体抗体轻重链交叉配对产生Fab编号设计。
图6：NKG2A和PD-1/PD-L1通路抑制剂对PBMC免疫重建皮下荷瘤A375肿瘤生长的抑制作用。
图7：NKG2A和PD-1/PD-L1通路抑制剂对PBMC免疫重建皮下荷瘤A375肿瘤瘤重的影响。
图8：hum270-F2对PBMC免疫重建A375皮下移植瘤肿瘤生长抑制作用
图9：hum270-F2与AM10-F2对PBMC免疫重建A375皮下移植瘤肿瘤生长抑制作用。
图10：FACS分析hum270-F2/AM10-F2对NK92细胞表面NKG2A结合活性。
图11：FACS检测hum270-F2/AM10-F2与MDA-MB-231细胞表面PD-L1结合活性分析。
图12：ELISA检测hum270-F2/AM10-F2阻断重组PD-L1和PD-1结合活性。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1.抗NKG2A特异性抗体Z270抗体的表达分析
将NKG2A(genebank：AF461812.1，157aa-233aa)和CD94(genebank：AB009597.1，4aa-148aa)的编码基因通过GGSGGS编码基因连接，合成NKG2A-CD94的编码基因(SEQ IDNO.1)，并进一步通过酶切方法分别克隆入N端带有mFc标签的真核瞬时表达载体中，并转入大肠杆菌扩增，分离获得mFc-NKG2A-CD94表达质粒，并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得mFc-NKG2A-CD94重组蛋白纯品。
从WO2012/172102A1/CN103635487 B专利获得抗体hum270的轻重链氨基酸序列，进一步将重链氨基酸进Q1E的突变后，将优化的轻链可变区hum270 VL(SEQ ID NO.3)和重链可变区hum270 VH(SEQ ID NO.5)进行全基因合成，将hum270VH通过酶切克隆入真核表达载体pKN034的人IgG4的重链恒定区(SEQ ID NO.9)编码基因的上游，将hum270VL通过酶切克隆入真核表达载体pKN019的人轻链Ck(SEQ ID NO.7)的编码基因的上游，构建hum270轻、重链表达载体，并转入大肠杆菌扩增，分离获得hum270轻、重链表达质粒hum270-L、hum270-H，并通过HEK293细胞进行瞬时表达，利用MabSelect亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得重组hum270抗体的重组蛋白纯品。
应用Fortebio蛋白相互作用系统测定hum270重组抗体与mFc-NKG2A-CD94重组抗原结合的亲和力。主要步骤如下：
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体与双价抗原mFc-NKG2A-CD94的结合。测定时将hum270重组抗体(4ug/mL)，流经AHC探针(Cat:18-5060，PALL)表面，时间为240s。mFc-NKG2A-CD94作为流动相，浓度为60nM、30nM、7.5nM、5nM。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。结果显示hum270与人NKG2A-CD94重组蛋白的反应曲线如图1所示，拟合曲线并计算亲和力，hum270亲和力(KD)为4.08E-10M，kon为4.81E+05 1/Ms，kdis为1.96E-041/s。
实施例2.抗NKG2a抗体hum270的亲和力成熟
采用酵母展示技术，对抗NKG2a抗体hum270重链可变区和轻链可变区的6个CDR区氨基酸进行随机突变建库，从中筛选出亲和力更高的候选抗体分子。
1、突变抗体库设计和构建
人源化抗体hum270被选作亲和力成熟改造的模板，将其重链可变区和轻链可变区通过GS linker连接构建成单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)。该单链抗体的CDR区是亲和力成熟改造的目标，而骨架区在亲和力成熟改造中将保持不变，轻重链共6个CDR区部分氨基酸(表1)进行突变设计，分别构建突变库。
表1.进行突变设计的氨基酸序列
设计合成了CDR区突变引物，每个突变位置只引入30％的核苷酸突变，在引物两侧有约20个碱基对的未突变碱基(如图2所示)。通过突变引物与其他常规引物的两步PCR，将突变整合到最终的单链抗体基因中。单链抗体基因在5’末端有148bp的突出端，在3’末端有222bp的突出端，与载体上的序列相同，即所谓的同源区域。将抗体片段和线性化载体基因通过电穿孔法共同转化酵母菌株EBY100，利用酵母自身的同源重组机制实现将单链抗体基因与展示载体的体内重组，从而构建突变体酵母展示库。库容量如表2所示。
表2.各突变体库库容量统计
*CDR-H3氨基酸较多，因此构建成两个单独的抗体库
2、亲和力成熟抗体库的流式分选与鉴定
将上述表2中的抗体库分类合并成3个组合抗体库，第一个组合抗体库是重链库，包括H1～H4；第二个组合抗体库是轻链库，包括L1～L3，第三个是全序列抗体库，即EP。
将这3个组合后的抗体库进行流式分选，每一轮分选都用10nM的抗原室温下结合30分钟，洗去未结合抗原，加入终浓度为1uM的hz270 IgG进行竞争筛选，室温下震荡孵育后进行流式分析和分选。每一轮的FACS分选收集文库的的克隆进行培养，再进行下一轮的分选，最后经过总共4-5轮分选，分离得到亲和力改善的突变体克隆。各轻重链突变体的CDR区氨基酸序列如表3和表4所示。
表3.重链突变体CDRs序列
HCDR1
HCDR2
HCDR3
H0
GYTFTNYWMN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDFDVGTLYWFFDV
H1
SYDFSWYWIN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDFDVGTLYWFFDV
H2
GYTFTNYWLN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDFDVGTLYWFFDV
H3
GYTFDSYWMN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDFDVGTLYWFFDV
H4
SYDFSWYWIN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDWDVGTLYWFFDV
H5
SYDFSWYWIN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDFDVGTLYWFPDI
H6
SYDFSWYWIN
RIDPYDSETHYAQKLQGR
GGYDWDVGTLYWFPDI
表4.轻链突变体CDRs序列
LCDR1
LCDR2
LCDR3
K0
RASENIYSYLA
NAKTLAE
QHHYGTPRT
K1
RASENIYSYLA
NSTALAK
QHHYGTPRT
K2
RASENIYSYLA
NAKTLAE
QQHYGTPRT
K3
RASENIYSYLA
NSTALAK
QQHYGKPRT
K4
RASENIYSYLA
NSTALAK
LQHYSKPRT
K5
RASENIYSYLA
NTTAFVE
QQHYGKPRT
K6
RASENIYSYLA
NTTAFVE
LQHYSKPRT
K7
RASENIYSYLA
NGTTSTD
QQHYGKPRT
K8
RASENIYSYLA
NGTTSTD
LQHYSKPRT
K9
RASENIYSYLA
NAKTLAE
QQHYGKPRT
270-KX
RASENIYSYLA
NAKTLAE
LQHYSKPRT
将突变体克隆的酵母菌接种在酵母培养基中，诱导相关单链抗体的表达。离心收集酵母细胞，用含1％BSA的PBS洗涤1次。重悬酵母细胞为密度为5000,000个/ml，于96U形孔板中每孔加入100ul细胞。加入100ul终浓度为10nM的抗原溶液，室温震荡孵育30分钟后，置于冰上10分钟。一方面洗涤后采用荧光通过FACS分析突变体结合的EC50值，结果如表5所示。
表5：酵母细胞表面展示突变体克隆的EC50值
另一方面采用竞争法评估突变体抗体的Koff改善情况。即，在洗涤后的酵母重悬液中加入终浓度为1uM的hz270-IgG，室温震荡放置，在不同的时间点(如10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟直至240分钟，分别记为t1～t8)分别取出20ul溶液，4℃条件下14000rpm离心1分钟离心收集细胞，用预冷的含1％BSA的PBS洗涤2-3次，离心收取沉淀备用，在最后一次取样后，加入100微升1：500稀释的荧光二抗，冰上孵育30分钟。同时设置未加入Hz270-IgG的T0对照。4℃条件下14000rpm离心1分钟离心收集细胞，用预冷的含1％BSA的PBS洗涤2-3次。用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值，绘制数据，并用GraphPadPRISM软件计算Koff值，获得Koff改善的突变体抗体如图3所示。
3、亲和力成熟抗体Fab的重组表达与亲和力分析
综合分析以上亲和力提高克隆的突变位点，将各个CDR区的相关突变位点组合起来。合成如图4所示的抗体可变区重链基因，将其构建到含人单克隆抗体Fab形式的重链基因的哺乳动物细胞表达载体中；合成如图4所示的轻链基因将其构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中。将构建好的亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，纯化得到亲和力成熟抗体Fab蛋白(图5)。
利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析亲和力成熟的抗体Fab与抗原mFC-huNKG2A/CD94的结合动力学参数。测定前先将AMC生物探针浸泡于PBS中10分钟；然后将该探针置于含100nM mFC-huNKG2A/CD94的PBS中300秒，进行捕获；进一步将探针与100nM抗体Fab进行结合反应，结合时间400秒；之后将探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白亲本响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果如表6所示，可以看到突变体亲和力均有不同程度提高。
表6.部分亲和力成熟抗体Fab的动力学参数分析
4、突变体Fab对细胞表面NKG2A的特异性结合活性分析
分别用编码人NKG2A(huNKGA)和人CD94(huCD94)的质粒共稳定转染Flp-in CHO细胞，利用anti-NKG2A和anti-CD94抗体进行表达鉴定，随后使用流式细胞仪分选，将双阳性细胞分选，构建NKG2A/CD94稳定表达细胞株，进一步对上述突变体进行FACS结合活性分析。
取相应数量的人NKG2A/CD94稳定细胞系，在底部透明的96孔细胞培养板将其以0.06×106个细胞/孔接种在100ul DMEM+10％FBS中，在37℃、5％CO2的条件下过夜。第二天早上，将培养板在水槽中倒扣以轻柔去除培养上清，然后以1xPBS柔和洗涤细胞1-2次，轻轻敲打以便干燥，收集细胞备用。
通过三倍稀释法，用DMEM+10％FBS将亲和力成熟抗体、模板抗体Fab以及阴性亲本抗体Fab配制成所需的浓度，立即加入到孔中(50ul/孔)，室温孵育30分钟。用预冷的含1％BSA的PBS洗涤1-2次，加入100微升1：500稀释的荧光二抗，冰上孵育30分钟。随后用预冷的含1％BSA的PBS洗涤2次，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值，绘制数据，并用GraphPad PRISM软件计算EC50值(表7)。结果提示，下述突变体亲和力较亲本抗体AM00均有不同程度的改善。
表7.突变体抗体Fab和细胞表面人NKG2A/CD94结合的EC50值
Fab
KD[nM]
R square
KD/KD-AM00
Fab
KD[nM]
R square
KD/KD-AM00
AM00
188.80
0.994
1.0
AM00
188.8
0.994
1.0
AM10
1.4310
0.946
131.9
AM11
1.127
0.946
167.5
AM20
130.90
0.989
1.4
AM12
0.339
0.941
556.6
AM30
56.610
0.995
3.3
AM13
0.636
0.949
297.1
AM14
0.466
0.843
405.2
AM01
117.50
0.991
1.6
AM02
28.960
0.995
6.5
AM15
0.768
0.970
246.0
AM16
0.597
0.943
316.2
AM17
0.741
0.963
254.9
AM18
0.614
0.947
307.7
实施例3.抗NKG2a和PD-L1双特异性抗体的表达与亲和力分析
1、双特异抗体构建和亲和力分析
通过PCR的方法，将编码抗PD-L1的阻断型人源化纳米抗体F2的核苷酸序列N端经由连接肽连入hum270抗体重链核苷酸序列的C端，获得含hum270抗体重链-F2的编码序列hum270-H-F2，将hum270抗体重链-F2的编码序列(hum270-H-F2)和hum270抗体轻链编码序列hum270-L，通过酶切方法分别克隆入真核瞬时表达载体中，将获得的表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得hum270-H-F2和hum270-L表达质粒，并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得抗NKG2A和抗PD-L1双特异性抗体hum270-F2重组蛋白。并进一步在此基础上对hum270的轻、重链进行实施例2中获得的氨基酸突变，构建相应突变体抗体的双特异抗体，如AM10-F2、AM30-F2、AM12-F2。
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法分别测定抗体对NKG2A和PD-L1的亲和力。测定时将双特异性抗体hum270-F2、AM10-F2、AM30-F2用PBS缓冲液稀释至4ug/mL，流经AHC探针(Cat：18-5060，PALL)表面，时间为240s。分别以人PD-L1-His重组蛋白，浓度为60nM、30nM、15nM、7.5nM和人mFc-NKG2A-CD94重组蛋白作为流动相，浓度为60nM、30nM、7.5nM、5nM。结合时间为300s，解离时间为300s。同时，分别对hum270和F2-Fc单抗进行同样的亲和力检测。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。结果如表8所示。与单抗相比，双特异性抗体的亲和力未发生明显变化。
表8.hum270-F2双特异抗体的亲和力测定结果
2、双特异抗体对细胞表面NKG2A和PD-L1结合活性分析
分别利用NK92细胞和MBA-MD-231细胞，评估双特异抗体与细胞表面NKG2A和PD-L1结合情况。
具体地，将天然细胞NK92悬液与标记AF488的双抗hum270-F2、AM10-F2及对照抗体NC-IgG4(Mix-n-Stain CF 488A Antibody Labeling Kit：Cat.MX488AS100-1KT，sigma)在4℃孵育40min，细胞浓度为：1×105cells/样品，抗体终浓度：55nM起始3倍连续稀释8个梯度。以冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞3次后上机检测。PBST洗涤细胞3次后通过流式细胞仪(型号B49007AD，SNAW31211，BECKMAN COULTER)检测细胞的平均荧光强度(MFI)，以检测人源化抗体与天然细胞NK92的结合能力。结果如图10所示，双特异抗体均能与NK92细胞表面的NKG2A抗体特异性结合。AM10-F2的结合活性强于亲本抗体hum270-F2。
另一方面，将MDA-MB-231细胞悬液与抗体梯度稀释的检测抗体hum270-F2、AM10-F2和阴性对照抗体NC-IgG4在4℃孵育60min，细胞浓度为：1×105cells/样品，抗体终浓度为10nM起始，3倍连续稀释10个梯度。以冰冷PBST(0.05％吐温)洗涤细胞3次后，加入1:100稀释的羊抗人IgG-FITC(Cat.:F9512，Sigma)并在4℃孵育30min。PBST洗涤细胞3次后通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度(MFI)，以检测人源化抗体与MDA-MB-231细胞表面的人PD-L1结合能力。结果如图11所示，双特异性抗体均保持了与细胞表面PD-L1结合活性。
3、双特异抗体对PD-1和PD-L1结合的阻断活性分析
将人PD-1-hFc重组蛋白(序列号：NP_005009.2，21aa-167aa，C端human Fc标签)4℃包被过夜，包被浓度1μg/mL；PBS洗板3次后，加入5％BSA的PBS，37℃封闭120min，PBST洗板3次；加入不同稀释倍数的hum270-F2、AM10-F2及hzF2(起始浓度为50nM，3倍梯度依次稀释12个浓度)与3nM的PD-L1-ECD-mFc(序列号：NP_054862.1，1aa-239aa，C端mFc标签)共孵育，每个浓度设置平行孔，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse Fc(Cat：115-035-071，Jackson Immuno Research)，37℃孵育30min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
实验结果(图12)表明，hum270-F2、AM10-F2及hzF2均能阻断PD-1与PD-L1的结合，其半数有效抑制浓度(IC50)值分别为2.86nM、2.90nM、2.45nM。
实施例4：抗NKG2a和PD-1/PD-L1双通路联合抗肿瘤作用研究
采用PBMC免疫重建荷瘤小鼠模型观察NKG2a通路和PD1/PD-L1通路的协同抗肿瘤药效。具体地，将小鼠黑色素瘤细胞A375接种于雄性NCG小鼠右侧前胁肋部皮下，在肿瘤生长至40-80mm3左右时分组给药，组别及方案设计如下表所示。每周测量肿瘤体积。实验结束时从所有小鼠眼眶静脉丛取血，FACS检测外周血中人CD45阳性细胞比例；荷瘤鼠安乐死后剥离肿瘤称重、拍照。计算治疗组与对照组相对肿瘤体积比值(T/C)和肿瘤生长抑制率(1-T/C)并进行统计学分析。同时，实验结束时检测对照组小鼠肿瘤浸润性CD8阳性T细胞上NKG2A及PD-1的表达情况。
表7.PBMC免疫重建荷瘤小鼠模型药效试验组别和给药方案
#MW11，抗PD-1单抗，参见第201910022548.9号发明专利申请
*F2-hFc，人源化抗PD-L1纳米抗体，参见第202010324761.8号发明专利申请
实验结果表明(图6和图7)，单独靶向PD-1、PD-L1或NKG2A的抗体仅表现出轻微的抗肿瘤作用，而当靶向NKG2A和PD-1的抗体联用时则表现出明显的抗肿瘤药效；同样，等剂量下的抗NKG2A和PD-L1的双特异抗体也具有良好的抗肿瘤药效。提示NKG2A通路和PD-1/PD-L1通路具有协同抗肿瘤作用。
进一步利用FACS分析对照组肿瘤微环境中的T细胞上NKG2A和PD-1的共表达情况析，结果如表8所示。小鼠外周血细胞人源化比例大多达到30％以上。肿瘤微环境中检测到huPD-L1的表达，以及CD8+T细胞、CD8和PD-1双阳性、CD8和NKG2A(hum270)阳性以及PD-1和NKG2A双阳性的细胞的存在，提示了两通路联合作用的分子机制。
表8：PBMC人源化小鼠肿瘤微环境中PD-1和NKG2A的表达情况分析
实施例5：抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体抗肿瘤量效观察
利用实施例4药效模型对hum270-F2的抗肿瘤药效进行量效关系观察，调整实验设计如下：共4组，每组8只，分别为：huIgG(20mg/kg，ip，biw x 6)组、hum270-F2高剂量(20mg/kg，ip，biw x 6)组、hum270-F2中剂量(10mg/kg，ip，biw x 6)组、hum270-F2低剂量(4mg/kg，ip，biw x 6)组。其他方案设计同实施例4。
抗hum270-F2的抗肿瘤药效如图8和表9所示。hum270-F2在10mg和20mg/mL的给药剂量下明显抑制肿瘤的生长，终点抑瘤率约在40％(P<0.05)。
表9.受试物对人源黑色素瘤A375小鼠移植瘤模型的抑瘤作用(肿瘤体积)
实施例6：不同NKG2A突变体双特异抗体的体内药效比较
利用实施例4药效模型对hum270-F2和突变体AM10-F2的抗肿瘤药效进行比较观察，调整实验设计如下：共5组，每组8只，分别为：huIgG(10mg/kg，ip，biw x 6)组、hum270-F2高剂量(10mg/kg，ip，biw x 6)组、hum270-F2低剂量(5mg/kg，ip，biw x 6)组、AM10-F2高剂量(10mg/kg，ip，biw x 6)组和AM10-F2低剂量(5mg/kg，ip，biw x 6)。其他方案设计同实施例4。结果如图9所示。AM10-F2在高剂量下药效略好于270-F2。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司
<120> 一种靶向NKG2A和PD-L1的双特异性抗体及应用
<130> 无
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 867
<212> DNA
<213> NKG2A-CD94
<400> 1
cagaggcaca acaattcttc cctgaataca agaactcaga aagcacgtca ttgtggccat 60
tgtcctgagg agtggattac atattccaac agttgttact acattggtaa ggaaagaaga 120
acttgggaag agagtttgct ggcctgtact tcgaagaact ccagtctgct ttctatagat 180
aatgaagaag aaatgaaatt tctgtccatc atttcaccat cctcatggat tggtgtgttt 240
cgtaacagca gtcatcatcc atgggtgaca atgaatggtt tggctttcaa acatgagata 300
aaagactcag ataatgctga acttaactgt gcagtgctac aagtaaatcg acttaaatca 360
gcccagtgtg gatcttcaat aatatatcat tgtaagcata agctgggagg tagcggcggt 420
agcagatcct cttttactaa actgagtatt gagccagcat ttactccagg acccaacata 480
gaactccaga aagactctga ctgctgttct tgccaagaaa aatgggttgg gtaccggtgc 540
aactgttact tcatttccag tgaacagaaa acttggaacg aaagtcggca tctctgtgct 600
tctcagaaat ccagcctgct tcagcttcaa aacacagatg aactggattt tatgagctcc 660
agtcaacaat tttactggat tggactctct tacagtgagg agcacaccgc ctggttgtgg 720
gagaatggct ctgcactctc ccagtatcta tttccatcat ttgaaacttt taatacaaag 780
aactgcatag cgtataatcc aaatggaaat gctttagatg aatcctgtga agataaaaat 840
cgttatatct gtaagcaaca gctcatt 867
<210> 2
<211> 289
<212> PRT
<213> NKG2A-CD94
<400> 2
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg
1 5 10 15
His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys
20 25 30
Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala
35 40 45
Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu
50 55 60
Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe
65 70 75 80
Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe
85 90 95
Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val
100 105 110
Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile
115 120 125
Tyr His Cys Lys His Lys Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Ser Ser
130 135 140
Phe Thr Lys Leu Ser Ile Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile
145 150 155 160
Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu Lys Trp Val
165 170 175
Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln Lys Thr Trp
180 185 190
Asn Glu Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu Leu Gln
195 200 205
Leu Gln Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln Gln Phe
210 215 220
Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp Leu Trp
225 230 235 240
Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe Glu Thr
245 250 255
Phe Asn Thr Lys Asn Cys Ile Ala Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ala Leu
260 265 270
Asp Glu Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln Gln Leu
275 280 285
Ile
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> Hum270-LV
<400> 3
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaaaacct tagcagaagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacat cactatggta ctcctcggac gttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Hum270-LV
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 375
<212> DNA
<213> Hum270-HV
<400> 5
gaggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctactgga tgaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg attgatcctt acgatagtga aactcactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagggggc 300
tatgatttcg acgtaggaac tctctactgg ttcttcgatg tctggggcca agggacaacg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> Hum270-HV
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> Hum270-LC
<400> 7
actgtggcgg cgccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctggt 60
accgctagcg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Hum270-LC
<400> 8
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 981
<212> DNA
<213> Hum270-HC
<400> 9
gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 10
<211> 327
<212> PRT
<213> Hum270-HC
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 11
<211> 375
<212> DNA
<213> AM10-HV
<400> 11
gaggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttcttccta cgacttttcc tggtactgga tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg attgatcctt acgatagtga aactcactat 180
gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagggggc 300
tatgatttcg acgtaggaac tctctactgg ttcttcgatg tctggggcca agggacaacg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 12
<211> 125
<212> PRT
<213> AM10-HV
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Asp Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 125
<212> PRT
<213> AM30-HV
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Hum270-L
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> K2
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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