具体实施方式

本披露提供了LOX1-结合蛋白。在一些方面，本披露提供了作为抗-LOX1抗体的LOX1活性拮抗剂，抗-LOX1抗体是诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段以及其变体和衍生物。还提供了相关核酸、包含LOX1-结合蛋白的组合物以及制备LOX1-结合蛋白的方法。另外提供使用LOX1-结合蛋白例如以改善受试者中的LOX1-结合蛋白相关疾病或病状的方法以及诊断用途，这些疾病或病状诸如：动脉粥样硬化、血栓形成、冠状动脉疾病(CAD)、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫或癌症。

为了更容易地理解本披露，首先定义某些术语。附加的定义在整个详细说明中列出。

I.定义

如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个”(或“一种”)、连同术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/一种”在此可以互换地使用。

在此使用术语“约”以意指大约(approximately)、在......的附近(in theregion of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”与一个数值或范围结合使用时，它通过扩展列举的数值或范围的上限和下限将该数值或范围加以修饰。通常，本文使用术语“约”以将一个数值或范围以高于和低于该规定值或范围的10％的变化加以修饰。

此外，“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在词组如“A和/或B”中使用时，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，生物医学与分子生物学简明词典(ConciseDictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo、Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)第3版，1999，学术出版社(AcademicPress)；以及生物化学和分子生物学牛津词典(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)为技术人员提供在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。

单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外说明，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。在此提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。

当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由......组成”和/或“主要由......组成”描述的其他类似方面。

氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号抑或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。

术语“LOX1”和“凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1”在本文中可互换使用，且是指LOX1和/或LOX1的生物活性片段。cDNA和三种hLOX1同种型的氨基酸序列以GenBank登录号提供：NP_002534.1、NP_001166103.1和NP_001166104.1，各自通过引用以其全部内容并入本文。

术语“抑制(inhibit)”、“阻断(block)”“减少(reduce)”和“压制(suppress)”在本文中可互换地使用，并且是指任何统计学显著的生物活性的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指LOX1生物活性大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的降低。因此，当术语“抑制”或“压制”用于描述例如对表达细胞表面LOX1的细胞(例如，内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和血小板)中且在LOX1配体(例如，oxLDL、CRP和AGE)存在下的LOX1-介导的信号转导途径时，这些术语是指LOX1-结合蛋白例如抗-LOX1抗体使细胞中的LOX1-介导诱导的信号转导降低统计学上显著的水平(例如，p值小于或等于0.05)的能力。在一些方面，LOX1-介导的信号转导途径是选自RhoA/Rac1、一氧化氮、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB的成员。在其他方面，被抑制或阻断的LOX1-介导的生物活性是程序性细胞死亡(即细胞凋亡)。在其他实施例中，被降低、抑制或阻断的LOX1-介导的生物活性是LOX1-介导的增加的半胱天冬酶8、半胱天冬酶9和/或降低的BAX活性。表达细胞表面LOX1的细胞可以是天然存在的细胞(例如，人类内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)、来自细胞系的细胞或通过将编码LOX1的核酸引入宿主细胞产生的重组细胞。

如在此可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。典型的抗体包括通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每个重链由一个重链可变区(在此缩写成VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入更保守的称为框架区(FW)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FW构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。本披露的示例性抗体包括典型的抗体，scFv及其组合，其中例如scFv与典型抗体的重链和/或轻链或聚合物的n-末端共价连接(例如，经由肽键或经由化学连接子)，或插入典型抗体的重链和/或轻链中。

术语“抗体”可以指通过免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合靶标(例如蛋白质，多肽，肽，碳水化合物，多核苷酸，脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其抗体片段。

术语“抗体”包括完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段)，单链式Fv(sc Fv)突变体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原酶识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要这些抗体展现希望的生物活性。抗体可以是基于其分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的一致性的以下免疫球蛋白的五个主要类别中的任何一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或轭合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。

术语“种系化(germlining)”意指抗体中特定位置处的氨基酸往回突变为在种系中发现的相同位置处的那些氨基酸。

术语“抗原-结合抗体片段”或“LOX1-结合抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的互补决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体(例如，ScFv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本披露另外提供了LOX1-结合抗体片段，其中该抗体片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、双体抗体或单链抗体分子。

“单克隆抗体”是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。

术语“人源化抗体”是指衍生自非人(例如鼠)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成包含最小的非人(例如鼠)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或仓鼠)的CDR的具有所希望特异性、亲和性和能力的残基替代(琼斯(Jones)等人，自然(Nature)，321：522-525(1986)；里希曼(Riechmann)等人，自然，332：323-327(1988)；费尔海恩(Verhoeyen)等人，科学(Science)，239：1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FW)残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。

人源化抗体可以通过在Fv构架区和/或置换的非人残基内替代的另外的残基的替代来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。

抗体的“可变区”指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或它们的组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(又称为高变区)连接的四个构架区(FW)组成。每个链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，与来自另一个链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种技术用于确定CDR：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即，卡巴特(Kabat)等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，(第5版，1991，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda Md.)))；和(2)一种基于抗原抗体复合物的晶体学研究的方法(奥拉卡尼(Al-lazikani)等人，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)273：927-948(1997))。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。

当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1.107和重链的残基1-113)时，通常使用卡巴特(卡巴特)编号系统(例如，卡巴特等人，免疫学目的的序列(Sequences ofImmunological Interest)，第5版，公共卫生服务(Public Health Service)，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达，马里兰州(1991)，将其通过引用并入本文)。在卡巴特中的氨基酸位置编号是指在卡巴特等人，免疫学目的的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)中用于抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FW或CDR的截短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)和在重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b和82c等)。

可以通过在抗体序列与“标准”卡巴特编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的卡巴特编号。相反，乔西亚(Chothia)是指结构环的位置(乔西亚和莱斯克(Lesk)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987))。乔西亚CDR-H1环的末端在利用卡巴特编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环端点在32，；如果只存在35A，那么环端点在33；如果35A和35B都存在，那么环端点在34)。AbM高变区代表卡巴特CDR和乔西亚结构环之间的折衷，并且被牛津分子(Oxford Molecular)AbM抗体建模软件使用。

IMGT(免疫遗传学)也提供一种用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见例如，勒夫兰克(Lefranc)、M.P.等人，发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)27：55-77(2003)，将该文献以引用的方式并入本文。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1是在位置26至35处，VH-CDR2是在位置51至57处，VH-CDR3是在位置93至102处，VL-CDR1是在位置27至32处，VL-CDR2是在位置50至52处，并且VL-CDR3是在位置89至97处。

如本说明书各处所使用，所述VH CDR序列对应经典卡巴特(Kabat)编号位置，即卡巴特VH-CDR1在位置31-35，VH-CDR2在位置50-65，且VH-CDR3在位置95-102。VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3还对应经典卡巴特编号位置，即分别为位置24-34、50-56和89-97。

术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体，其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于源自具有所需特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。

术语“TM”或“TM突变体”是指IgG1恒定区中的突变，该突变导致具有该突变的抗体的效应子功能(例如，ADCC)下降。TM突变体包含引入IgG1的重链的三个突变L234F/L235E/P331S的组合，这导致效应子无效人类IgG1(EU编号，卡巴特等人(1991)免疫学感兴趣的蛋白序列，美国公共卫生服务，国立卫生研究院，华盛顿D.C.)。

术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1 Fc中的突变，这导致结合至人类FcRn增加，且提高具有突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包含引入IgG1的重链的三个突变M252Y/S254T/T256E的组合(EU编号，卡巴特等人(1991)免疫学感兴趣的蛋白序列，美国公共卫生服务，国立卫生研究院，华盛顿D.C.)。参见美国专利号7,658,921，通过引用将其并入本文。与相同抗体的野生型相比，YTE突变体显示出增加了抗体的血清半衰期大约四倍(达尔阿夸(Dall′Acqua)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)281：23514-24(2006))。还参见美国专利号7,083,784，通过引用将其全文并入本文。

术语“LOX1-结合蛋白”、“抗-LOX1抗体”或“特异性地结合LOX1的抗体”是指能够以足够亲和力结合LOX1，使得抗体可用作靶向LOX1的治疗剂或诊断试剂的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体。抗-LOX1抗体结合至无关非LOX1蛋白的程度小于该抗体结合至LOX1的约10％，这是通过例如放射免疫测定(RIA)、(使用重组LOX1作为分析物并使用抗体作为配体，或反之亦然)、动能排斥测定或本领域中已知的其他结合测定测量。在某些方面，LOX1-结合蛋白是解离常数(KD)≤1nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤10pM或≤1pM，或者在一些情况下，KD为约150pM至约600pM或约400pM至约600pM的全长抗体或LOX1-结合抗体片段。在某些方面，LOX1-结合蛋白是解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤10pM、≤1pM或≤0.1pM，或者在一些情况下，KD为约150pM至约600pM的全长抗体或LOX1-结合抗体片段。

“拮抗剂”或“阻断性”LOX1-结合蛋白抑制或降低LOX1的生物活性。在一些方面，拮抗剂LOX1-结合蛋白抑制LOX1结合oxLDL、AGE和/或CRP的能力。在一些方面，LOX1-结合蛋白抑制LOX1结合oxHDL、HSP60、白细胞和/或活化血小板的能力。在某些方面，LOX1-结合蛋白基本上或完全抑制LOX1的生物活性。令人希望的是，LOX1生物活性降低了10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在特定方面，LOX1-结合蛋白是抗-LOX1抗体，诸如全长抗体或LOX1-结合抗体片段。在其他方面，抗-LOX1抗体抑制或降低LOX1的生物活性达10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。

“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(K_D)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可用于本公开的目的。

除非另有说明，“效力”通常表示为IC₅₀值，以nM或pM计。IC₅₀是抗体分子的半数抑制浓度。在功能测定中，IC₅₀是将生物响应降低其最大值的50％的浓度。在配体结合研究中，IC₅₀是减少受体结合达最大特异性结合水平的50％的浓度。IC₅₀可以通过本领域已知的手段来计算。

本文披露的LOX1-结合蛋白(例如，抗体，诸如，全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)与参考抗体相比的效力倍数提升可以是至少约2-倍、至少约4-倍、至少约6-倍、至少约8-倍、至少约10-倍、至少约20-倍、至少约30-倍、至少约40-倍、至少约50-倍、至少约60-倍、至少约70-倍、至少约80-倍、至少约90-倍、至少约100-倍、至少约110-倍、至少约120-倍、至少约130-倍、至少约140-倍、至少约150-倍、至少约160-倍、至少约170-倍或至少约180-倍或更多。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。针对靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体“武装”细胞毒性细胞并且绝对是这种杀伤所需要的。靶细胞的溶解是细胞外的，要求直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。可以预期的是，除抗体之外，包含Fc区(确切地是Fc融合蛋白)的、具有特异性地结合带有抗原的靶细胞能力的其他蛋白质将能够影响细胞介导的细胞毒性。为了简单起见，由Fc融合蛋白的活性产生的细胞介导的细胞毒性在此也称为ADCC活性。

“分离的”LOX1-结合蛋白(例如，LOX1抗体，包括抗原结合片段、变体和其衍生物)、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于未在自然界中发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽(例如，抗-LOX1抗体，包括全长抗体和LOX1-结合抗体片段)、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些方面中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜、体育动物、和动物园动物，包括例如人、非人类灵长类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。

术语“药物组合物”是指一种呈关于允许活性成分(例如，本文披露的LOX1结合蛋白)的生物活性有效的这种形式的制剂，以及不包含对于该组合物将给予的受试者而言具有不可接受毒性的额外组分的制剂。这样的组合物可以是经消毒的。

LOX1-结合蛋白如抗-LOX1抗体或另一种治疗剂的“有效量”或“药学上有效量”是足以实现明确说明的目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。本披露提供了治疗、预防或改善与LOX1和/或HDL-介导的信号传导减少相关的疾病和病状的治疗剂。这些疾病和病状包括例如，动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症。

当本文使用时，词语“标记”是指一种直接或间接轭合至抗体以便产生“标记的”抗体的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。

术语如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“改善(ameliorating)”或“改善(ameliorate)”是指(1)使得诊断的疾病或病状的治愈、减缓、减轻与之相关的病状、和/或停止其进展的治疗措施以及(2)防止和/或减缓所靶向的疾病或病状的发展的预防性或防止性措施。因此，需要治疗的那些包括已具有疾病或病状的那些；具有发展疾病或病状风险的那些；以及在他们中需要预防疾病或病状的那些。在某些方面，如果受试者示出例如与疾病或病状相关的症状的完全、部分或瞬时改善或消除，那么受试者根据本文提供的方法被成功“治疗”。此类疾病或病状包括例如，动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症。

如本文所用的“核酸”或“多核苷酸”可以包括一个或多个“多核苷酸”、“多核苷酸分子”或“多核苷酸序列”，且是指任何长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA(基因组或cDNA)和RNA。核酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。“核酸”或“多核苷酸”可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。前述说明适用于在此提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA(基因组或cDNA)。

术语“载体”意指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送一个或多个感兴趣的基因或序列并且在一些方面中，能够表达这些基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(诸如生产细胞)。

在此可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本披露的多肽是基于抗体的，因此在某些方面中，这些多肽可以作为单链或相关链出现。

在两个或更多个核酸或蛋白质的语境中，术语“相同”或序列百分比“一致性”是指两个或更多个在比较和比对(如有必要，引入缺口)以获得最大对应性(不考虑任何保守氨基酸取代作为序列一致性的一部分)时相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。百分比一致性可以利用序列比较软件或算法或者通过目测测量。本领域中已知有各种可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的算法和软件。

序列比对算法的一个这样的非限制性实例是卡林等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，87：2264-2268(1990)中所述的算法，如卡林(Karlin)等人，美国国家科学院院刊90：5873-5877(1993)中改进，并纳入NBLAST和XBLAST程序(阿尔丘尔(Altschul)等人，核酸研究，25：3389-3402(1991))。在某些方面，有缺口的BLAST可如阿尔丘尔等人，核酸研究25：3389-3402(1997)中所述使用，BLAST-2、WU-BLAST-2(阿尔丘尔等人，美学方法(Methods in Enzymology)266：460-480(1996))、ALIGN、ALIGN-2(基因泰克(Genentech)，南旧金山，加利福尼亚)或Megalign(DNASTAR)是其他可用于比对序列的可公开获得的软件程序。在某些方面，两个核苷酸序列间的百分比一致性是利用GCG软件包中的GAP程序测定(例如，利用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的缺口权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些替代性方面，GCG软件包中包含尼德曼(Needleman)和文施(Wunsch)的算法(分子生物学杂志(48)：444-453(1970))的GAP程序可用于测定两个氨基酸序列间的百分比一致性(例如，利用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重以及1、2、3、4、5的长度权重)。可替代地，在某些方面，核苷酸或氨基酸序列间的百分比一致性是利用迈尔斯(Myers)和米勒(Miller)的算法测定(CABIOS，4：11-17(1989))。例如，百分比一致性可利用ALIGN程序(2.0版本)以及利用具有残基表的PAM120和12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定。本领域的技术人员可确定合适参数以通过特定比对软件获得最大比对。在某些方面，使用比对软件的默认参数。

在某些方面，第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列的序列一致性百分比“X”的计算方法为100x(Y/Z)，其中Y是在比对第一和第二序列(通过目测或特定序列比对程序比对)时评分为相同匹配的氨基酸残基的数量，且Z是第二序列中的残基总数量。如果第一序列的长度长于第二序列，第一序列相对于第二序列的百分比一致性将高于第二序列相对于第一序列的百分比一致性。

“保守的氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对于酪氨酸的取代是保守取代。在某些方面，本披露的LOX1-结合蛋白的序列的保守取代不影响含有该取代的氨基酸序列的蛋白质结合至LOX1。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是熟知的(参见例如，布鲁梅尔(Brummell)等人，生物化学(Biochem.)32：1180-1187(1993)；小林(Kobayashi)等人，蛋白质工程(ProteinEng.)12(10)：879-884(1999)；和伯克斯(Burks)等人，美国国家科学院院刊94：412-417(1997))。

如本文使用的术语“表位”是指LOX1，例如，人类LOX1(hLOX1)或猴LOX1(例如M.食蟹猴)、能够结合至本披露的LOX1-结合蛋白(例如，抗体)的蛋白决定子。表位通常由如氨基酸或糖侧链分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。此类LOX1-结合蛋白可基于它们在标准抗原结合或活性测定中与包含例如SEQ ID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列或SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ IDNO：58的VL序列的抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性地抑制结合这些抗体)的能力被鉴定。

如果LOX1-结合蛋白(例如，抗体)结合至LOX1的程度是在一定程度上阻断参考分子结合LOX1，那么就说它与该参考分子“竞争”结合至LOX1。蛋白质竞争结合至LOX1的能力可通过本领域中已知的任何方法测定，例如，竞争ELISA测定。如本文使用的，可以说LOX1-结合蛋白竞争性地抑制参考分子结合至LOX1，例如，抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

II.LOX1-结合蛋白

本披露提供了特异性地结合LOX1的LOX1-结合蛋白。在一些方面，LOX1-结合蛋白是抗体(例如，全长LOX1-抗体、抗原-结合抗体片段以及其变体和衍生物)。在其他方面，该抗体是单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在某些方面，LOX1-抗体是全长抗体。

在一些方面，LOX1-抗体是LOX1-结合抗体片段。在一些方面，LOX1-结合抗体片段是：Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv片段、双体抗体或单链抗体分子。在其他方面，LOX1-抗体是Fd、单链Fv(scFv)、双硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab′)₃、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb²、(scFv)₂或scFv-Fc。

在其他方面，LOX1结合蛋白是包括VH和VL的抗体。在一些方面，LOX1结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)还包括重链恒定区或其片段。在一些方面，该抗体包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定区，该组由以下各项组成：(a)人类IgA恒定区、或其片段；(b)人类IgD恒定区、或其片段；(c)人类IgE恒定结构域、或其片段；(d)人类IgG1恒定区、或其片段；(e)人类IgG2恒定区、或其片段；(f)人类IgG3恒定区、或其片段；(g)人类IgG4恒定区、或其片段；和(h)人类IgM恒定区、或其片段。在其他方面，LOX1-结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)包含具有或经过突变具有降低的ADCC活性的重链免疫球蛋白恒定结构域。在特定方面，LOX1-结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)包含含有降低效应子功能的突变的IgG1重链恒定区。在一些方面，IgG1恒定区在位置234、235和331包含突变，其中位置编号是根据卡巴特中的EU索引。在其他方面，IgG1恒定区包含三联突变L234F/L235E/P331S(TM)，其中位置编号是根据如卡巴特中的EU索引，产生效应子无效人类IgG1。在一些方面，IgG1恒定区包含三联突变突变体YTE，如上文在定义部分披露的。在其他方面，LOX1-结合蛋白是含有IgG1恒定区的抗体，该IgG1恒定区包含三联突变TM和三联突变YTE。

在某些方面，重链恒定区或其片段，例如，人类IgG恒定区或其片段可相对于野生型IgG恒定结构域包括一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，修饰的IgG具有增加的半衰期。例如，IgG恒定结构域可含有在位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436上的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸位置编号是根据如卡巴特中所示的EU索引。在某些方面，IgG恒定结构域可含有以下中的一个或多个：卡巴特位置252上的氨基酸经酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或苏氨酸(T)取代，卡巴特位置254上的氨基酸经苏氨酸(T)取代，卡巴特位置256上的氨基酸经丝氨酸(S)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或苏氨酸(T)取代，卡巴特位置257上的氨基酸经亮氨酸(L)取代，卡巴特位置309上的氨基酸经脯氨酸(P)取代，卡巴特位置311上的氨基酸经丝氨酸(S)取代，卡巴特位置428上的氨基酸经苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)或丝氨酸(S)取代，卡巴特位置433上的氨基酸经精氨酸(R)、丝氨酸(S)、Iso亮氨酸(I)、脯氨酸(P)或谷氨酰胺(Q)取代，或卡巴特位置434上的氨基酸经色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)或酪氨酸取代。更具体地，IgG恒定结构域可相对于野生型人类IgG恒定结构域含有氨基酸取代，包括卡巴特位置252上的氨基酸经酪氨酸(Y)取代，卡巴特位置254上的氨基酸经苏氨酸(T)取代，和卡巴特位置256上的氨基酸经谷氨酸(E)取代。

在其他方面，LOX1-结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)包含选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：(a)人类Igκ恒定结构域；和(b)人类Igλ恒定结构域。在其他方面，LOX1-结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)包含含有三联突变L234F/L235E/P331S，得到效应子无效人IgG1的人重链IgG1恒定结构域(“IgG-TM”)，以及人轻链λ恒定结构域。

本披露提供了包含VH和/或VL的分离的LOX1-结合蛋白，该VH和/或VL与本文披露的参考VH或VL相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些方面，LOX1-结合蛋白具有如表1中所示的VH和/或VL。

表1中提供了示例性LOX-1结合蛋白。

表1：示例性LOX-1结合蛋白

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含与SEQ ID NO：4的参考VH序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的VH序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了包含SEQ ID NO：4的VH的分离的LOX1-结合蛋白。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含与SEQ ID NO：33的参考VL序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的VL序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了包含SEQ ID NO：33的VL的分离的LOX1-结合蛋白。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，LOX1-结合蛋白包含VH，该VH选自含有具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的VH-CDR1、具有SEQ ID NO：2、5-12或13的氨基酸序列的VH-CDR2和具有SEQ ID NO：3、14-17或18的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；和轻链VL，该轻链VL选自含有具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL-CDR1、具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL-CDR2和具有SEQ ID NO：32、34或35的氨基酸序列的VL-CDR3的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

本披露还提供了包含VH和VL序列的分离的LOX1-结合蛋白，VH和VL序列与本文披露的参考VH和VL LOX1-结合蛋白相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白具有包含SEQ ID NO：4、19-28或29的VH以及包含SEQ ID NO：33、36或37的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3和轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中该CDR组与CDR参考组相同，或与该CDR参考组相比总共具有18个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)VH-CDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；(b)VH-CDR2具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；(c)VH-CDR3具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列；(d)VL-CDR1具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列；(e)VL-CDR2具有SEQ IDNO：31的氨基酸序列；且(f)VL-CDR3具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一组CDR：VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：(a)VH-CDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；(b)VH-CDR2具有SEQID NO：2的氨基酸序列；(c)VH-CDR3具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列；(d)VL-CDR1具有SEQID NO：30的氨基酸序列；(e)VL-CDR2具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列；且(f)VL-CDR3具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

本披露还提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含与本文披露的参考VH序列具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的重链可变区(VH)和/或与本文披露的参考VL序列具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的轻链可变区(VL)(例如，表1、图4或图5中披露的VH和VL序列)。在其他方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含与SEQ ID NO：4具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的VH和/或与SEQ ID NO：33具有至少90％、95％、97％、98或99％序列一致性的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，LOX1-结合蛋白包含与选自下组的VH具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的重链可变区(VH)和与选自下组的VL具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的轻链可变区(VL)，该组由以下各项组成：(a)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(b)具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(c)具有SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VL；和(d)具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH和具有SEQID NO：70的氨基酸序列的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，LOX1-结合蛋白包含与选自下组的VH具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的VH和与选自下组的VL具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的VL，该组由以下各项组成：(a)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(b)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(c)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(d)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(e)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(f)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(g)具有SEQ IDNO：25的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(h)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL；(i)具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VL；(j)具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VL；(k)具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL；(1)具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VH和具有SEQID NO：66的氨基酸序列的VL；(m)具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VL；(n)具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VL；(o)具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VL；(p)具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VL；(q)具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VL；(r)具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VL；和(s)具有SEQID NO：41的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：5-12或13的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：3、14-17或18的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：3、14-17或18的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：2、5-12或13的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：3、14-17或18的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：2、5-12或13的氨基酸序列的VH-CDR2以及具有SEQID NO：1的氨基酸序列的VH-CDR1。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VLH-CDR3。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL-CDR3以及具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL-CDR3、具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL-CDR2以及具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL-CDR1。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQID NO：32、34或35的氨基酸序列的VL-CDR3以及具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：32、34或35的氨基酸序列的VL-CDR3、具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL-CDR2以及具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL-CDR1。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一个、两个或三个VH-CDR，诸如与SEQ ID NO：1相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR1，与SEQ ID NO：2、5-12或13相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR2，或者与SEQ ID NO：3、14-17或18相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR3。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一个、两个或三个VL-CDR，诸如与SEQ ID NO：30相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VL-CDR1，与SEQ IDNO：31相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VL-CDR2，或者与SEQ IDNO：32、34或35相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR3。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含与SEQ ID NO：41的参考VH序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的VH序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了包含SEQ ID NO：41的VH的分离的LOX1-结合蛋白。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含与SEQ ID NO：58的参考VL序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的VL序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了包含SEQ ID NO：58的VL的分离的LOX1-结合蛋白。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，LOX1-结合蛋白包含VH，该VH选自含有具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VH-CDR1、具有SEQ ID NO：39、42或43的氨基酸序列的VH-CDR2和具有SEQ ID NO：40、44-46或47的氨基酸序列的VH-CDR3的VH；和轻链VL，该轻链可变区选自含有具有SEQ IDNO：55或59的氨基酸序列的VL-CDR1、具有SEQ ID NO：56或60的氨基酸序列的VL-CDR2和具有SEQ ID NO：57、61-63或64的氨基酸序列的VL-CDR3。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白具有包含SEQ ID NO：41、48-53或54的序列的VH以及包含SEQ ID NO：58、65-69或70的序列的VL。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3和轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3，其中该CDR组与CDR参考组相同，或与该CDR参考组相比总共具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)VH-CDR1具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列；(b)VH-CDR2具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列；(c)VH-CDR3具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列；(d)VL-CDR1具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列；(e)VL-CDR2具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列；且(f)VL-CDR3具有SEQ ID NO：61的氨基酸序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3和轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3，其中该CDR组与CDR参考组相同，或与该CDR参考组相比总共具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)VH-CDR1具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列；(b)VH-CDR2具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列；(c)VH-CDR3具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列；(d)VL-CDR1具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列；(e)VL-CDR2具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列；且(f)VL-CDR3具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一组CDR：VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：(a)VH-CDR1具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列；(b)VH-CDR2具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列；(c)VH-CDR3具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列；(d)VL-CDR1具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列；(e)VL-CDR2具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列；且(f)VL-CDR3具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH-CDR3。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：42或43的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：40、44-46或47的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：40、44-46或47的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：39、42或43的氨基酸序列的VH-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：40、44-46或47的氨基酸序列的VH-CDR3以及具有SEQ ID NO：39、42或43的氨基酸序列的VH-CDR2以及具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VH-CDR1。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，其包含具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VLH-CDR3。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VL-CDR3以及具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VL-CDR2。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VL-CDR3、具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VL-CDR2以及具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VL-CDR3。在其他方面，LOX1-结合蛋白包含具有SEQID NO：57的氨基酸序列的VL-CDR3、具有SEQ ID NO：56或60的氨基酸序列的VL-CDR2以及具有SEQ ID NO：55或59的氨基酸序列的VL-CDR1。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一个、两个或三个VH-CDR，诸如与SEQ ID NO：38相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR1，与SEQ IDNO：39，42或43相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR2，或者与SEQ ID NO：40、44-46或47相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR3。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，LOX1-结合蛋白包含一个、两个或三个VL-CDR，诸如与SEQ ID NO：55或59相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VL-CDR1，与SEQID NO：56或60相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VL-CDR2，或者与SEQ ID NO：57、61-63或64相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的VH-CDR3。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，LOX1-结合蛋白包含一组CDR：如表1、图4或图5中所述的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR3和VL-CDR3。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些其他方面，LOX1-结合蛋白包含如表1、图4或图5中所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列G F D P E D HX₁ HX₂HX₃ HX₄ HX₅ HX₆ Q K F Q G(Gly Phe Asp Pro Glu Asp HX₁ HX₂ HX₃ HX₄ HX₅ HX₆ GlnLys Phe Gln Gly)的VH-CDR2，其中HX₁是Gly、Trp、Tyr或Phe；HX₂是Glu、Thr、Gln、Ser、Lys或Ala；HX₃是Thr、Tyr、Ile或Asn；HX₄是Ile、Ala、Arg或His；HX₅是Tyr、Val、Thr、Leu或Gln，且HX₆是Ala、Asp、Gly、Ser或His(SEQ ID NO：71)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列HX₇ HX₈ G HX₉ HX₁₀ HX₁₁HX₁₂ G V R G W D Y Y Y G M D V(HX₇ HX₈ Gly HX₉ HX₁₀ HX₁₁ HX₁₂ Gly Val Arg Gly TrpAsp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp)的VH-CDR3，其中HX₇是Pro、Ser或Val；HX₈是Asn、Thr、Trp或Asp；HX₉是Gln、Arg或Thr；HX₁₀是Gln或His；HX₁₁是Gly或Gln；HX₁₂是Lys或Gly(SEQID NO：72)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列Q S Y D S LX₁ LX₂ LX₃LX₄ LX₅ LX₆(Gln Ser Tyr Asp Ser LX₁ LX₂ LX₃ LX₄ LX₅ LX₆)的VL-CDR3，其中LX₁是Ser或Met；LX₂是Leu、Tyr或His；LX₃是Ser或Arg；LX4是Gly、Ala或无氨基酸；LX₅是Trp或Phe；且LX₆是Val、G1y或Ala(SEQ ID NO：73)。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3和轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：(a)VH-CDR1包含氨基酸序列：EL S M H(SEQ ID NO：1)；(b)VH-CDR2包含氨基酸序列：G F D P E D HX₁HX₂ HX₃ HX₄ HX₅ HX₆ Q K F Q G，其中HX1选自下组，该组由以下各项组成：G、W、Y和F，HX2选自下组，该组由以下各项组成：E、T、Q、K、A和S，HX3选自下组，该组由以下各项组成：T、Y、I和N，HX4选自下组，该组由以下各项组成：I、A、R和H，HX5选自下组，该组由以下各项组成：Y、V、T、L和Q，且HX6选自下组，该组由以下各项组成：A、D、G、S和H(SEQ ID NO：71)；(c)VH-CDR3包含氨基酸序列：HX₇HX₈ G HX₉ HX₁₀HX₁₁ HX₁₂ G V R G W D Y Y Y G M D V，其中HX7选自下组，该组由以下各项组成：P、S和V，HX8选自下组，该组由以下各项组成：N、W、D和T，HX9选自下组，该组由以下各项组成：Q、R和T，HX10选自下组，该组由以下各项组成：Q和H，HX11选自下组，该组由以下各项组成：G和Q，且HX12选自下组，该组由以下各项组成：K和G(SEQ IDNO：72)；(d)VL-CDR1包含氨基酸序列：T G S S S N I G A G Y D V H(SEQ ID NO：30)；(e)VL-CDR2包含氨基酸序列：G N S N R P S (SEQ ID NO：31)；且(f)VL-CDR3包含氨基酸序列：Q S Y D S LX₁ LX₂ LX₃ LX₄ LX₅ LX₆，其中LX1选自下组，该组由以下各项组成M和S，LX2选自下组，该组由以下各项组成：L、Y和H，LX3选自下组，该组由以下各项组成：S和R，LX4选自下组，该组由以下各项组成：A和G或被省略(无氨基酸)，LX5选自下组，该组由以下各项组成：W和F，且LX6选自下组，该组由以下各项组成：V、G和A(SEQ ID NO：73)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列G HX₁ S HX₂ HX₃ HX₄ HX₅HX₆ HX₇ HX₈ HX₉ HX₁₀ D S V K G(Gly HX₁ Ser HX₂ HX₃ HX₄ HX₅ HX₆ HX₇ HX₈ HX₉ HX₁₀ AspSer Val Lys Gly)的VH-CDR2，其中HX₁是Ile或Val；HX₂是Trp或Leu；HX₃是Asn或Gln；HX4是Ser或Glu；HX₅是Gly、Leu或Pro；HX₆是Ser、Tyr或Asp；HX₇是Ile、Thr或Arg；HX₈是Gly或Tyr；HX₉是Tyr或Met；且HX₁₀是Ala或Asp(SEQ ID NO：74)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列E G HX₁₁ W N Y D AHX₁₂ D HX₁₃(Glu Gly HX₁₁ Trp Asn Tyr Asp Ala HX₁₂ Asp HX₁₃)的VH-CDR3，其中HX₁₁是Asn或Ser；HX₁₂是Phe或Leu；且HX₁₃是Ile或Val(SEQ ID NO：75)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列T G T S LX₁ D V G G YN Y V S(Thr Gly Thr Ser LX₁ Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser)的VL-CDR1，其中LX1是Ser或Asn(SEQ ID NO：76)。

在其他方面分离的LOX1-结合蛋白包含具有氨基酸序列D V S LX₂ R P S(AspVal Ser X4 Arg Pro Ser)的VL-CDR2，其中LX2是Asn或Lys(SEQ ID NO：77)。

在其他方面，分离的LOX1-结合蛋白包含据具有氨基酸序列LX₃ LX₄ LX₅ LX₆ LX₇LX₈ S T N W V(LX₃ LX₄ LX₅ LX₆ LX₇ LX₈ Ser ThT Asn Trp Val)的VL-CDR3，其中LX₃是Ser、Leu、Met或Ala；LX₄是Ser、Gly或Gln；LX₅是Tyr、Arg、Ser或Gly；LX₆是Thr或Met；LX₇是Ser、Trp、Gly或Val；且LX₈是Ser或Arg(SEQ ID NO：78)。

在一些方面，分离的LOX1-结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3和轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中：(a)VH-CDR1包含氨基酸序列：D Y A M H(SEQ ID NO：38)；(b)VH-CDR2包含氨基酸序列：G HX₁ S HX₂ HX₃HX₄ HX₅ HX₆ HX₇ HX₈ HX₉ HX₁₀ D S V K G，其中HX1选自下组，该组由以下各项组成：I和V，HX2选自下组，该组由以下各项组成：W和L，HX3选自下组，该组由以下各项组成：N和Q，HX4选自下组，该组由以下各项组成：S和E，HX5选自下组，该组由以下各项组成：G、L和P，HX6选自下组，该组由以下各项组成：S、Y和D，HX7选自下组，该组由以下各项组成：I、T和R，HX8选自下组，该组由以下各项组成：G和Y，HX9选自下组，该组由以下各项组成：M和Y，且HX10选自下组，该组由以下各项组成：A和D(SEQ ID NO：74)；(c)VH-CDR3包含氨基酸序列：E G HX₁₁ W NY D A HX₁₂ D HX₁₃，其中HX11选自下组，该组由以下各项组成：N和S，HX12选自下组，该组由以下各项组成：F和L，且HX13选自下组，该组由以下各项组成：I和V(SEQ ID NO：75)；(d)VL-CDR1包含氨基酸序列：T G T S LX₁ D V G G Y N Y V S，其中LX1选自下组，该组由以下各项组成：N和S(SEQ ID NO：76)；(e)VL-CDR2包含氨基酸序列：D V S LX₂ R P S，其中LX2选自下组，该组由以下各项组成：N和K(SEQ ID NO：77)；且(f)VL-CDR3包含氨基酸序列：LX₃LX₄ LX₅ LX₆ LX₇ LX₈ S T N W V，其中LX3选自下组，该组由以下各项组成：L、M、A和S，LX4选自下组，该组由以下各项组成：S、Q和G，LX5选自下组，该组由以下各项组成：Y、S、G和R，LX6选自下组，该组由以下各项组成：T和M，LX7选自下组，该组由以下各项组成：S、W、G和V，且LX8选自下组，该组由以下各项组成：S和R(SEQ ID NO：78)。

在一些方面，将本文披露的LOX1-结合蛋白的CDR组提供在抗体框架区域或本领域中已知的其他蛋白骨架。示例性抗体框架区域包括：种系框架区域，诸如重链的抗体框架区域的VH1-24(DP-5)、JH6、VH3-09(DP-31)和JH3以及轻链的抗体框架区域的Vλ1e(DPL-8)、Vλ2a2(DPL-11)和JL3和/或本领域的技术人员熟知的任何合适框架区域。

在一些方面，LOX1-结合蛋白含有一个或多个来自重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的框架区域，其是种系框架。重链结构域的框架区域可选自VH1-24(DP-5)、JH6、VH3-09(DP-31)、JH3框架和/或本领域中熟知的任何合适的框架区域或蛋白骨架。轻链的框架区域可选自Vλ1e(DPL-8)、Vλ2a2(DPL-11)和JL3框架和/或本领域中熟知的任何合适的框架区域或蛋白骨架。一个或多个CDR可取自本文披露的LOX1-结合蛋白(例如表1、图4或图5中所述的LOX1-结合蛋白)并掺入合适框架和/或蛋白骨架。

在其他方面，本披露提供了结合与分别包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33的VH和VL的抗体所结合表位相同的LOX1表位的分离的LOX1-结合蛋白。

在其他方面，本披露提供LOX1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长LOX1-抗体，LOX1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)，其与包含SEQ ID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列的抗体竞争或交叉竞争结合至LOX1。在一个特定方面，LOX1-结合蛋白能够竞争性地抑制包含SEQ ID NO：4的VH和SEQ ID NO：33的VL的抗体结合LOX1。

还提供了可以按照与包含SEQ ID NO：29的VH和SEQ ID NO：33的VL的LOX1-结合蛋白(例如LOX1抗体或其片段)相比更大的亲和力结合LOX1的LOX1-结合蛋白，诸如LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段以及其变体和衍生物)。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在其他方面，本披露提供了结合与分别包含SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：58的VH和VL的抗体所结合表位相同的LOX1表位的分离的LOX1-结合蛋白。

在其他方面，本披露提供LOX1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)，其与包含SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列的抗体竞争或交叉竞争结合至LOX1。在一个特定方面，LOX1-结合蛋白能够竞争性地抑制包含SEQ ID NO：41的VH和SEQ ID NO：58的VL的抗体结合LOX1。

还提供了可以按照与包含SEQ ID NO：54的VH和SEQ ID NO：70的VL的全长抗体相比更大的亲和力结合LOX1的LOX1-结合蛋白，诸如LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段以及其变体和衍生物)。本披露还提供了编码LOX1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用LOX1-结合蛋白的方法。

在一些方面，本文提供的抗-LOX1抗体是鼠类抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或它们的任何组合。在一些方面，抗-LOX1抗体是Fv片段、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、dsFv片段、scFv片段或sc(Fv)2片段。

本披露提供了可跨物种地结合至LOX1分子的LOX1-结合蛋白(例如，分离的抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。在一些方面，LOX1-结合蛋白结合至人类LOX1(hLOX1)和食蟹猴LOX1(cynoLOX1)。在其他方面，LOX1-结合蛋白结合至人类LOX1(hLOX1)和兔LOX1。在其他方面，LOX1-结合蛋白结合至hLOX1、cynoLOX1和兔LOX1。在本文提供的某些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体)特异性地结合至LOX1(例如，hLOX1、cynoLOX1和/或兔LOX1)，且不结合至以下中的一种或多种：CLEC-7A、CLEC-1A、CLEC-4L、℃LEC-1B、SR-A1和/或SR-B3。参见例如，图3、6和7。

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，分离的抗-LOX1抗体或其)还包含人类IgG1 TM突变体重链，其中重链可变区(VH)包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：4、19-28或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，分离的抗-LOX1抗体或其)还包含人类IgG1 TM突变体重链，其中重链可变区(VH)包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：41、48-53或54具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)包括除了除重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之外还任选地包括重链恒定区或其片段、轻链恒定区或其片段。在某些方面，轻链恒定区是κλ轻链恒定区，例如，人类κ恒定区或人类λ恒定区。在一个具体方面，轻链恒定区是人类κ恒定区。

在其他方面，LOX1-结合蛋白(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有含有人类κ恒定区的轻链可变区(VL)，例如，VL包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：33、36或37具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性的VL氨基酸序列。在某些方面，本披露提供了还包含人类IgG1 TM突变体重链和人类κ轻链的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别包含：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：41和SEQID NO：58；或SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：70。

在其他方面，LOX1-结合蛋白(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有还包含人类κ恒定区的轻链可变区(VL)，例如，轻链可包含与参考氨基酸序列SEQ ID NO：58、65-69或70具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性的轻链氨基酸序列。在某些方面，本披露提供了还包含人类IgG1 TM突变体重链和人类κ轻链的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别包含：SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：67或者SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：58。

在一些方面，本披露提供了分离的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其中LOX1-结合蛋白具有至少一个选自下组的性质，该组由以下各项组成：(a)减少或抑制oxLDL、C-反应蛋白(CRP)和/或晚期糖基化终产物(AGE)结合至LOX1，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定1、2和/或3或实例11)；(b)减少或抑制表达细胞表面LOX1的内皮细胞中的RhoA/Rac1、一氧化氮(NO)、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号传导，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例11)；(c)减少或抑制表达细胞表面LOX1的内皮细胞中的半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9和/或BAX活性，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定；(d)结合至具有单核苷酸多态性K167N的LOX1，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定1、2和/或3或实例11)；(e)减少或抑制oxLDL内化，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定4或实例11)；(f)减少或抑制oxLDL-诱导的LOX1信号传导，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定5或实例11)；(g)以约150pM至约600pM(例如约400pM)的解离常数(KD)结合至LOX1，如由BIACORE或KinExA测定的；(h)以约1x10⁵M^-1s^-1至约6x10⁶M^-1s^-1(例如约5x10⁵M^-1s^-1)的Kon率结合至LOX1，如由BIACORE测定的；和(i)以约1x10^-4s^-1至约3x10^-4s^-1(例如约2.3x10^-4s^-1)的Koff率结合至LOX1，如由BIACORE测定的。

在某些方面，通过本文所述的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)阻断LOX1生物活性减少动脉粥样硬化和/或减少与动脉粥样硬化相关的一个或多个病状。在特定方面，LOX1拮抗剂(例如抗-LOX1抗体或其片段)抑制或减少LOX1-介导发展动脉粥样硬化病灶、冠状动脉疾病、中风、局部缺血、梗塞、周围血管疾病、再灌注或与发展动脉粥样硬化相关的其他临床症状。

在某些方面，LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按小于10^-6M、或小于10^-7M、或小于10^-8M、或小于10^-9M、或小于10^-10M、或小于10^-11M、小于10^-12M、小于10^-13M，of小于10^-14M、或小于10^-15M的解离常数或K_D特异性地结合至LOX1，例如，人类LOX1(hLOX1)和/或食蟹猴LOX1(cynoLOX1)以及它们的抗原片段，这是通过例如或测量。在一个方面，抗-LOX1抗体可以按小于约1x10^-8M至约1x10^-10M的K_D结合至hLOX1和cynoLOX1，这是通过测量。

在另一个方面，LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按小于1×10^-3s^-1或小于2×10^-3s^-1的K_off结合至LOX1。在其他方面，LOX1-结合蛋白以小于10^-3s^-1、小于5×10^-3s^-1、小于10^-4s^-1、小于5×10^{- 4}s^-1、小于10^-5s^-1、小于5×10^-5s^-1、小于10-⁶s^-1、小于5×10^-6s^-1、小于小于5×10^-7s^-1、小于10^-8s^-1、小于5×10^-8s^-1、小于10^-9s^-1、小于5×10^-9s^-1或小于10^-10s^-1的K_off结合至LOX1，这是通过例如或测量。在一个方面，抗-LOX1抗体可以按1×10^-4至10×10^-4s^-1的K_off结合至hLOX1和cynLOX1，这是通过测量。

在另一个方面，LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按至少10⁵M^-1s^-1、至少5×10⁵M^-1s^-1、至少10⁶M^-1s^-1、至少5×10⁶M^-1s^-1、至少10⁷M^-1s^-1、至少5×10⁷M^-1s^-1或至少10⁸M^-1s^-1或至少10⁹M^-1s^-1的结合速率常数或K_on率结合至LOX1，例如，人类LOX1(h LOX1)和/或食蟹猴LOX1，这是通过例如或测量。在一个方面，抗-LOX1抗体可以按约1×10⁵M^-1s^-1至约20×10⁵M^-1s^-1的K_on率结合至hLOX1和cynLOX1，这是通过测量。

如上所述，含有VH和/或VL氨基酸序列且结合LOX1的LOX1-结合蛋白(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可与本文所列序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性(参见例如，表1、图4或图5)。在一些方面，结合LOX1的VH和/或VL氨基酸序列相对于本文所列序列包含15或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。在一些方面，结合LOX1的VH和/或VL氨基酸序列相对于本文所列序列包含8或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。在其他方面，结合LOX1的VH和/或VL氨基酸序列相对于本文所列序列包含5或更少(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。含有与VH区域或VL区域具有一定百分比相似性或具有一个或多个取代、缺失和/或插入(例如，保守取代)的VH和VL区域的LOX1-结合蛋白(例如抗-LOX1抗体或其片段)可通过编码本文所述的VH和/或VL区域的核酸分子的诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)获得，随后测试编码的改变的抗体对LOX1的结合，并任选地利用本文所述功能测定或本领域中已知可常规地修改以测试保留的功能的测定测试保留的功能。

LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)对LOX1的亲和力或亲合力可利用本领域中已知的任何合适方法实验测定，例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或动力学(例如，或分析)测定。可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。(参见例如，伯佐斯科(Berzofsky)等人，“抗体-抗原相互作用(Antibody-AntigenInteractions)”，在基础免疫学(Fundamental Immunology)，保罗(Paul)、W.E.编，拉文出版社(Raven Press)：纽约，N.Y.、(1984)；库比(Kuby)，免疫学(Immunology)，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)：纽约，N.Y.(1992)；和本文描述的方法)。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度)下测量，特定抗体-抗原相互作用的测量亲和力可以变化。因此，亲和力和其他LOX1-结合参数(例如，K_D或Kd、K_on、K_off)的测量是用LOX1-结合蛋白和LOX1的标准化溶液和标准化缓冲液(如本领域中已知的，诸如本文所述的缓冲液)进行。

本披露还提供了如本文所述的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1、图4或图5)，其中抗体与异源试剂轭合。在某些方面，该试剂是抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物反应调节剂、药物制剂、淋巴因子、异源抗体或抗体片段、可检测标记或聚乙二醇(PEG)。本文在其他地方更详细的论述了异源轭合物LOX1-结合蛋白。

在某些方面，LOX1-结合蛋白不是抗-LOX1抗体。本领域中已知各种鉴定和产生以高亲和力结合至蛋白质标靶的非-抗体多肽的方法。参见例如，斯科拉(Skerra)，生物技术的最新观点(Curr.Opin.Biotech.)18：295-304(2007)，霍斯(Hosse)等人，蛋白质科学(Protein Science)15：14-27(2006)，吉尔(Gill)等人，生物技术的最新观点17：653.658(2006)，尼格伦(Nygren)，欧洲生化联盟杂志(FEBS J.)275：2668-76(2008)，和斯科拉，欧洲生化联盟杂志275：2677-83(2008)，其中每一个通过引用以其全文结合在此。在某些方面，可使用噬菌体展示技术来鉴定/产生LOX1-结合蛋白。在某些方面，多肽包含一类选自下组的蛋白骨架，该组由以下各项组成：锚蛋白、蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。

结合与LOX1-结合蛋白所结合表位相同的表位的蛋白质

在某些方面，本披露提供了结合至于一种或多种本文披露的LOX1-结合蛋白所结合表位相同的表位的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1、图4或图5)。本文所用的术语“表位”是指能够结合本披露抗体的靶蛋白决定子。表位通常由如氨基酸或糖侧链分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。此类抗体可基于它们在标准抗原结合或活性测定中与包含SEQ ID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列的抗体和/或SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列的抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性地抑制结合这些抗体)的能力被鉴定。

本披露还提供了结合与本文披露的分离的LOX1-结合蛋白所结合表位相同的表位的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1、图4或图5)。

测试LOX1-结合蛋白抑制结合例如包含SEQ ID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列的抗体和/或包含SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列的抗体的能力证明该测试LOX1-结合蛋白可与该抗体竞争结合至LOX1；此种LOX1-结合蛋白可根据非限制性理论结合至与和之竞争的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)所结合表位相同或相关的LOX1上的(例如，结构上相似或空间上邻近的)表位。在一个方面，LOX1-结合蛋白结合至与包含SEQ ID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列的抗体所结合表位相同的LOX1上的表位。在另一个方面，LOX1-结合蛋白结合至与包含SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列的抗体所结合表位相同的LOX1上的表位。

在一个方面，本披露提供LOX1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其与包含SEQID NO：4的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列的抗体竞争结合至LOX1。在另一个方面，本披露提供LOX1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其与包含SEQ ID NO：41的VH序列和SEQ ID NO：58的VL序列的抗体竞争结合至LOX1。

IV.LOX1-结合蛋白的活性

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有至少一个选自下组的性质，该组由以下各项组成：(a)减少或抑制oxLDL、C-反应蛋白(CRP)和/或晚期糖基化终产物(AGE)结合至LOX1，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定1、2和/或3或实例11)；(b)减少或抑制表达细胞表面LOX1的内皮细胞中的RhoA/Rac1、一氧化氮(NO)、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号传导，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例11)；(c)减少或抑制表达细胞表面LOX1的内皮细胞中的半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9和/或BAX活性，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定；(d)结合至具有单核苷酸多态性K167N的LOX1，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定1、2和/或3或实例11)；(e)减少或抑制oxLDL内化，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定4或实例11)；(f)减少或抑制oxLDL-诱导的LOX1信号传导，如通过任何合适测定测定的，包括本文披露的测定(参见例如，实例10、测定5或实例11)；(g)以约150pM至约600pM(例如约400pM)的解离常数(KD)结合至LOX1，由BIACORE或KinExA测定；(h)以约1x10⁵M^-1s^-1至约6x10⁶M^-1s^-1(例如约5x10⁵M^-1s^-1)的Kon率结合至LOX1，如由BIACORE测定的；和(i)以约1x10^-4s^-1至约3x10^-4s^-1(例如约2.3x10^-4s^-1)的Koff率结合至LOX1，如由BIACORE测定的。

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可压制、抑制或减少表达LOX1的细胞中LOX1-介导的信号转导。在一些方面，LOX1-结合蛋白可压制、抑制或减少LOX1-介导激活RhoA/Rac1、一氧化氮、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号转导途径，这是利用例如如本文所述的基于细胞的测定测量，其中IC₅₀低于约500pM、低于约450pM、低于约450pM、低于约350pM、低于约300pM、低于约250pM、低于约150pM、低于约100pM、低于约75pM、低于约100nM、低于约75nM、低于约50nM、低于约30nM、低于约20pM、低于约10nM或低于约5nM。

在某些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可压制、抑制或减少表达LOX1的食蟹猴内皮细胞、平滑肌细胞和/或巨噬细胞中食蟹猴LOX1-介导激活RhoA/Rac1、一氧化氮、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号传导途径，其中IC₅₀为约700pM、约550pM、约500pM、约300pM、约250pM、约220pM、约100pM、约1pM、约0.1、约1nM、约10nM、约20nM、约30nM、约50nM或约100nM。在某些方面，LOX1-结合蛋白可压制、抑制或减少表达LOX1的食蟹猴内皮细胞、平滑肌细胞和/或巨噬细胞中食蟹猴LOX1-介导的激活，其中IC₅₀为约1nM至约500pM。

在其他方面，拮抗剂LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可压制、抑制或减少表达LOX1的内皮细胞、平滑肌细胞和/或巨噬细胞中人类LOX1-介导激活RhoA/Rac1、一氧化氮、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号转导途径，这是通过例如如本文描述的基于细胞的测定测量，其中IC₅₀为约300pM、约250pM、约100pM、约55pM、约44pM、约1pM、约0.1pM、约100nm、约50nm、约44nM、约10nM或约3nM。

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)抑制或减少LOX1结合至oxLDL。在一些方面，LOX1-结合蛋白抑制或减少LOX1结合至多种LOX1配体。在一些方面，LOX1-结合蛋白抑制或减少LOX1结合至oxLDL和AGE。在一些方面，LOX1-结合蛋白抑制或减少LOX1结合至oxLDL和CRP。在一些方面，LOX1-结合蛋白抑制或减少LOX1结合至oxLDL、AGE和CRP。在其他方面，LOX1-结合蛋白抑制或减少LOX1结合至oxLDL、CRP、磷脂酰丝氨酸、晚期AGE、小密度脂蛋白(sdLDL)、氧化HDL、N4-氧代壬酰基赖氨酸(ONL)、热休克蛋白(hsp，例如，HSP60)、肺炎衣原体、血小板、白细胞和/或凋亡细胞。测量LOX-1与一种或多种配体的结合的抑制或减少的方法包括本文在实例中描述的那些以及本领域中已知的任何合适方法。

V.制备抗-LOX1抗体

在某些方面，LOX1-结合蛋白是抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段以及其变体和衍生物。

单克隆抗-LOX1抗体可利用杂交瘤方法制备，诸如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，自然256：495(1975)所描述的那些。利用杂交瘤方法，小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物如上所述进行免疫，以引发淋巴细胞产生将特异性地结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴球，并利用例如聚乙二醇与合适骨髓瘤细胞系融合，以形成可随后从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后产生特异性针对LOX1如hLOX1的单克隆抗体的杂交瘤(这是通过免疫沉淀法、免疫印迹法或通过体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA)))可在体外培养物中利用标准方法(戈丁(Goding)，单克隆抗体：原理和实践，学术出版社，1986)或在体内作为动物的腹水肿瘤增殖。然后单克隆抗体可从培养基或腹水，如上文针对多克隆抗体所述进行纯化。

可替代地，抗-LOX1单克隆抗体还可以利用如美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法制造。编码单克隆抗体的多核苷酸是从成熟B细胞或杂交瘤细胞，诸如通过RT-PCR，利用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物分离，且它们的序列是利用常规程序测定。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到合适表达载体中，这些载体在转染进入不产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Per.C6细胞或骨髓瘤细胞(例如NS0细胞)中时，通过这些宿主细胞生产单克隆抗体。还有，重组抗-LOX1单克隆抗体可从表达如所述的期望物种的CDR的噬菌体展示文库分离(麦卡弗蒂(McCafferty)等人，自然348：552-554(1990)；克拉克森(Clackson)等人，自然352：624-628(1991)；和马克斯(Marks)等人，分子生物学杂志222：581-597(1991))。

编码抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物的核酸还可以许多不同方式，利用重组DNA技术进行修饰，以产生替代性抗体。在一些方面中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以便产生嵌合抗体或被(2)非免疫球蛋白多肽取代以便产生融合抗体。在一些方面中，截断或去除这些恒定区以便产生单克隆抗体的所希望的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等等。

在某些方面，抗-LOX1-结合蛋白结合人类LOX1，诸如全长抗-hLOX1抗体和hLOX1结合人抗体片段、以及它们的变体和衍生物。可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞(参见，例如，科尔(Cole)等人，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy)，艾伦R.丽思出版社(Alan R.Liss)，第77页(1985)；伯默(Boemer)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：86-95(1991)；以及美国专利号5,750,373)。

还有，抗-LOX1人抗体(例如，LOX1-结合人抗体片段)可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达如例如，沃恩(Vaughan)等人，自然生物技术(Nat.Biotech.)，14：309-314(1996)，希茨(Sheets)等人，美国国家科学院院刊95：6157-6162(1998)，胡根布姆(Hoogenboom)和温特(Winter)，分子生物学杂志227：381(1991)，和马克斯等人，分子生物学杂志222：581(1991))中所述的人抗体。用于生成和使用抗体噬菌体文库的技术还描述在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；和7,264,963；和罗思(Rothe)等人，分子生物学杂志376(4)：1182-200(2008)(其中每一个通过引用以其全文结合在此)。

亲和力成熟策略和链改组策略(马克斯等人，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)，其通过引用以其整体结合在此)在本领域中是已知的，且可用于产生高亲和力抗-LOX1人抗体。

在一些方面，LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域所已知的。人源化、表面重修或类似工程化抗体可以具有来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于，小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长动物或其他哺乳动物。这些非人类氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替代，这些残基典型地取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他适合的特征。一般来说，CDR残基直接且最实质性地参与影响LOX1结合。因此，保持部分或全部非人类或人类CDR序列，同时可变区和恒定区的非人类序列可以被人类或其他氨基酸替换。

抗-LOX1抗体还可以任选地人源化、表面重修、工程化或人抗体工程化，保留针对抗原LOX1的高亲和力以及其他有利生物性质。为实现这个目标，人源化(或人类)或工程化LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及它们的变体和衍生物如表面重修的抗体可任选地通过利用亲代、工程化和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念人源化和工程化产物制备。本领域的技术人员通常可获得并熟悉三维免疫球蛋白模型。可获得说明并展示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的的计算机程序。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原如LOX1的能力的残基。这样，可选择框架(FW)残基并与共有序列和输入序列组合，以实现期望的抗体特性，诸如增加的针对靶抗原的亲和力。

本披露的抗-LOX1抗体的人源化、表面重修或工程化可利用任何已知方法进行，包括但不限于描述在以下文献中的那些：琼斯(Jones)等人，自然321：522(1986)；理查曼(Riechmann)等人，自然332：323(1988)；沃尔霍因(Verhoeyen)等人，科学239：1534(1988))，西姆斯(Sims)等人，免疫学杂志151：2296(1993)；乔西亚和莱斯克，分子生物学杂志196：901(1987)，卡特(Carter)等人，美国国家科学院院刊89：4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志151：2623(1993)，美国专利号5,639,641，5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567，7,557,189；7,538,195；和7,342,110；国际申请号PCT/US98/16280；PCT/US 96/18978；PCT/US 91/09630；PCT/US 91/05939；PCT/US 94/01234；PCT/GB 89/01334；PCT/GB 9I/01134；PCT/GB92/01755；国际申请公开号WO 90/14443；WO 90/14424；WO 90/14430；和欧洲专利公开号EP229246；其中每一个通过引用完全结合在此，包括其中引用的参考文献。

拮抗剂人类抗-LOX1抗体也可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在没有内源性免疫球蛋白产生存在时产生全套人抗体。这种方法描述在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。

在某些方面，抗-LOX1抗体是LOX1-结合抗体片段.已知各种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解衍生(例如森本(Morimoto)等人，生物化学和生物物理方法杂志(J.Biochem.Biophys.Meth.)24：107-117(1993)；布伦南(Brennan)等人，科学229：81(1985))。在某些方面，LOX1-结合抗体片段是重组地产生。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以表达在大肠杆菌或其他宿主细胞中并且从其分泌，因而允许大量这些片段的生产。此类LOX1-结合抗体片段也可以从以上讨论的抗体噬菌体文库分离。LOX1-结合抗体片段也可以是如美国专利号5,641,870中所述的线性抗体。用于产生抗体片段的其他技术是本领域中已知的。

根据本披露，本领域中已知的技术可经改编以生产对LOX1具有特异性的单链抗体(参见例如，美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建Fab表达文库(参见例如，休斯(Huse)等人，科学246：1275-1281(1989))，以允许快速且有效地鉴定具有针对LOX1的期望特异性的单克隆Fab片段。抗-LOX1-结合抗体片段可通过本领域中已知的技术生产，包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段；(b)通过减少F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段，(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗-LOX1抗体产生的Fab片段，和(d)Fv片段。

在某些方面，LOX1-结合蛋白(例如，LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可经修饰以增加其血清半衰期。这可通过例如使LOX1-结合蛋白中的合适区域突变将补救受体结合表位并入LOX1-结合蛋白，或将表位并入随后融合在LOX1-结合蛋白的末端或中部的肽标记(例如，通过DNA或肽合成)或通过YTE突变来实现。本领域中已知其他增加LOX1-结合蛋白(例如，LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及它们的变体和衍生物)的血清半衰期的方法，例如，轭合至异源分子诸如PEG。

异源轭合物LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)也在本披露的范围内。异源轭合物LOX1-结合蛋白由两个共价结合的蛋白组成。此类蛋白已经例如被建议用于将免疫细胞靶向非期望的细胞(参见例如，美国专利号4,676,980)。预期，异源轭合物LOX1-结合蛋白可利用合成蛋白化学中的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些。例如，免疫毒素可利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建。适合此目的的试剂的实例包括亚胺硫醇和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。

如本文提供的修饰的抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及它们的变体和衍生物可包含提供抗体与LOX1的结合的任何类型的可变区。在这点上，可变区可包含或衍生自可诱导增加体液应答并生成针对LOX1抗原的免疫球蛋白的任何类型的哺乳动物。正因如此，抗-LOX1抗体的可变区可以是例如人类、鼠类、非人类灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴等)或羽扇豆来源。在一些方面，修饰的抗-LOX1抗体的可变区和恒定区是人类的。在其他方面，相容性抗体的可变区(通常源自非人类来源)可经工程化或专门定制来改善结合性质或减少分子的免疫原性。在这点上，根据本公开可使用的可变区可经人源化或通过纳入导入的氨基酸序列改变。

在某些方面，抗-LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的重链和轻链中的可变结构域通过至少部分替换一个或多个CDR和/或通过部分框架区域替换和序列改变而改变。虽然CDR可得自与框架区所得自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是设想CDR将得自不同类别的抗体并且在某些方面来自不同种类的抗体。不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以便将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，只需要转移维持抗原结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到美国专利号5,585,089、5,693,761以及5,693,762中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过逐次逼近试验(trial and error testing)来获得具有减少的免疫原性的功能抗体。

尽管对可变区进行改变，本领域的技术人员将知道，本披露的修饰的抗-LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)将包含这样的抗体，其中一个或多个恒定区的至少一部分已被缺失或以其他方式改变，以提供期望的生物化学特性，诸如与包含天然或未改变的恒定区且具有差不多相同的免疫原性的抗体相比时增加的肿瘤定位或减少的血清半衰期。在一些方面，修饰的抗-LOX1抗体的恒定区包含人类恒定区。对恒定区的修饰可包括一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文披露的修饰的抗-LOX1抗体可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定结构域(CL)的替换或修饰。在一些方面，修饰的抗-LOX1抗体将包含恒定区，其中涵盖一个或多个结构域部分或全部缺失。在一些方面，修饰的抗-LOX1抗体将包含缺失结构域的构建体或变体，其中整个CH2结构域被移除(ΔCH2构建体)。在一些方面，省略的恒定区可被短氨基酸间隔区(例如，10个残基)替换，该间隔区提供通常由不存在的恒定区所赋予的一定分子柔性。

除它们的构型以外，本领域中已知恒定区介导几种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理作用和溶解方面是重要的。补体的活化还刺激炎症应答并且还可以涉及在自身免疫性超敏反应之中。此外，抗体经由Fc区来结合至细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体位点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)、以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀伤细胞溶解抗体包覆的靶标细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。

在某些方面，抗-LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有改变的效应子功能，进而影响给予的抗-LOX1抗体的生物学特征。例如，恒定区的缺失或失活(经由点突变或其他手段)可减少循环的修饰抗体的Fc受体结合。在其他情况下，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性关联。恒定区的又其他修饰可以用于消除二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。相似地，根据本披露对恒定区的修饰可容易地利用技术人员认知范围内的熟知的生物化学或分子工程技术进行。

在一些方面，本文提供的LOX1-结合蛋白是没有一种或多种效应子功能的LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及它们的变体和衍生物)。例如，在一些方面，抗-LOX1-抗体没有抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)活性和/或无补体-依赖性毒性(CDC)活性。在某些方面，抗-LOX1抗体不结合至Fc受体和/或补体因子。在某些方面，抗-LOX1抗体没有效应子功能。

在一些方面，抗-LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)经工程化以将CH3结合域直接融合至相应修饰的抗体的铰链区。在其他构建体中，将肽间隔区插在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达相容性构建体，其中CH2结构域已经缺失，且剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)与具有5-20个氨基酸间隔区的铰链区结合。可添加此间隔区，例如以确保恒定结构域的调节元件保持游离且可接触，或者铰链区保持柔性。在一些情况中，氨基酸间隔区可被证明具有免疫原性，并引发针对构建体的非所需免疫应答。因此，在某些方面，添加至构建体的任何间隔区都可以是相对无免疫原性的，或甚至被完全省略，以维持修饰的抗-LOX1的期望生物化学性质。

除了缺失整个恒定区结构域以外，抗-LOX1抗体(例如，全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可通过恒定区中的几个或甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来修饰。例如，CH2结构域中的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质性地减少Fc结合，且从而。相似地，控制效应子功能(例如，补体C1Q结合)的一个或多个恒定区结构域可以完全或部分缺失。恒定区的这类部分缺失可改善拮抗剂抗-LOX1抗体的选定特性(例如，血清半衰期)，同时使与对应恒定区结构域相关的其他期望功能保持完整。此外，本文提供的抗-LOX1抗体的恒定区可通过一个或多个氨基酸的突变或取代修饰，这改进最终构建体的特征。在这个方面，可干扰保守结合位点(例如，Fc结合)所提供的活性，同时基本上维持修饰的抗-LOX1抗体的构型和免疫原性特征。本披露还提供了含有向恒定区的一个或多个氨基酸的添加以改进期望特性(诸如减少或增加效应子功能或为更多细胞毒素提供附接位点、标记或碳水化合物部分)的抗-LOX1抗体。在这些方面，可以希望插入或复制源自选定的恒定区结构域的特定序列。

本披露还涉及结构上与本文披露的抗-LOX1抗体(例如，鼠类的、嵌合的、人源化的和人类LOX1-结合蛋白)基本上同源和/或一个或多个功能相似的变体和等同物。这些变体可含有例如保守氨基酸残基取代突变。如本领域中一般理解的，保守氨基酸残基取代是指一种氨基酸残基被相同一般类别中的另一种氨基酸残基取代，例如，像一种酸性氨基酸被另一种酸性氨基酸取代，一种碱性氨基酸被另一种碱性氨基酸取代或一种中性氨基酸被另一种中性氨基酸取代。保守氨基酸取代的目的是本领域中已知的。

本文提供的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体可经衍生化以含有通常并非该蛋白的一部分的其他化学部分。此类衍生化部分是本领域中已知的，且可用于提高例如LOX1-结合蛋白的溶解性、生物半衰期、生物利用率以及改善稳定性、配制和/或治疗性质。此类部分的非穷尽式概述可在例如雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第20版，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，PA(2000)中找到。

VI.编码LOX1-结合蛋白的核酸和它们的表达

本披露提供了编码LOX1-结合蛋白(参见例如，表1、图4或图5中描述的那些)，包括抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物的核酸分子。本文披露的核酸分子可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，那么DNA可以是双链或单链的。在某些方面，核酸分子是分离的。在其他方面，核酸分子是基本上纯的。在一些方面，核酸是cDNA或衍生自cDNA。在一些方面，核酸是重组产生的。

在一些方面，核酸分子包含编码可操作地连接至控制编码序列在宿主细胞中或体外的表达的控制序列的LOX1-结合蛋白。在特定方面，编码序列是cDNA。本披露还涉及含有核酸分子的载体，这些核酸分子包含编码可操作地连接至控制序列的LOX1-结合蛋白，该控制序列控制编码序列在宿主细胞中或体外的表达。

在一些方面，该核酸分子包含成熟LOX1-结合蛋白的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合至异源多核苷酸序列。在一些方面，异源多核苷酸序列编码前导肽序列，该前导肽序列促进表达的蛋白从用LOX1-编码核酸分子转化的宿主细胞分离。含有前导序列的蛋白质被称为前蛋白质并且可以使得前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。此类前导肽序列和它们促进重组蛋白在宿主细胞中分泌的用途通常在本领域中是已知的。在其他方面，异源多核苷酸序列编码可用于例如促进纯化、增加或提高蛋白稳定性和/或重组表达的LOX1-结合蛋白的治疗或诊断性质的其他5′和/或3′氨基酸残基。

在一些方面，本披露提供了足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的核酸，诸如cDNA分子。

在某些方面，本披露提供了编码轻链可变区(VL)的分离的核酸分子，其中VL包含分别与SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；或SEQ ID NO：32、34或35相同或在一个或多个VL-CDR中具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。在其他方面，本披露提供了编码轻链可变区(VL)的分离的核酸分子，其中VL包含分别与SEQ ID NO：55或59；SEQ ID NO：56或60；或SEQ ID NO：57、61-63或64相同或在一个或多个VL-CDR中具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。

本披露还提供了编码重链可变区(VH)的分离的核酸分子，其中VH包含分别与SEQID NO：1；SEQ ID NO：2、5-12或13；和SEQ ID NO：3、14-17或18相同或在一个或多个VH-CDR中具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。在其他方面，本披露提供了编码重链可变区(VH)的分离的核酸分子，其中VH包含分别与SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39、42或43；和SEQ ID NO：40、44-46或47相同或在一个或多个VH-CDR中具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。

本披露还提供了编码轻链可变区(VL)的分离的核酸，诸如cDNA，其中VL包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。在一些方面，分离的核酸分子编码轻链可变区(VL)，其中VL包含与参考氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列。

此外，本披露提供了编码重链可变区(VH)的分离的核酸分子，其中VH包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：4、19-28和29。在一些方面，分离的核酸分子编码重链可变区(VH)，其中VH包含与参考氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列。

在某些方面，本披露提供了编码特异性地结合至LOX1的LOX1-结合蛋白(例如表1、图4或图5中所述的LOX-1结合蛋白)的核酸分子或核酸分子的组合。还提供了包含如本文所述的核酸分子，诸如cDNA或核酸分子的组合的载体。合适的载体描述在本文的其他地方，且是本领域中已知的。

在某些方面，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)是由与分别编码SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：37的参考核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核酸序列编码。在一个特定方面，分离的LOX1-结合蛋白(例如抗-LOX1抗体或其片段)是由分别编码SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33的核酸序列编码。

本披露还提供了编码轻链可变区(VL)的分离的核酸，诸如cDNA，其中VL包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：58、65-69和70.在一些方面，分离的核酸分子编码轻链可变区(VL)，其中VL包含与参考氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列。

本披露还提供了编码重链可变区(VH)的分离的核酸分子，其中VH包含与选自下组的参考氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：41、48-53和54。在一些方面，分离的核酸分子编码重链可变区(VH)，其中VH包含与参考氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列。

在某些方面，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)是由与分别编码SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：58的参考核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核酸序列编码。在一个特定方面，分离的LOX1-结合蛋白(例如抗-LOX1抗体或其片段)是由分别编码SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：58的核酸序列编码。

在一些方面，分离的核酸编码包含以下一组CDR的LOX1-结合蛋白：表1、图4或图5中所述的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR3和VL-CDR3。在一些其他方面，分离的核酸编码包含表1、图4或图5中所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的LOX1-结合蛋白。

在如上所述的核酸分子组合物中，编码VH的核酸和编码VL的核酸可处在单个载体中，或可以在分开的载体上。因此，本披露提供了一种或多种包含核酸分子组合物或上述核酸分子的组合的载体。

在一些情况中，编码如上所述的VH和VL的多核苷酸组合物可编码特异性地结合至LOX1例如人类和食蟹猴LOX1的抗体(包括LOX1-结合抗体片段)。在一些方面，核苷酸组合物编码特异性地结合至与分别包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33的VH和VL的抗体或抗原结合片段所结合表位相同的表位的抗体。在其他方面，核苷酸组合物编码特异性地结合至与分别包含SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：58的VH和VL的抗体或抗原结合片段所结合表位相同的表位的抗体。在一些其他方面，多核苷酸组合物编码特异性地结合至与包含表1、图4或图5中所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的LOX1-结合蛋白所结合表位相同的表位的抗体。

在其他方面，本披露提供了如上提供的包含一种或多种核酸或载体的宿主细胞，其中宿主细胞在一些情况中可表达特异性地结合至LOX1的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。此种宿主细胞可用在制造如本文提供的LOX1-结合蛋白的方法中，其中该方法包括(a)培养宿主细胞，和(b)分离从宿主细胞表达的LOX1-结合蛋白。

本披露还提供了一种制造LOX1-结合蛋白的方法，该方法包括培养能够在合适条件下表达LOX1-结合蛋白的宿主细胞或杂交瘤，且任选地提供一种分离从该宿主细胞或杂交瘤分泌的LOX1-结合蛋白的方法。此外，本披露此外提供了在利用披露的方法从宿主细胞或杂交瘤分泌后分离的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。

在某些方面，多核苷酸包含一种或多种成熟LOX1-结合蛋白(例如，LOX1-抗体，诸如全长抗体和LOX1-结合抗体片段)的一种或多种编码序列，所述编码序列在相同阅读框中融合至允许例如纯化编码的多肽的标记物序列。例如，在细菌宿主的情况下，该标记物序列可以是由pQE-9载体供给的六聚组氨酸标签以便提供对融合至该标记物的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标记物序列可以是来源于流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素(HA)标签。

还提供了编码LOX1-结合蛋白诸如抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段的核酸变体。核酸变体可含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。在一些方面，这些核酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失而不改变编码的多肽的特性或活性的改变。在一些方面，核酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。核酸变体可以因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成诸如大肠杆菌的细菌宿主优选的那些密码子)。还提供包含在此描述的核酸的载体和细胞。

在一些方面，编码LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗体和LOX1-结合抗体片段)的核酸序列是通过化学合成利用寡核苷酸合成仪构建。此类寡核苷酸可基于期望多肽的氨基酸序列设计，并基于宿主细胞偏好进行密码子优化。标准方法可常规地用于合成编码LOX1-结合蛋白的分离多核苷酸序列。

一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码LOX1-结合蛋白的核酸序列可常规地可操作连接至适合在期望宿主中表达LOX1-结合蛋白的控制序列。在一些方面，将编码LOX1-结合蛋白的核酸序列插入表达载体中，并可操作地连接至适合在期望宿主中表达蛋白的控制序列。为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，该基因可操作性地连接到在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列或与之相关联。

在某些方面，使用重组表达载体来扩增并表达编码LOX1-结合蛋白诸如抗-LOX1抗体或LOX1-结合抗体片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，这些构建体具有编码LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗体和LOX1-结合抗体片段)的多肽链的合成DNA片段或cDNA-衍生的DNA片段，这些DNA片段可操作地连接至衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调节元件。转录单位总体上包含以下组件：(1)基因表达中具有调节作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译启动和终止序列，如以下详细描述的。此类调节元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。另外可并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力和促进识别转化体的选择基因。当DNA区域功能上彼此相关时，它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，那么它可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子控制序列转录，那么启动子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位为允许翻译，那么它可操作地连接至编码序列。旨在用于在酵母菌表达系统中使用的结构元件包括能通过宿主细胞胞外分泌翻译的蛋白的前导序列。可替代地，在无前导序列或转运序列下表达重组蛋白时，该蛋白可包括N端甲硫氨酸残基。这个残基随后可任选地从表达的重组蛋白裂解，以提供最终蛋白。在某些方面，本披露提供了包含如上所述或本文其他地方所述的核酸或载体，任选地还包含一种或多种载体、稀释剂、赋形剂或其他添加剂的组合物，例如，药物组合物。

还提供了用本文披露的核酸分子或cDNA分子和/或载体转化的宿主细胞。本披露还提供了用可操作地连接至控制序列并任选地插入载体中的披露的核酸分子或分子转化的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在其他方面，哺乳动物宿主细胞是NS0鼠骨髓瘤细胞、人类细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在其他方面，宿主细胞是杂交瘤。

此外，表达编码本文披露的LOX1-结合蛋白的核酸的宿主细胞是产生LOX1-结合蛋白的杂交瘤。

在其他方面，本披露提供了一种制造本文提供的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的方法，该方法包括在适合产生LOX1-结合蛋白的条件下培养本文披露的转化的宿主细胞或杂交瘤。本披露任选地提供了分离从宿主细胞或杂交瘤分泌的LOX1-结合蛋白。本披露还任选地提供了利用该方法产生的LOX1-结合蛋白以及包含该LOX1-结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。

表达调控序列和表达载体的选择将依赖于宿主的选择。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，以及更广泛的宿主范围质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。

适合在控制合适启动子的条件下表达LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的宿主细胞包括原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述哺乳动物起源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。关于蛋白生产(包括抗体生产)方法的其他信息可在例如美国申请公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501以及国际申请公开号WO 04009823中找到，其中每一个特此通过引用以其全文结合在此。

各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以有利地用于表达重组LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。可以在哺乳动物细胞中进行重组LOX1-蛋白的表达，因为此类蛋白质总体上被正确地折叠，适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由格卢兹曼(Gluzman)(细胞23：175(1981))描述的猴肾细胞的COS-7系、以及包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系的其他细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制原点、连接有待表达的基因的适合的启动子和增强子、以及其他5′或3′侧接非转录序列、以及5′或3′非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点)，以及转录终止序列。用于产生昆虫细胞中的异源蛋白质的杆状病毒系统通过卢科和萨莫斯(Luckow和Summers)，生物技术(BioTechnology)6：47(1988)评价。

由转化的宿主或杂交瘤产生的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长抗-LOX1抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可根据任何合适方法纯化。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以便允许蛋白质通过合适的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶的此类技术来物理性表征分离的LOX1-结合蛋白。

例如，可以首先使用可商购的蛋白浓缩过滤器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(Millipore Pellicon)超滤单元浓缩来自将重组LOX1-结合蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，浓缩物可以施加到适合的纯化基质。可替代地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧接的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。可替代地，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。最后，可以使用采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧接甲基或其他脂族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以便进一步纯化LOX1-结合蛋白。还可以常规地采用不同组合的一些或所有上述纯化步骤以便提供均质的重组LOX1-结合蛋白。

细菌培养物中产生的重组LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可例如通过开始从细胞沉淀物提取，接着进行一个或多个浓缩、盐析、水离子交换或尺寸排阻色谱步骤分离。可以采用高效液相色谱(HPLC)进行最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的微生物细胞可以通过任何常规方法来破坏，这些方法包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。

本领域中已知用于纯化靶结合蛋白，诸如全长抗体和抗原-结合抗体片段的方法还包括例如美国申请公开号2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些，其中每一个特此通过引用以其全文结合在此。

VII.利用治疗性LOX1-结合蛋白的治疗方法

提供了使用LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)治疗患有与LOX1、LOX1活性和/或LOX1表达相关的疾病的受试者的方法。用于检测LOX1表达的方法是本领域中已知的，且包括但不限于PCR技术、免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA等。

在其他方面，本披露提供了含有本文提供的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，本披露提供了含有LOX1-结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，用于用作药物。本披露还提供了使用药物组合物用于治疗、预防和/或改善与LOX1、LOX1活性、LOX1表达和/或减少的HDL-介导的信号传导相关的疾病或病状。在一些方面，利用本文提供的药物组合物治疗的疾病或病状是动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和/或癌症。

在一些方面，药物组合物含有LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)、药学上可接受的载体，且还包含标记基团或效应物基团。如本文所用，“标记”是指能够在屏幕上检测到的一个或多个元素、同位素或化学化合物。标记通常落入三个类别中：(a)同位素标记，可以是放射性或重同位素，(b)小分子标记，可包括荧光和比色染料，或能够促成其他标记方法的分子如生物素，(c)免疫标记，可以是作为被抗体识别的融合伴侣掺入的表位。“标记基团”是指任何可检测的标记。在一些方面，通过间隔区(例如，肽间隔区)将标记基团偶联至LOX1-结合蛋白，以减少潜在空间位阻。可将标记掺入化合物的任何位置，且可在蛋白表达期间在体外或体内掺入。各种标记蛋白的方法是本领域中已知的，且可用于实施所提供的方法。在其他方面，标记基团是选自下组，该组由以下各项组成：同位素标记、磁标记、氧化还原活性部分、光学染料、生物素化的基团和通过次级报告物识别的多肽表位。在一些方面，标记基团是荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白或其衍生物(例如，增强的GFP)、蓝色荧光蛋白或其衍生物(例如，EBFP(增强的蓝色荧光蛋白)、EBFP2、Azurite、mKalama1、青色荧光蛋白或其衍生物(例如，ECFP(增强的青色荧光蛋白)、Cemlean、CyPet)、黄色荧光蛋白或其衍生物(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)。在一些方面，多肽表位是选自生物素信号传导肽、组氨酸肽(his)、血球凝集素(HA)、Flag、金结合肽的成员。在其他方面，效应物基团是选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂和化疗剂。

在其他方面，效应物基团是选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂和化疗剂。

以下讨论涉及诊断方法和治疗、预防和/或改善各种与LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)相关的疾病和病状。在一些方面，LOX1-结合蛋白是人类、鼠类或人源化抗体。

在一个方面，本披露提供了疾病或病状的治疗、预防或改善，包括向患有疾病或病状或具有发展与LOX1相关的疾病或病状风险的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。在另一个方面，治疗包括向来自受试者的分离组织或细胞给予LOX1-结合蛋白，其中该受试者患有疾病或病状或具有发展与相关的疾病或病状风险。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善受试者中与动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症相关的疾病或病状的方法。在一些方面，该方法包括向有此需要的受试者给予有效量的包含LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的药物组合物。在其他方面，LOX1-结合蛋白是单独给予或作为组合疗法给予。

本披露还提供了减少或抑制受试者中LOX1活性和/或刺激或增加HDL-介导的信号传导。在一些方面，该方法包括向有此需要的受试者(例如诊断患有动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和/或癌症的受试者)给予有效量的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。

此外，提供了治疗、预防和/或改善动脉粥样硬化的方法。在一些情况下，该方法包括向患有动脉粥样硬化的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)的受试者具有发展动脉粥样硬化的风险。在一些方面，该受试者具有致动脉粥样硬化病状。在其他方面，该致动脉粥样硬化病状是系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、高血压、高血糖、心力衰竭、血管损伤、器官移植、血脂异常(例如，高脂血症)、炎症(例如，慢性炎症和内毒素诱导的炎症)和/或细菌感染。还提供了减少动脉粥样硬化的方法。在一些情况下，本披露提供了一种减少受试者中动脉粥样硬化的方法，该方法包括向患有动脉粥样硬化的受试者给予LOX1-结合蛋白。

还提供了治疗、预防和/或改善血栓形成的方法。在一些情况下，该方法包括向具有血栓形成的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展血栓形成的风险。在一些方面，血栓形成是动脉血栓形成。在其他方面，血栓形成是深静脉血栓形成。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善冠状动脉疾病(CAD)或与CAD相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有CAD的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展CAD的风险。在一些方面，该受试者具有致动脉粥样硬化病状。在其他方面，该致动脉粥样硬化病状是系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、高血压、高血糖、心力衰竭、血管损伤、器官移植、血脂异常(例如，高脂血症)、炎症(例如，慢性炎症和内毒素诱导的炎症)和/或细菌感染。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善局部缺血或与局部缺血相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有局部缺血的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展局部缺血的风险。在一些方面，该受试者患有心肌缺血。在其他方面，该受试者有发展心肌缺血的风险。在其他方面，该受试者患有系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、高血压、高血糖、心力衰竭、血管损伤、器官移植、血脂异常(例如，高脂血症)、炎症(例如，慢性炎症和内毒素诱导的炎症)和/或细菌感染。

还提供了治疗、预防和/或改善梗塞或与梗塞相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有梗塞的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展梗塞的风险。在一些方面，该受试者患有心肌梗塞。在其他方面，该受试者有发展心肌梗塞的风险。在其他方面，该受试者患有局部缺血、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、高血压、高血糖、心力衰竭、血管损伤、器官移植、血脂异常(例如，高脂血症)、炎症(例如，慢性炎症和内毒素诱导的炎症)和/或细菌感染。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善急性冠脉综合征(ACS)或与ACS相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有ACS的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展ACS的风险。在一些方面，该受试者具有升高的sLOX血清水平或升高的LOX1活性。在其他方面，该受试者患有动脉粥样硬化。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善中风或与中风相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向曾经患有中风的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有患有中风的风险。在一些方面，该受试者具有升高的sLOX血清水平或升高的LOX1活性。在其他方面，该受试者患有动脉粥样硬化。

还提供了治疗、预防和/或改善再灌注损伤或与再灌注损伤相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有再灌注损伤的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展再灌注损伤的风险。在一些方面，该受试者将进行外科手术。在其他方面，该受试者已经作了外科手术。在一些方面，该外科手术是移植或冠状动脉搭桥手术。在其他方面，患者患有心肌缺血-再灌注损伤或具有发展该病的风险。在其他方面，该方法减少心肌损伤，减少胶原聚集，减少血清CK-MB和MDA，减小心肌细胞尺寸，减少白细胞浸润和/或减少心功能障碍(例如，减少的LVP和增加的LVEDP)。在其他方面，该方法增加心搏出量、缩短分数和/或注射分数。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善再狭窄或与再狭窄相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有再狭窄的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展再狭窄的风险。在一些方面，该受试者将进行外科手术。在其他方面，该受试者已经作了外科手术。在一些方面，该外科手术是血管内程序。在其他实施例中，该外科手术是血管外科手术、心脏外科手术或血管成形术。在其他方面，该程序是移植或冠状动脉搭桥手术。在其他方面，得到治疗、预防和/或改善的再狭窄是支架内再狭窄或血管成形术后再狭窄。

在其他方面，本披露提供了治疗、预防和/或改善周围血管疾病(PVD)或与PVD相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有PVD的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，在本文所述的药物组合物中)。在其他方面，给予LOX1-结合蛋白的受试者具有发展PVD的风险。在一些方面，该受试者具有升高的sLOX血清水平或升高的LOX1活性。在其他方面，该受试者患有动脉粥样硬化。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善炎症或与炎症相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有炎症的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，该受试者患有慢性炎症。在一些方面，该受试者具有升高的oxLDLa和/或sLOX血清水平和/或升高的LOX1活性。在其他方面，该受试者患有动脉粥样硬化。

本披露还提供了治疗、预防和/或改善先兆子痫或与先兆子痫相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有先兆子痫或子痫的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，本文所述的药物组合物中的抗-LOX1抗体或其片段)。在其他方面，该受试者具有高血压，且尿液中具有大量蛋白质。在一些方面，该受试者具有升高的oxLDL和/或sLOX血清水平和/或升高的LOX1活性。在其他方面，该受试者的脚、腿和/或手有肿胀。

在其他方面，本披露提供了稳定受试者中动脉粥样硬化斑块的方法。在一些情况下，该方法包括向有此需要的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体，LOX1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)。在一些方面，该方法减少斑块中RhoA/Rac1、一氧化氮、p38MAPK、蛋白激酶B和C、ERK1/2和/或NFκB信号转导途径的信号传导。在其他方面，该方法减少斑块中的细胞凋亡。在其他方面，该方法降低斑块中的半胱天冬酶8、半胱天冬酶9和/或BAX活性和/或增加BCL-2活性。在其他方面，该方法降低通过斑块产生的粘附分子或细胞因子的水平。在其他方面，该方法减少通过斑块的E-选择素、P-选择素、ICAM-1、VCAM-1、MCP1和/或CD40/CD40L表达。在其他方面，该方法减小/少动脉粥样硬化斑块中动脉粥样硬化斑块尺寸或形成、巨噬细胞聚集和/或MMP(例如，MMP9)表达。在其他方面，该方法导致斑块进展减慢或回归。

还提供了减少受试者中血管紧张度丧失的方法。在一些情况下，该方法包括向有此需要的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体，LOX1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)。在一些方面，该方法减少血管紧张度丧失。在其他方面，该方法通过调节HDL驱动的一氧化氮(NO)产生(抗体刺激内皮NO产生的能力)减少血管紧张度丧失。

此外，提供了提高受试者的血管紧张度的方法。在一些情况下，该方法包括向有此需要的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。

在一些方面本披露提供了治疗、预防和/或改善与高血糖或高血压相关的病状的方法。在一些情况下，该方法包括向患有高血糖或高血压的受试者给予LOX1-结合蛋白。

此外，提供了治疗、预防和/或改善癌症的方法。在一些情况中，本披露提供了一种治疗、预防和/或改善受试者的癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者给予LOX1-结合蛋白。在一些方面，该受试者患有选自下组的癌症，该组由以下各项组成：乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、子宫癌、肾癌和胰腺癌。

还提供了抑制肿瘤细胞增生、迁移或侵袭的方法。在一些情况中，本披露提供了一种拮抗LOX1活性的方法，该方法包括使LOX1-结合蛋白与表达LOX1的肿瘤细胞接触。在一些方面，该肿瘤细胞是来自选自下组的癌症，该组由以下各项组成：乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、子宫癌、肾癌和胰腺癌。在一些方面，肿瘤细胞来自癌细胞系。

此外，本披露提供了减少或抑制血管新生的方法。在一些方面，该减少或抑制血管新生的方法包括向有此需要的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。在一些方面，该受试者具有与病理性血管新生相关的病状。在其他方面，本披露提供了抑制血管新生的方法，该方法包括使LOX1-结合蛋白与表达LOX1的细胞接触。在一些方面，该细胞是内皮细胞。在其他方面，该内皮细胞是冠状动脉内皮细胞。在一些方面，该方法在体外进行。在其他方面，该方法在体内进行。

此外，提供了阻断或降低LOX1活性的方法。在一些方面，本披露提供了阻断LOX1活性的方法，该方法包括给予减少或抑制LOX1与LOX1配体诸如oxLDL、AGE和/或CRP间的相互作用的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。在一些方面，LOX1表达在内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌血管细胞和/或血小板的表面。在一些方面，该细胞是内皮细胞，诸如冠状动脉内皮细胞。在其他方面，该细胞是血管平滑肌细胞、巨噬细胞或血小板。在其他方面，该细胞是动脉粥样硬化组织的一部分。在一些方面，该方法在体内进行。在其他方面，该方法在体外进行。在一些方面，阻断或降低的LOX1活性是结合和/或占用(例如内化)oxLDL。在其他方面，阻断或降低的LOX1活性是诱导p38(MAPK)、p44/42MAPK、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶B(PKB)、蛋白酪氨酸激酶(PTK)、转录因子NF-KB和/或AP1信号传导途径。在其他方面，阻断或降低的LOX1活性是诱导细胞凋亡。在其他实施例中，诱导细胞凋亡是通过半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和/或Bcl-2介导。在其他方面，阻断或降低的LOX1活性是在表达LOX1的内皮细胞中表达PDFG的A链和B链和/或肝素结合EGF-样蛋白(HB-EGF)。在一些方面，阻断或降低的LOX1活性是通过oxLDL结合至LOX1诱导的LOX1活性。

此外，提供了在阻断或降低与增加的LOX1活性水平或LOX1表达水平(例如sLOX1血清蛋白水平)相关的病理状况中的LOX1活性。在一些情况下，该方法包括向具有增加的LOX1活性或LOX1表达水平(例如sLOX1血清蛋白水平)的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)。在一些方面，该病理状况是系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、高血压、高血糖、心力衰竭、血管损伤、移植、血脂异常(高脂血症)、炎症(例如，慢性炎症和内毒素诱导的炎症)或细菌感染。在一些方面，该受试者具有升高的OxLDL血清水平。在一些方面，该受试者具有升高的OxLDL、15脂氧合酶修饰的LDL、15脂氧合酶修饰的HDL、糖氧化LDL、溶血磷脂酰胆碱酯酶(LPC)和/或棕榈酸血清水平。在其他方面，该受试者具有升高的TNFα、IL1、干扰素γ、LPS(脂多糖)、CRP、血管紧张素II、内皮素I和/或AGE血清水平。在其他方面，该受试者具有升高的可溶性LOX1(sLOX1)血清水平。在一些方面，该受试者的LOX1基因具有单核苷酸多态性(SNP)。在一些方面，LOX1基因中的SNP是LOX1 K167N变体。

还提供了促进或增加高密度脂蛋白(HDL)活性的方法。在一些方面，本披露提供了一种通过向有此需要的受试者给予LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或其片段)增加或促进HDL活性的方法。在一些方面，增加的HDL活性是促进HDL-介导的内皮NO生产。在一些方面，增加的HDL活性是抑制内皮细胞的NFKB信号传导活性。在一些方面，增加的HDL活性是促进内皮细胞修复。在一些方面，增加的HDL活性是减少炎症。

还提供了使用本文提供的LOX1-结合蛋白，诸如LOX1-结合蛋白诊断监测血液或组织中的蛋白水平(例如，LOX1水平)作为临床测试程序的一部分，例如，以确定给定治疗方案的功效。例如，检测可通过将LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体)偶联至可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括npt抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、萤光素和水母素；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

VIII.药物组合物和给药方法

制备本文提供的LOX1-结合蛋白和将其给予至有此需要的受试者的方法是本领域中所已知的或容易由本领域技术人员来确定。LOX1-结合蛋白的给予途径可以是例如口服、胃肠外、吸入或局部给药。如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。虽然所有这些给药形式可清楚地考虑为是在本披露的范围之内，但给予形式的另一个实例是用于注射、特别是用于静脉或动脉注射或滴注的溶液。通常，合适的药物组合物可以包括缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(如聚山梨酯)、任选的稳定剂试剂(例如人类白蛋白)等。在与在此的传授内容相容的其他方法中，如本文提供的LOX1结合蛋白可直接递送到器官和/或动脉粥样硬化或肿瘤的位置，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。在一个方面，例如通过吸入或鼻内给予直接给予至气道。

如本文讨论的，LOX1-结合蛋白可以按药学上有效量给予，以在体内治疗LOX1介导的疾病和病状，诸如动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症。在这方面，应理解所披露的LOX1结合蛋白可被配制成有助于给予并且促进活性剂的稳定性。根据本披露的药物组合物可包含药学上可接受的、无毒性的、无菌的载体，诸如生理盐水、无毒性的缓冲剂、防腐剂等。出于本申请的目的，药学上有效量的轭合或未轭合的LOX1-结合蛋白意指足以实现有效结合至LOX1且获得益处，例如，改善疾病或病状的症状或检测物质或细胞的量。用于本文披露的治疗方法的合适配制品描述于雷明顿氏药物科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)(麦克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。

本文提供的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。使用苄醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规增溶剂或分散剂，这样的组合物可以作为盐水中的溶液来制备。

可与载体材料合并以产生单一剂型的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的量将根据治疗的受试者和特定给予模式而变化。组合物可以作为单剂量，多剂量或经在输注中的确定时间段给予。也可以调整剂量方案以便提供最佳期望反应(例如治疗性或预防性反应)。

与本披露的范围相一致，LOX1-结合蛋白可以根据前述治疗方法以足以产生治疗效果的量来给予至人或其他受试者。本文提供的LOX1-结合蛋白可以按常规剂型来给予至这种人或其他动物，该剂型是通过根据已知技术将LOX1-结合蛋白与常规药学上可接受的载体或稀释剂相组合来制备。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可通过有待组合的活性成分的量、给予途径和其他熟知的变量来确定。还可以使用包含一种或多种不同LOX1-结合蛋白的混合物。

对于治疗患有待治疗的疾病或病状的受试者而言，所谓“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)在给予时引起正面治疗反应。

用于治疗LOX1-介导的疾病或病状如动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症的LOX1-结合蛋白的治疗有效剂量根据许多不同因素而变化，包括给予方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人类还是动物、给予的其他药品和治疗是预防性还是治疗性的。通常，受试者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。

如本文所用，通过给予LOX1-结合蛋白改善特定疾病或病状的症状是指任何可归因于或与给予该LOX1-结合蛋白相关的减少，无论是永久还是暂时的、持久还是瞬时的。

至少一种LOX1-结合蛋白，例如，抗体或结合结合片段待给予的量容易由本领域的普通技术人员考虑本披露而无需过多的实验确定。影响给予模式和至少一种LOX1结合蛋白的相应量的因素包括但不限于疾病的严重性，疾病的病史，以及经历治疗的个体的年龄，身高，体重，健康、和身体状况。类似地，有待给予的LOX1结合蛋白的量将取决于给药方式以及该受试者将经历这种药剂的单剂量还是多剂量。

本披露还提供了LOX1-结合蛋白诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)制造例如用于提高HDL活性的药物的用途，以及治疗、预防和/或改善动脉粥样硬化、血栓形成、CAD、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、炎症(例如，慢性炎症)、血管新生、先兆子痫和癌症的方法。

组合疗法

在一些方面，LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)与一种或多种其他疗法组合给予。此类疗法包括其他治疗剂以及其他医疗介入。可与本文提供的LOX1-结合蛋白组合给予的示例性治疗剂包括但不限于血小板抑制剂、抗-凝血剂、抗高血压药、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂、β阻断剂、钙通道阻断剂、HMG CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)、依泽替米贝、贝特类(例如，吉非贝齐和非诺贝特)、依折麦布、胆汁酸螯合剂、硝酸盐和血栓溶解剂。

在各种方面，LOX1-结合蛋白在外科手术程序之前、期间和/或之后给予。在一些方面，该外科手术是血管内程序。在其他实施例中，该外科手术是血管外科手术、心脏外科手术或血管成形术。在其他方面，该程序是移植或冠状动脉搭桥手术。

IX.诊断

本披露还提供了可用于诊断LOX1-介导的疾病和病状如动脉粥样硬化、血栓形成、冠状动脉疾病(CAD)、局部缺血(例如，心肌缺血)、梗塞(例如，心肌梗塞)、急性冠脉综合征(ACS)、中风、再灌注损伤、再狭窄、周围血管疾病、高血压、心力衰竭、炎症、血管新生、先兆子痫和癌症期间的诊断方法，该方法涉及测量LOX1(包括sLOX1)蛋白在来自个体的组织或体液如血清中的表达水平，并将测量的表达水平与正常组织或体液中的标准LOX1表达水平比较，借此，表达水平与标准相比的增加指示可通过本文提供的LOX1-结合蛋白(诸如如本文提供的全长抗-LOX1抗体和抗原-结合抗体片段)治疗的病症。

本文提供的LOX1-结合蛋白，诸如抗-LOX1抗体(例如，全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可用于利用本领域的技术人员已知的经典免疫组织学方法分析生物样品中的LOX1蛋白水平(参见例如，亚尔卡宁(Jalkanen)等人，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101：976-985(1985)；亚尔卡宁等人，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))。可用于检测LOX1蛋白表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀法或蛋白质印迹法。

所谓“测定LOX1蛋白的表达水平”旨在直接地(例如，通过测定或估算绝对蛋白水平)或相对地(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平比较)定性或定量测量或估算第一生物样品中的LOX1蛋白水平。可测量或估算第一生物样品中的LOX1蛋白表达水平，并与标准LOX1蛋白水平相比，该标准是从获自没有该病症的个体的第二生物样品，或者通过求取来自没有该病症的个体群体的水平的平均值来测定。如本领域中将理解的，一旦已知“标准”LOX1蛋白水平，它可重复用作比较的标准。

所谓“生物样品”意指从潜在地表达LOX1的个体、细胞系、组织培养物或其他细胞来源获得的任何生物样品。本领域中已知用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法。

X.包含LOX1-结合蛋白的试剂盒

本披露还提供了包含在合适包装中的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体、LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)和书面材料、且可用于实施本文所述方法的试剂盒。

书面材料可包括以下任何信息：使用说明、临床研究讨论、副作用清单、科学文献引用、包装说明书材料、临床试验结果和/或这些的概述等。书面材料可指示或确立组合物的活性和/或优点，和/或描述给药、给予、副作用、药物相互作用或对医疗服务人员有用的其他信息。这些信息可基于各种研究的结果，例如，利用涉及体内模型的实验动物和/或基于人类临床试验的研究。该试剂盒还可含有另一疗法(例如，另一药剂)和/或诸如上文描述的旨在提供关于其他疗法(例如，其他药剂)的信息的书面材料。

在某些方面，试剂盒包括在一个或多个容器中的至少一种纯化的LOX1-结合蛋白。在一些方面中，试剂盒含有所有必要和/或足够进行检测测定的组件，包括所有对照、用于进行测定的指导，例如用于分析和表示结果的任何必要的软件。

XI.免疫测定

LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体和LOX1-结合片段、其变体或衍生物)可通过本领域中已知的任何方法测定免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。此类测定是常规的并且在本领域是已知的(参见，例如奥苏贝尔等人编著，(1994)，分子生物学现代方法(约翰威利父子公司，纽约)第1卷，其通过引用以其全文结合在此)。

本文提供的LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体或LOX1-结合片段、其变体或衍生物)可使用在组织学上，如在免疫荧光法、免疫电子显微术或非免疫学测定中，用于原位检测LOX1或其保守变体或肽片段。原位检测可这样进行，通过从受试者移除组织学样本，并通过将标记的LOX1-结合蛋白覆盖在生物样品上向该组织学样本施加标记的LOX1-结合蛋白。通过使用这一程序，不仅可测定LOX1或保守变体或肽片段的存在，还可测定其在检查的组织中的分布。利用本披露，一般技术人员将容易知道，可修改众多各种组织学方法(诸如染色程序)中的任一种来实现这种原位检测。

可根据本领域中已知的方法测定给定多种LOX1-结合蛋白(例如，抗-LOX1抗体，诸如全长LOX1-抗体和LOX1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)的结合活性。技术人员将能够通过常规实验确定每个测定的操作和最佳测定条件。

适合于确定分离的LOX1-结合蛋白的结合特性的方法和试剂是在本领域中已知的和/或可商购的。设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如，软件，GE医疗集团；软件，萨比戴恩(Sapidyne)仪器)。

除非另外指示，否则本披露的实践采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，编辑(1989)分子克隆实验手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；萨姆布鲁克等人，编辑(1992)分子克隆实验手册(冷泉港实验室，NY)；D.N.格洛弗(D.N.Glover)编，(1985)DNA克隆，第I和II卷；盖特(Gait)编(1984)寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)；穆利斯(Mullis)等人美国专利号4,683,195；哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins)编(1984)核酸杂交；哈梅斯和希金斯编(1984)转录和翻译；弗雷谢尼(Freshney)(1987)动物细胞培养(Culture Of AnimalCells)(艾伦R.丽思公司(Alan R.Liss，Inc.))；固定化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)(IRL出版社)(1986)；佩宝(Perbal)(1984)分子克隆实用指南(A PracticalGuide To Molecular Cloning)；专著，酶学方法(Methods In Enzymology)(学术出版社公司，N.Y.)；米勒和卡洛斯编(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells)(冷泉港实验室)；吴(Wu)等人编，酶学方法，第154和155卷；梅尔和沃克编(1987)细胞和分子生物学的免疫化学方法(Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology)(学术出版社，伦敦)；韦尔(Weir)和布莱克威尔(Blackwell)编(1986)实验免疫学手册(Handbook Of Experimental Immunology)，第I-IV卷；操纵小鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，(1986)；和Ausubel等人(1989)分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰·威利父子(John Wiley and Sons)，巴尔的摩，Md.)。

在博雷贝克(Borrebaeck)编辑(1995)的抗体工程(Antibody Engineering)(第二版；牛津大学出版社)中，提出了抗体工程的普遍原理。在雷克伍德(Rickwood)等人，编辑(1995)的蛋白质工程，实用方法(牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，Eng.)中提出了蛋白质工程的普遍原理。在尼斯诺夫(Nisohoff)(1984)分子免疫学(Molecular Immunology)(第2版；辛劳尔联合公司(Sinauer Associates)，桑德兰，Mass.)；和斯图尔德(Steward)(1984)抗体、它们的结构和功能(Antibodies，Their Structure and Function)(查普曼和霍尔出版公司(Chapman and Hall)，纽约，N.Y.)中提出了抗体和抗体-半抗原结合的普遍原理。此外，本领域中已知且未具体描述的标准免疫学方法一般可在现代免疫学方法，约翰·威利父子出版公司，纽约；斯蒂茨(Stites)等人，编辑(1994)的基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)(第8版，阿尔普顿和兰格(Appleton&Lange)，诺沃克，Conn.)和米歇尔(Mishell)等人(编)(1980)选定细胞免疫学方法(Selected Methods inCellular Immunology)(W.H.弗里曼&Co.，NY)中找到。

列出免疫学普遍原理的标准参考著作包括现代免疫学方法，约翰·威利父子出版公司，纽约；克莱因(Klein)(1982)免疫学杂志(J.Immunology)：自我-非我区别科学(TheScience of Self-Nonself Discrimination)(约翰·威利父子出版公司，纽约)；肯尼特(Kennett)等人编(1980)单克隆抗体、杂交瘤：生物分析新维度(A New Dimension inBiological Analyzes)(普莱南出版社(Plenum Press)，NY)；生物化学和分子生物学实验技术中的坎贝尔(Campbell)(1984)“单克隆抗体技术”，编辑伯登(Burden)等人，(爱思唯尔(Elsevere)，阿姆斯特丹(Amsterdam))；古德斯比(Goldsby)等人编(2000)库比免疫学(Kuby Immunnology)(第4版；H.弗里曼公司)；罗伊特(Roitt)等人(2001)免疫学(Immunology)(第6版；伦敦：莫斯比)；阿巴斯(Abbas)等人(2005)细胞和分子免疫学(Cellular and Molecular Immunology)(第5版；爱思唯尔健康科学分部(ElsevierHealth Sciences Division))；肯特曼(Kontermann)和迪贝尔(Dubel)(2001)抗体工程(Antibody Engineering)(施普林格出版社(Springer Verlan))；萨姆布鲁克(2001)分子克隆：实验手册(冷泉港出版社)；勒温(Lewin)(2003)基因VIII(普伦蒂斯霍尔(PrenticeHall)2003)；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)抗体：实验手册(冷泉港出版社)；迪芬巴赫(Dieffenbach)等人，(2003)PCR引物(冷泉港出版社)。

通过说明而不是通过限制的方式，提供以下实例。

实例

本披露的多方面可以进一步通过参考以下非限制性实例进行定义，这些非限制性实例详细描述了本披露的某些抗体的制备以及使用本披露抗体的方法。对于本领域技术人员来说将会清楚的是，在不背离本披露的范围的情况下，可以对材料和方法二者做出许多修改。

实例1.分离和鉴定抗-LOX1 scFv抗体

使用源自成年天然供体骨髓的并克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体中的大单链Fv(scFv)人抗体文库进行筛选(哈钦斯C.(Hutchings，C.)，天然人抗体文库在抗体工程，R.肯特曼(R.Kontermann)和S.迪贝尔(S.Dubel)编辑2001，施普林格实验手册，柏林，第93页)。在基本上如先前描述的表达人类LOX1的重组哺乳动物(R&D系统)上，在一系列重复筛选周期中，从噬菌体展示文库分离LOX1-特异性scFv抗体(沃恩(Vaughan)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)14：309(1996))。尽管几种抗原-特异性scFv是从这个方案的不同变型获得，亲本克隆LOX514(SEQ ID NO：29(VH)和SEQ ID NO：33(VL)；本文还称作“LOX10514”)和LOX696(SEQ ID NO：54(VH)和SEQ ID NO：70(VL)；本文还称作“LOX10696”)是如下分离：将10μg/ml人类LOX1固定在MAXISORP^TM板(Nunc)上，并与噬菌体展示文库一起孵育。未结合的噬菌体在一系列洗涤周期中被洗掉。洗脱留在抗原上的噬菌体颗粒，感染进入细菌，并挽救以用于下一轮筛选。以这种方式进行三轮筛选。使代表数量的来自第2轮和第3轮筛选输出的单独克隆在96孔板中生长。ScFv表达在细菌周质中，并在如实例10测定1中所述的人类LOX1：oxLDL结合测定中筛选它们的抑制活性。

使筛选命中物即scFv克隆(作为粗周质提取物对LOX1：oxLDL相互作用示出抑制效果)经受DNA测序(沃恩等人，自然生物技术14：309(1996)和奥斯本(Osbourn)等人，免疫技术2：181(1996))。独特的scFv在细菌中重新表达，并通过亲和色谱法(如国际申请公开号WO01/66754的实例3中所述)纯化，并通过在以上测定中测试纯化scFv的稀释系列来测定IC₅₀值。

基本上如波西克(Persic)等人，基因187：9(1997)中所述将最有效的scFv克隆转化为完整免疫球蛋白G1三联突变体(IgG1-TM，包含突变L234F、L235E和P331S的人类IgG1Fc序列)抗体形式，其中作了以下修改。在表达载体中包括了OriP片段，以便促进在CHO细胞中使用并且允许游离型复制。将VH结构域克隆至含有人重链恒定结构域和调节元件的载体中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG1-TM重链。相似地，将VL结构域克隆进用于表达人轻链恒定结构域和调节元件的载体中，以便在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。为了获得IgG，将重链和轻链IgG表达载体转染到CHO哺乳动物细胞中。IgG被表达并分泌到培养基中。将收获物汇集并过滤，并使用蛋白A色谱法纯化IgG。将培养物上清液上样至陶瓷蛋白A(Ceramic Protein A)(BioSepra)的适当大小的柱子上，并用50mM Tris-HCl pH 8.0、250mM NaCl洗涤。将结合的IgG使用0.1M柠檬酸钠(pH 3.0)从柱上洗脱并且通过添加Tris-HCl(pH 9.0)进行中和。洗脱材料使用Nap10柱(阿默舍姆(Amersham)，#17-0854-02)17-0854-02)缓冲交换至PBS中，并使用基于IgG的氨基酸序列的消光系数通过分光光度来确定IgG的浓度(马赫(Mach)等人，分析生物化学(Anal Biochem)，200：74(1992))。使用SEC-HPLC和SDS-PAGE对纯化的IgG进行聚集和降解的分析。

实例2-抗-LOX1抗体抑制多配体结合、oxLDL内化和oxLDL诱导的信号传导

测试纯化的IgG特异性抑制氧化低密度脂蛋白(“oxLDL”)、牛血清白蛋白的晚期糖基化终产物(“AGE-BSA”)和C-反应蛋白(“CRP”)结合至LOX1的能力，如实例10、测定1、2和3中所述。测试几种分离的克隆(包括LOX10514和LOX10696以及可商购的小鼠抗-LOX1抗体(23C11))阻断oxLDL、AGE-BSA和CRP结合至LOX1的能力。代表性曲线图示出在图1A、1B和1C中，这些图通过LOX514和LOX696分别示出对oxLDL、AGE-BSA和CRP结合的抑制。为确认抗体交叉反应，且对LOX1 SNP K167N具有功能活性，测试抗体阻断oxLDL结合至LOX1 SNP K167N的能力。LOX1 SNP K167N(GenBank登录号AB102861)是最初在患有局部缺血性心脏病的患者家族中发现的天然存在的人类LOX1变体，且认为与心肌梗塞风险增加相关。参见例如，龙口(Tatsuguchi)等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)28；303(1)：247-50(2003)。代表性曲线图示出在图1D中，该图示出LOX514和LOX696两者均阻断oxLDL结合至LOX1 SNP K167N变体。除抑制结合以外，还测试几种分离的克隆(包括LOX10514和LOX10696)阻断表达LOX1的细胞上的oxLDL内化(如实例10，测定4中所述)和oxLDL诱导的LOX1信号传导(如实例10，测定5中所述)的能力。图2A和2B中分别示出抑制oxLDL内化和信号传导的代表性曲线图。这些研究的结果汇总在表2中。

表2：抑制oxLDL内化

这些结果证明：(1)通过抗体LOX514和LOX696特异性地抑制LOX1结合至oxLDL、AGE-BSA和CRP；(2)LOX514和LOX696在功能上均与常见LOX1 SNP K167N变体交叉反应；(3)LOX514和LOX696抑制oxLDL内化；且(4)LOX514和LOX696抑制oxLDL-诱导的LOX1信号传导。

实例3-抗-LOX1抗体物种交叉反应性和对人类LOX1的特异性超过一组人类相关家族成员

通过scFv结合ELISA评估抗-人类LOX1抗体对各种LOX1物种直系同源物的交叉反应性。将人类(Uniprot：P78380)、小鼠(Uniprot：Q9EQ09)、大鼠(Uniprot：O70156)、兔(Uniprot：Q9XTA8)和食蟹猴LOX1的胞外结构域构建体设计成具有N或C端Flag和组氨酸标记，并克隆到Gateway目的载体(英杰(Invitrogen))中。然后使构建体转染入哺乳动物HEK293 EBNA细胞中以表达蛋白。然后蛋白质经历了标准亲和和尺寸排阻色谱纯化。简而言之，将人类(HisFlag)-LOX1、食蟹猴LOX1-(FlagHis)、小鼠LOX1-(FlagHis)、大鼠LOX1-(FlagHis)和兔LOX1-(FlagHis)分别以10、10、5、5和5μg/mL涂布在MAXISORP^TM板上的PBS缓冲液中。利用这些浓度包覆的有效抗原首先通过利用商业抗-人类LOX1(来自Hycult的23C11)或抗-His(铕标记的，来自珀金埃尔默(Perkin Elmer))抗体的ELISA检查。用含3％奶粉的PBS封闭孔后，在PBS加3％奶粉中的纯化的抗-LOX1 scFv与不同的包覆的抗原孵育1小时。利用100ng/mL的次级铕标记的抗-Myc标记抗体(珀金埃尔默)检测结合的scFv分子。利用340nm激发和615nm发射读取板的荧光。在以10μg/mL包覆的牛血清白蛋白(新英格兰生物实验室)上测定非特异性结合。

如图3A中所示，LOX514(“LOX10514”)和LOX696(“LOX10696”)结合至人类和食蟹猴LOX1，但不结合至小鼠、大鼠或兔LOX1直系同源物。考虑到这些物种间的C类凝集素的低同源性(人类与小鼠间为约62％一致性)，缺少对小鼠LOX1的抗体交叉反应性并不令人意外。

通过IgG结合ELISA评估抗-人类LOX1抗体分子对其他人类C型凝集素和清道夫受体相关分子的特异性，如实例10测定6中所述。如图3B中所示，LOX514(“LOX10514”)和LOX696(“LOX10696”)只结合至人类LOX1，且不结合至人类CLEC-7A、CLEC-1A、CLEC-4L、CLEC-1B、SR-A1和SR-B3。该结果证明LOX514和LOX696对LOX1的特异性。

实例4-通过LOX514的靶向CDR随机化和重组来分离和鉴定效力优化的抗-LOX1scFv抗体

利用基于亲和力的噬菌体筛选优化LOX514。源自LOX514 scFv序列的大scFv文库是通过利用如所述的标准分子生物技术对可变重链(VH)互补决定区2或3(VH-CDR2或VH-CDR3)或者可变轻链(VL)互补决定区3(VL-CDR3)进行寡核苷酸定点诱变而建立(克拉克森T.(Clackson，T.)和洛曼(Lowman)，H.B.噬菌体展示-实用方法，2004.牛津大学出版社)。文库经受基于基于亲和力的噬菌体展示筛选以便选择具有针对人类LOX1的更高亲和力的变体。预期这些示出针对LOX1结合至oxLDL和其他LOX1配体的提高的抑制活性。基本上如先前所述进行筛选(汤普森等人，分子生物学杂志256(1)：77-88，(1996))。简单地说，scFv-噬菌体颗粒与重组生物素化的人类LOX1在溶液中孵育(利用EZ LINK^TM磺基-NHS-LC-生物素(Thermo/Pierce，产品：21335)经由游离胺生物素化)。然后，遵循制造商建议将结合至抗原的ScFv捕获于链霉亲和素涂布的顺磁性珠粒(M-280)上。然后，所选择的scFv-噬菌体颗粒如先前描述(奥斯本(Osboum)等人免疫技术，2(3)：181-96，(1996))进行挽救，并且将选择过程在递减浓度的生物素化人类LOX1的存在下重复(在四轮中典型实例将为50nM至20pM)。

将含scFv的粗周质提取物针对来自CDR-靶向筛选输出的代表数量的单独scFv进行制备，并在针对亲本抗体LOX514的表位竞争(均相时间分辨荧光)测定形式中进行筛选，如实例10测定7中所述。将与亲本LOX514相比时示出显著改进的抑制效果的筛选命中物即scFv变体经历DNA测序，并且将来自可变重链CDR2或CDR3和可变轻链文库CDR3输出的独特变体作为纯化scFv产生并测试。然后筛选一些scFv，并转化为IgG1-TM以进行进一步表征。按照这种方法获得的优化的LOX514抗体的典型实例包括：LX5140011、LX5140014、LX5140016和LX5140038(如表1或图4中所述)。

为产生进一步改进，将包含大量能够抑制亲本LOX514结合至人类LOX1的scFv变体的CDR-随机化筛选输出进行重组以形成文库，在这些文库中克隆含有随机配对的单独随机化VH CDR2和VH或VL CDR3序列。

在表位竞争测定中，针对来自重组VH2/VH3或VH2/VL3文库的代表数量的单独scFv制备含scFv的粗周质提取物。将与亲本scFv相比时示出显著改进的抑制效果且导致产生预先重组的筛选命中物即scFv变体经历DNA测序，并且将独特的重组变体作为纯化scFv产生并测试。然后选择活性最大的scFv，并转化为IgG1 TM以进一步表征。从这些重组文库获得的优化LOX514抗体的典型实例是：LX5140092、LX5140093、LX5140094、LX5140108和LX5140110(如表1或图4中所述)。

所选择的来自LOX514谱系的抗体的优化重链的氨基酸序列的比对示出在图4A中。所选择的来自LOX514谱系的抗体的优化轻链的氨基酸序列的比对示出在图4B中。

实例5-分离和鉴定源自LOX696的效力优化的抗-LOX1 scFv变体将LOX696首先利用基本上如EP 494955、US 5658754和哈内斯(Hanes)等人(汤普森(Thompson)等人，分子生物学杂志256(1)：77-88(1996))所述的基于亲和力的核糖体展示筛选来优化。

源自LOX696 scFv序列的大scFv文库(呈核糖体展示形式)是通过利用如所述的标准分子生物技术对可变重链(VH)互补决定区2或3(VH-CDR2或VH-CDR3)或者可变轻链(VL)互补决定区3(VL-CDR3)进行寡核苷酸定点诱变而建立(汤普森等人，分子生物学杂志256(1)：77-88(1996))。在DNA水平上，将T7启动子添加在5′-端，以有效地转录为mRNA。在mRNA水平上，构建体含有原核生物核糖体结合位点(夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列)。在单链的3′-端，移除终止密码子，并添加M13细菌噬菌体gIII(基因III)的一部分作为初生scFv多肽与核糖体之间的间隔区(汤普森等人，分子生物学杂志256(1)：77-88(1996))。

文库经受基于基于亲和力的核糖体展示筛选以便选择具有针对人类LOX1的更高亲和力的变体。预期这些示出针对LOX1结合至oxLDL和其他LOX1配体的提高的抑制活性。利用RIBOMAX^TM大规模RNA生产系统(T7)(普洛麦格(Promega))，按照制造商方案，以及无细胞翻译系统在体外表达scFv。将产生的scFv抗体-核糖体-mRNA(ARM)复合物与生物素化的人类LOX1(利用EZ LINK^TM磺基-NHS-LC-生物素(Thermo/Pierce，产品：21335)经由游离胺生物素化)在溶液中孵育。遵循制造商建议(Dynal)将特异性结合的三元复合物(LOX1：ARM)捕获在链霉亲和素涂布的顺磁性珠粒(M-280)上，同时洗掉未结合的ARM。然后将编码结合的scFv的mRNA通过逆转录-PCR(RT-PCR)恢复。选择过程是在所得群体上以递减浓度的生物素化人类LOX1(在4轮中1μM至最少2nM)重复另外的几轮选择，以富集对LOX1具有较高亲和力的克隆。将来自第2、3和4轮选择的输出亚克隆于pCantab6(1)中，以便细菌表达为scFv，并在LOX696表位竞争(参见实例10，测定7)中将改进的克隆作为周质提取物鉴定，如实例4中所述。

基于LOX696 CDR随机化核糖体展示输出或变体来构建第二代噬菌体展示文库。总共产生四个文库：(1)通过将均来自第2轮输出的VH CDR2序列与VL CDR3序列重组；(2)通过使用DIVERSIFy^TM PCR随机诱变试剂盒(BD生物科学)，遵循制造商建议对重组VH CDR2 X VLCDR3文库(见上文)进行另外的易错PCR，以掺入其他序列多样性；(3)通过利用如上所述的易错PCR对整个scFv序列进行随机诱变，它使用等摩尔比例的一组来自早期核糖体展示文库的9个scFv DNA命中物加上LOX696的亲本scFv DNA作为模板；(4)如盖洛普MA(GallopMA)等人，药物化学杂志(J Med Chem)，37(9)：1233-51(1994)中所述对整个VH CDR3进行软随机化，它使用等摩尔比例的一组来自早期核糖体展示VL CDR3文库的6个scFv DNA命中物加上LOX696的亲本scFv DNA作为模板。

如实例4中所述用递减浓度的生物素化LOX1(在四轮中通常从100nM至2pM)进行噬菌体展示筛选。针对来自不同的第2代生成文库的代表数量的单独scFv制备含scFv的粗周质提取物，并在表位竞争中测试(如实例10，测定7中所述)。再次对给出最大结合竞争力的ScFv变体测序，并如实例1中所述来制备纯化的scFv以用于测试。将来自那些第二代文库的最有效scFv转化为IgG1 TM形式，以用于如后面实例中所述的进一步表征。

获得自这些第二代文库的优化的LOX696抗体的典型实例包括：LX6960067_ngl1、LX6960071_ngl1、LX6960073_ngl1、LX6960086_ngl1、LX6960094_ngl1、LX6960101_ngl1、LX6960102_ngl1和LX6960116_ngl1(如表1或图5中所述)。

所选择的来自LOX696谱系的抗体的优化的VH的氨基酸序列的比对示出在图5A中。所选择的来自LOX696谱系的抗体的优化的VL的氨基酸序列的比对示出在图5B中。

实例6-将抗-LOX1抗体作为IgG1-TM进行种系化和稳定性工程化

将LOX514VH和VL的氨基酸序列与VBASE数据库中已知的人类种系序列进行比对(汤姆林森I.(Tomlinson，I.)，VBASE.1997，蛋白质工程MRC中心，剑桥，英国)，并通过序列相似性鉴定最接近的种系。对于VH结构域，这是VH1-24(DP-5)和JH6，对于VL结构域，它是Vλ1-e(DPL-8)和JL3。位于重链的框架4中的两处比对只有一处不同。该单个残基(R105-卡巴特编号)在IgG转化过程中已经通过标准分子生物学回复为种系残基(Q)，意味着来自LOX514谱系的所有优化的IgG实际上都以种系化形式产生。此外，进行重链N96D诱变(卡巴特编号)，以去除LX5140092和LX5140093的CDR3中的潜在N-脱酰胺基序。变体分别命名为LX5140092_N＞D和LX5140093_N＞D(参见表1或图4)。图4A和4B中分别提供了LX5140092_N＞D和LX5140093_N＞D的重链和轻链氨基酸序列的比对。

相似地，还进行LOX696抗体的种系分析。对于重链，最接近的种系被鉴定为VH3-09(DP-31)和JH3，并且对于轻链，被鉴定为Vλ2a2(DPL-11)和JL3。排除游标(Vernier)残基(富特(Foote)等人，分子生物学杂志(J Mol.Biol.)，224：487(1992))，总共检测到五处差异，全部在VH中：两处在框架1中，一处在框架3中，且两处在框架4中。优化的LOX696 IgG1-TM序列中的差异通过标准分子生物技术回复到最接近的种系残基，V89除外：Q1E、Q6E、R105Q和T108M。此外，进行重链G82bS诱变(卡巴特编号)，以去除种系化LX6960073_gl的框架3中的潜在N-脱酰胺基序(参见表1或图5)。变体命名为LX6960073_G82bS_gl(参见表1或图5)。图5A和5B中分别提供了非种系化LX6960073_ngl1、种系化LX6960073_gl和LX6960073_G82bS_gl的重链和轻链氨基酸序列的比对。

实例7-优化的抗-LOX1抗体的特异性和物种交叉反应性

通过IgG结合ELISA评估优化的抗-人类LOX1抗体作为IgG1-TM对其他人类C型凝集素和清道夫受体相关分子的特异性(如实例10，测定7中所述)。相关分子组包括人类CLEC-7A(Dectin-1)、人类CLEC-1A、人类CLEC-4L(DC-SIGN)、人类CLEC-1B(CLEC-2)、人类SR-A1和人类SR-B3(CD36)。还涂布人类LOX1作为结合的阳性对照。测试以下优化的抗体：LX5140108、LX5140110、LX5140092_N＞D、LX5140093_N＞D、LX6960073_gl和LX6960073_G82bS_gl。将同种型人类IgG1-TM对照抗体NIP228纳入抗体组中，以测试确定非特异性背景水平。

如图6中所示，所有优化的抗-LOX1抗体结合人类LOX1，但不结合人类CLEC-7A、CLEC-1A、CLEC-4L、CLEC-1B、SR-A1或SR-B3，从而证明LX5140108、LX5140110、LX5140092_N＞D、LX5140093_N＞D、LX6960073_gl和LX6960073_G82bS_gl对人类LOX1的特异性。

通过IgG结合ELISA评估抗-人类LOX1抗体对各种LOX1物种直系同源物的交叉反应性(如实例10，测定7中所述)。简而言之，将人类(HisFlag)-LOX1、食蟹猴LOX1-(FlagHis)、小鼠LOX1-(FlagHis)、大鼠LOX1-(FlagHis)和兔LOX1-(FlagHis)以5μg/mL涂布在MAXISORP^TM板上的PBS缓冲液中。用含3％奶粉的PBS封闭后，将在封闭缓冲液中的10μg/mL纯化的抗-LOX1 IgG1-TM与涂布的不同抗原孵育。利用100ng/mL的次级铕标记的抗-人类IgG抗体(珀金埃尔默)检测结合的IgG分子。利用340nm激发和615nm发射读取板的荧光。测定对也以5μg/mL涂布的CD86 FlagHis抗原的非特异性结合。测试以下优化的LOX1抗体，并且NIP228人类IgG1-TM作为阴性对照：LX5140108、LX5140110、LX5140092_N＞D、LX5140093_N＞D、LX6960073_gl和LX6960073_G82bS_gl。如图7A中所示，所有测试的抗体(LX5140108、LX5140110、LX5140092_N＞D、LX5140093_N＞D、LX6960073_gl和LX6960073_G82bS_gl)结合至人类和食蟹猴LOX1，但不结合至小鼠或大鼠LOX1蛋白。那些抗体中有一些(LX5140108、LX5140110和LX5140092_N＞D)还结合至兔LOX1，但程度小于人类或食蟹猴LOX1，这是通过较小荧光计数证明。

另外，通过竞争ELISA针对优化的抗-LOX1 IgG1-TM抗体LX5140108、LX5140110和LX6960073_G82bS_gl进行人类与食蟹猴LOX1间的交叉反应性表征。

简单地说，将在PBS中的0.125μg/mL生物素化的人类LOX1涂布在链霉亲和素板(Abgene)上。用含3％奶粉的PBS封闭后，将在封闭缓冲液中的12.5ng/mL纯化的抗-LOX1IgG1-TM与竞争者人类或食蟹猴LOX1蛋白共同孵育。使用竞争者在封闭缓冲液中的1∶3滴定，对于LX5140108和LX5140110以400nM开始，且对于LX6960073_G82bS_gl以2μM开始。利用100ng/mL的次级铕标记的抗-人类IgG抗体(珀金埃尔默)检测结合的LOX1 IgG分子。利用340nm激发和615nm发射读取板的荧光。

如图7B和下表3中所示，所有三种优化的抗-LOX1 IgG1-TM(LX5140108、LX5140110和LX6960073_G82bS_gl)与食蟹猴LOX1竞争，且对于人类LOX1竞争呈现5倍IC50内的IC50，证明抗-LOX1抗体LX5140108、LX5140110和LX6960073_G82bS_gl的食蟹猴交叉反应性很强。

表3：结合至食蟹猴LOX1和人类LOX1的优化的抗体

实例8-如通过BIACORE^TM和KinExATM测定，优化的抗-LOX1抗体对hLOX1的亲和力

抗-LOX1抗体对重组人类和食蟹猴直系同源物LOX1胞外结构域(ECD)的亲和力是在37℃下通过Biacore(针对人类和食蟹猴)利用实时交互监测来测定，并利用KinExA(针对人类LOX1亲和力测量)处于平衡。

在Biacore测定中，重组蛋白G+被蛋白G捕获的抗-LOX1抗体通过连接至CM5芯片表面的胺固定，并收集LOX1直系同源物通过表面的结合和解离特征。进行测定，其中IFC温度设定在37℃，且样品室维持在环境温度。进行所有实验，其中HBSEP运行缓冲液以恒定的30ul/min通过IFC。在每次施加LOX1结束时，通过两个40秒脉冲的10mM甘氨酸pH 1.5从蛋白G去除任何结合的抗体和抗体-复合物。调整捕获在蛋白G表面上的抗-LOX1抗体的量，首先是为了避免质量运输限制，其次是为了确保可观测到足够的解离，以精确建模。LOX1相互作用物的浓度范围足以确保观察到整个结合范围，从抗体饱和到没有可检测的结合。利用BiaEval评估软件分析数据，然后对只有抗体的特征进行双参考减法。

在单一浓度的抗LOX1抗体下进行溶液中平衡测定，其中使得重组人类LOX1 ECD的滴定为比抗体浓度高100倍至比抗体浓度低100倍。通过捕获后来通过荧光标记的人类-Fc特异性探针检测的未占用抗体测定游离抗体浓度。表4详细描述观察到的速率常数和总体亲和力。

表4：LX5140110亲和力和速率常数

实例9优化的抗-LOX1抗体证明抑制多配体结合、oxLDL内化和oxLDL诱导的信号传导

测试纯化的IgG特异性地抑制oxLDL、AGE-BSA和CRP结合至LOX1的能力(参见实例10；测定1、2和3)。测试几种分离的克隆(包括LX5140110和LX6960073_G82bS_gl)阻断oxLDL、AGE-BSA和CRP结合至LOX1的能力。代表性曲线图示出在图8A、8B和8C中，这些图通过LX5140110和LX6960073_G82bS_gl分别示出对oxLDL、AGE-BSA和CRP结合的抑制。为确认抗体交叉反应，且对LOX1 SNP K167N具有功能活性，测试抗体阻断oxLDL结合至LOX1 SNPK167N的能力。代表性曲线图示出在图8D中，该图示出LX5140110和LX6960073_G82bS_gl两者均阻断oxLDL结合至LOX1 SNP K167N变体。除抑制结合以外，还测试几种分离的克隆(包括LX5140110和LX6960073_G82bS_gl)阻断表达LOX1的细胞上的oxLDL内化(参见实例10，测定4)和oxLDL诱导的LOX1信号传导(参见实例10，测定5)。代表性曲线图示出在图8A和8F中，这些图分别示出LX5140110和LX6960073_G82bS_gl对oxLDL内化和oxLDL诱导的LOX1信号传导的抑制。这些研究的结果汇总在表5中。

表5：优化的抗-LOX1抗体抑制oxLDL内化和信号传导

这些结果证明抗体LX5140110和LX6960073_G82bS_gl对LOX1结合至oxLDL、AGE-BSA和CRP的特异性多配体抑制，且LX5140110和LX6960073_G82bS_gl都在功能上与常见LOX1 SNP K167N变体交叉反应且抑制oxLDL内化和oxLDL诱导的LOX1信号传导。

实例10测定和方法

将以下材料和方法用于实例1-9中所述的实验中。

材料

盐酸多西环素(西格玛#D9891-1G)；羧基H2DCFDA(分子探针(MolecularProbes)C400)；赫斯特染色(分子探针#33342)；AGE-BSA(Biovision#2221-10)；PBS(Gibco#14190)；重组C-反应蛋白(R&D#1707-CRCF)；BSA 30％(西格玛#A9576)；Lightning Link生物素结合试剂盒(英诺华生物科学(Innova Biosciences)#704-0010)；DyLight 649NHS ESTER(赛默科技#46416)；塞弗尔5E Mono NHS；酯(GE医疗#PA15401)；HBSS(1X)(GIBCO#14025)；康宁384细胞；结合黑测定板(康宁柯斯达#3683)；Delfia增强溶液(珀金埃尔#4001-0010)；铕链霉亲和素(珀金埃尔默#1244-360)；0.5mL Zeba脱盐柱(皮尔斯#89883)；CHO-TREx(英杰#R718-07)；oxLDL(Intracel#RP049)；DiI-oXLDL(Intracel#RP-173)；抗-LOX1抗体(Biovision#3659)；赫斯特染色(分子探针#33342)；PBS(Gibco#14190)；生长培养基：Hams：F12-GlutaMax-I(Gibco#31765-027)；补充有10％胎牛血清(英杰#16000-044)；杀稻瘟菌素(英杰#46-1120)；博莱霉素(英杰#R25001)；脂质转染胺(Lipofectamin)(英杰#11668-019)；盐酸多西环素(西格玛#D9891-1G)。

试剂改性

oxLDL的塞弗尔5E标记

用1/10体积的0.5M硼酸钠缓冲液将ox-LDL(1mg/mL)的pH调节为pH 8.5，并根据制造商试剂盒说明以摩尔比为40∶1的蛋白质∶染料标记oxLDL(1小时，在室温下，在黑暗中)。用Zeba离心柱，根据制造商说明去除未反应的染料(塞弗尔5E Mono NHS酯，来自GE医疗)，并缓冲交换至PBS中。将标记的蛋白保持在4℃黑暗中。为了计算，假定回收超过95％的蛋白，且不考虑稀释因数。

oxLDL和AGE-BSA的DyLight 649标记

用1/10体积的0.5M硼酸钠缓冲液将ox-LDL或AGE-BSA(1mg/mL)的pH调节为pH8.5，并根据制造商试剂盒说明以摩尔比为40∶1的蛋白质∶染料标记(DyLight 649NHS酯，来自赛默科技(Thermo Scientific)，持续1小时，在室温下，在黑暗中)。用Zeba离心柱，根据制造商说明去除未反应的染料，并缓冲交换至PBS中。为了计算，假定回收超过95％的蛋白，且不考虑稀释因数。

人类抗-LOX1抗体的Dylight 649标记

用1/10体积的0.5M硼酸钠缓冲液将人类抗-LOX1抗体(1mg/mL)的pH调节为pH8.5，并根据制造商试剂盒说明以摩尔比为40∶1的蛋白质∶染料标记(DyLight 649NHS酯，来自赛默科技，持续1小时，在室温下，在黑暗中)。用Zeba离心柱，根据制造商说明去除未反应的染料，并缓冲交换至PBS中。为了计算，假定回收超过95％的蛋白，且不考虑稀释因数。

CRP的生物素标记

在蒸馏水中将C-反应蛋白CRP(R&D系统；无载体)重构至4mg/mL的浓度，并根据Lightning-Link^TM生物素结合试剂盒(A型)提供的试剂盒说明书进行生物素化。

人类LOX1 CHO-TREX细胞系3A9

用人类LOX1基因(NM 002543)产生重组质粒pcDNA4/TO-LOX1(pAM2037)，这是由Geneart合成并提供。合成LOX1基因，在5′-端添加Afl II限制位点和Kozak序列，并在3′-端添加EcoRI限制位点。然后利用lipfectamine2000将pAM2037转染到表达四环素阻遏物的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-TREx细胞)中。CHO-TREx是含有pcDNA6/TR的CHO-K细胞系，pcDNA6/TR具有四环素(Tet)阻遏物的基因，该四环素阻遏物将阻断克隆到pcDNA4/TO中的基因的表达。当用四环素处理这些细胞时，释放阻遏作用，并将表达LOX1基因。

利用FACS机器将转染的混合细胞群体分到96孔板中，以在每个孔中获得单个细胞。用10μg/ml杀稻瘟菌素选择pcDNA6/TR，并用300μg/ml博莱霉素选择pcDNA4TO-LOX1质粒，并用200μg/ml用于维持。繁殖单独细胞，并通过它们结合并内化DiI-标记的oxLDL的能力选择稳定克隆，这使用了高含量分析法来量化细胞吸收的荧光。选择一个摄入DiI-oxLDL并在几个生长传代过程中具有稳定性的克隆。通过免疫染色，用来自Biovision的抗-LOX1特异性抗体验证LOX1蛋白表面表达。通过oxLDL摄入和在CHO-TREx-LOX1细胞中产生oxLDL介导的ROS反应证明LOX1蛋白的功能活性。

测定1和2-LOX1：oxLDL和LOX1：AGE-BSA结合测定

饱和结合曲线

以1∶50将DyLight 649标记的oxLDL和AGE-BSA(1mg/mL)稀释在HBSS中，并利用1+1连续稀释在16个点上一式三份地跨384孔板滴定。为测定总结合，向所有孔添加10μL HBSS，随后添加10μL人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/孔)。为测定非特异性结合，10μLHBSS被10μL未标记的oxLDL(1mg/mL)替换。在室温下孵育测定板1小时。孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10；颜色＜0.4且FL1＜5600。如下测定特异性结合：用平均非特异性结合信号减去平均总结合信号，并在Prism Graphpad软件中用一位点特异性结合算法绘制最终结合等温线。使用测定KD的计算浓度进行后续高通量筛选和抗体竞争实验。

评估抗-hLOX1单克隆抗体

如下进行抗-LOX1抗体与DyLight 649标记的配体(oxLDL；AGE-BSA)之间结合至在CHO TREX细胞上表达的LOX1受体的竞争。

无需任何预先稀释使用竞争抗体，并利用在测定缓冲液(HBSS)中的1+1连续稀释在24个点上一式两份地跨384孔板进行滴定(10μL/孔)。将Dylight 649标记的配体(处于其各自KD浓度)添加至所有含抗体的孔(10μL/孔)中，随后添加人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/孔，10μL)或K167N SNP转染的CHO TREX细胞。

在室温下孵育测定板1小时。孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10；颜色＜0.4且FL1＜5600。用4-参数对数方程和GRAPHPAD^TM Prism第5版(GraphPad Inc，加利福尼亚)分析数据，以测定表观IC50值。Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((Log IC50-X)*HillSlope))，其中X是浓度的对数，且Y是特异性结合％。IC50是产生特异性结合的50％抑制的样品浓度。

表6.用于oxLDL和AGE-BSA结合测定中的储备液浓度

测定3-LOX1：CRP结合测定

饱和结合曲线

以在PBS中的3μg/mL浓度将LOX1(R&D系统)固定在384孔Nunc Maxisorp板上过夜，在4℃下过夜(25μL/孔)。第二天，在PBS中洗涤测定板12x(无钙和镁)。在PBS/0.1％BSA/0.01％tween 20中制备20μg/mL(769nM)的生物素化的CRP的工作溶液，并用1+1连续稀释在16个点上一式三份地跨384孔板进行滴定(12.5μL/孔)。将另外12.5μL测定缓冲液(在PBS/0.1％BSA/0.01％tween 20中)添加至每个孔中，并在室温下孵育测定板2小时。在PBS/0.01％Tween 20中洗涤板16x，随后添加50μL铕标记的链霉亲和素(1∶1000稀释)。在室温下另外孵育测定板1小时，随后在PBS/0.01％Tween 20中洗涤16x。通过添加100μL/孔的DELFIA增强溶液使板显色，并在Wallac Victor V读板仪上用工厂安装的DELFA铕方案读取。在Prism Graphpad软件中用一位点特异性结合算法绘制最终结合等温线。使用测定表观K_D的计算浓度进行后续高通量筛选和抗体竞争实验。

评估抗-人类LOX1单克隆抗体

抗体与生物素标记的CRP之间结合重组人类LOX1的竞争是如下进行：以在PBS中的3μg/mL浓度将LOX1(R&D系统)固定在384孔Nunc Maxisorp测定板上，在4℃下过夜(25μL/孔)。第二天，在PBS中洗涤测定板12x(无钙和镁)。无需任何预先稀释使用竞争抗体，并利用在测定缓冲液(PBS/0.1％BSA/0.01％tween 20)中的1+1连续稀释在24点上一式两份地跨384孔稀释板进行滴定(30μL/孔)。然后将生物素标记的CRP(30μL/孔，在K_D浓度下)添加至所有含抗体的孔中。然后用384MiniTrak液体处理机器人将样品(50μL)从稀释板转移到含有固定的重组人类LOX1的测定板中。在室温下孵育板2小时。在PBS/0.01％Tween 20中洗涤板16x，随后添加50μL铕标记的链霉亲和素(1∶1000稀释)。在室温下另外孵育测定板1小时，随后在PBS/0.01％Tween 20中洗涤16x。通过添加100μL/孔的DELFIA增强溶液使板显色，并在Wallac Victor V读板仪上用工厂安装的DELFA铕方案读取。用4-参数对数方程和GRAPHPAD^TM Prism第5版(GraphPad Inc，加利福尼亚)分析数据，以测定表观IC₅₀值。Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((Log IC50-X)*HillSlope))，其中X是浓度的对数，且Y是特异性结合％。IC₅₀是产生特异性结合的50％抑制的样品浓度。

表7.用于CRP结合测定中的储备液浓度

测定4-LOX1：oxLDL内化测定

饱和结合曲线

以1∶50将塞弗尔5E标记的oxLDL(40∶1摩尔比，在1mg/mL下)稀释在HBSS中，并利用1+1连续稀释在16个点上一式三份地跨384孔板滴定。为测定总结合，向所有孔添加10μLHBSS，随后添加10μL人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/细胞)。为测定非特异性结合，10μL HBSS被10μL未标记的oxLDL(1mg/mL)替换。

在37℃下孵育测定板1小时。进行平行实验，其中所有试剂都保持在4℃，以证明内化是代谢活性过程。孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10；颜色＜0.4且FL1＜5600。如下测定特异性结合：用平均非特异性结合信号减去平均总结合信号，并在Prism Graphpad软件中用一位点特异性结合算法绘制最终结合等温线。使用测定K_D的计算浓度进行后续高通量筛选和抗体竞争实验。

评估抗-hLOX1单克隆抗体

抗-LOX1抗体与塞弗尔5E标记的ox-LDL之间对表达LOX1受体的CHO TREX细胞中的内化的竞争是如下进行。

无需任何预先稀释使用竞争抗体，并利用在测定缓冲液(HBSS)中的1+1连续稀释在24个点上一式两份地跨384孔板进行滴定(10μL/孔)。将Dylight 649标记的配体(处于其各自K_D浓度)添加至所有含抗体的孔(10μL/孔)中，随后添加人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/孔，10μL)或K167N SNP转染的CHO TREX细胞。

在室温下孵育测定板1小时。孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10。颜色＜0.4且FL1＜5600。用4-参数对数方程和GRAPHPAD^TMPrism第5版(GraphPad Inc，加利福尼亚)分析数据，以测定表观IC₅₀值。Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((Log IC50-X)*HillSlope))，其中X是浓度的对数，且Y是特异性结合％。IC₅₀是产生特异性结合的50％抑制的样品浓度。

表8.用于oxLDL内化测定中的储备液浓度

测定5-重组CHO-LOX1细胞中的ROS诱导

制备细胞

在开展实验之前24小时用1μg/mL(最终浓度)多西环素诱导人类LOX1转染的CHOTREX细胞。在实验当天，刮取细胞并在1200rpm下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物重新悬浮在50mL PBS中，并在1200rpm下离心5分钟。将此过程重复两次。弃去上清液，并将细胞沉淀物重新悬浮在5mL HBSS中。在血球计上用台盼蓝(Trypan Blue)排除方法对细胞进行计数。调整细胞数量，得到总共4x10⁵个细胞。将细胞保持在冰上，直到使用。

饱和结合曲线

以1∶50将塞弗尔5E标记的oxLDL(40∶1摩尔比，在1mg/mL下)稀释在HBSS中，并利用1+1连续稀释在16个点上一式三份地跨384孔板滴定。为测定总结合，向所有孔添加10μLHBSS，随后添加10μL人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/细胞)。为测定非特异性结合，10μL HBSS被10μL未标记的oxLDL(1mg/mL)替换。

在37℃下孵育测定板1小时。进行平行实验，其中所有试剂都保持在4℃，以证明内化是代谢活性过程。

孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10；颜色＜0.4且FL1＜5600。

如下测定特异性结合：用平均非特异性结合信号减去平均总结合信号，并在PrismGraphpad软件中用一位点特异性结合算法绘制最终结合等温线。使用测定K_D的计算浓度进行后续高通量筛选和抗体竞争实验。

以7000个细胞/孔(100μl/孔，在培养基+10％FCS中(无四环素))将CHO-TREx-LOX1转染的细胞接种在测定板中，并在37℃、5％CO₂下孵育过夜。第二天，以50ng/ml/孔的最终浓度添加多西环素，以诱导LOX表达，并在37℃下在95％O₂/5％CO₂气氛中孵育板过夜。对于每个筛选实验，准备三块独立的板，并且抗-LOX抗体以一个平行测定/板一式三份地进行。第二天，通过将抗体连续稀释在温暖细胞培养基中在独立的稀释板中作为2x浓缩溶液制备抗LOX1抗体。将所有培养基从测定板去除，并将抗-LOX1抗体(2x浓缩溶液)的稀释系列的25μL等分试样添加至测定板的每个孔中，并在37℃下，在95％O₂/5％CO₂气氛中孵育20分钟。随后添加25μL/孔的oxLDL(以25μg/ml的固定最终浓度)，并在37℃下在95％O₂/5％CO₂中孵育板60分钟。

然后用1x100μl温HBSS/Ca/Mg小心洗涤孔，随后添加50μl/孔的羧基-H₂DCFDA(1.5μM于温HBSS/Ca/Mg中)，并孵育测定板30分钟。在用羧基-H₂DCFDA孵育的最后5分钟期间，在温HBSS/Ca/Mg中用赫斯特染色(最终浓度8.3μg/ml)给细胞进行复染，方法是通过将在温HBSS/Ca/Mg中的10μl 50μg/ml赫斯特添加至已经存在于孔中的羧基-H₂DCFDA。

然后用温HBSS+Ca/Mg洗涤测定板2x，并立即在Arrayscan高含量读板仪(赛默飞世尔科技(ThemoFischerScientific)，细胞组学(Cellomics))上用XF53-赫斯特(Hoechst)(Ch1)和XF53-FITC(Ch2)设定来读取。为分析图像，使用Compartemental BioApplication算法，并通过CircSpotAvgIntensity参数来对由ROS探针所产生的荧光进行定量。绘制竞争性数据和最终IC50，并在ExcelFit 5.1中使用用4参数对数模型的S形剂量-反应一-位点-零(one-site-zero)模型(模型903)计算。

测定6-LOX1特异性ELISA

基本上如下对下表9中所列的LOX1和LOX1-相关分子进行IgG特异性ELISA。用在PBS中的5μg/mL抗原涂布MAXISORB^TM(NUNC)板，并在4℃下孵育过夜，除了人类SR-B3采用10μg/mL。用PBS洗涤板3x，并用200μL/孔封闭缓冲液(PBS+3％奶粉)封闭1小时。用PBS洗涤板3x后，在封闭缓冲液中将IgG稀释至0.2μg/mL，以50μL/孔添加，并孵育1小时。然后用PBS-Tween洗涤板3x，添加检测试剂(抗-人类IgGλ轻链过氧化物酶轭合物(西格玛A5175，以0.23μg/mL稀释)或κ轻链(西格玛A7164，以0.8μg/mL稀释))(50μL/孔于封闭缓冲液中)，并孵育板1小时。用PBS-Tween洗涤板3x，添加50μL/孔的TMB，并让板显色5-15分钟。用50μL/孔0.1MH₂SO₄，淬灭反应，并在ENVISION^TM读板仪或相似设备上以450nm读取板。

表9.用于LOX1特异性ELISA中的试剂

测定7-表位竞争

如上文在蛋白改性部分描述的，将LOX514和LOX696用DyLight 649标记，并用作高通量筛选和并行分析配体结合测定的竞争分子。以各高于其各自K_D浓度的浓度使用标记的抗体，以使得较高亲和力的未标记的抗体较难以竞争。

测定DyLight 649标记的LOX514和LOX696的K_D

以1∶50将Dylight 649标记的人类抗-LOX1抗体稀释在HBSS中，并利用1+1连续稀释在16个点上一式三份地跨384孔板滴定。为测定总结合，向所有孔添加10μL HBSS，随后添加10μL人类LOX1转染的CHO TREX细胞(4000个细胞/细胞)。为测定非特异性结合，10μLHBSS被10μL未标记的人类抗-LOX1抗体(1mg/mL)替换。

在室温下孵育测定板1小时。

孵育后，在应用生物系统公司8200细胞检测系统(FMAT读板仪)上用422的PMT1设定来读取板，最小计数设定为10；颜色＜0.4且FL1＜5600。

如下测定特异性结合：用平均非特异性结合信号减去平均总结合信号，并在PrismGraphpad软件中用一位点特异性结合算法绘制最终结合等温线。以超过和高于计算K_D浓度数倍的浓度使用抗体。

表10.LOX514和LOX696表位竞争测定的储备液浓度

实例11-抗-LOX1抗体在组织培养物中和在人类血管中对内皮脂质摄入、细胞信号传导和一氧化氮体内平衡的影响

LOX1受体通过OxLDL的特异性连接和内化与后续多个胞内信号转导级联的活化充当致粥样硬化过程的一个直接原因。参见例如，托戈(Twigg)等人，心脏病学研究和实践(Cardiol Res Pract.)2012：632408(2012)。内皮细胞中LOX1受体的活化促进内皮功能紊乱，包括ROS产量增加和部分通过精氨酸酶2上调而诱导的受损的一氧化氮(NO)信号传导。(参见例如，里奥(Ryoo)等人，动脉粥样硬化214(2)：279-287(2011)，里奥等人，循环研究102(8)：923-932(2008)；和里奥等人，循环研究99(9)：951-60(2006)。此外，LOX1受体活化导致血管壁中的炎症过程的起始和延续，伴随细胞因子产量增加并表达粘附分子。因此，LOX1受体的生物抑制剂的发展将有可能成为减缓致粥样硬化过程发展的有效方式。这里，我们证明LX5140110以剂量依赖方式阻断人类主动脉内皮细胞(HAEC)摄入OxLDL。此外，LX5140110防止精氨酸酶2活化，这一过程先前被证明具有LOX1依赖性。此外，LX5140110防止NO产生中的Ox-LDL-依赖性降低和超氧化物(ROS)产量的增加。此外，利用NFkB荧光素酶报告物构建体，我们证明了LX5140110显著地减弱NFkB的活化，该NFkB是动脉粥样化形成中的主要炎症调节剂。参见例如，帕木库(Pamukcu)等人，血栓形成研究128(2)：117-23(2011)。最后，LX5140110抗体防止粘着斑激酶(FAK)磷酸化和活化-在内皮细胞中的屏障功能起关键作用的过程。因此，我们证明LX5140110阻断几种导致内皮活化以及起始和促进动脉粥样化形成的LOX1-依赖性过程。依次讨论这些实验的结果。

A.LX5140110阻断OxLDL摄入于HAEC中(图9A)

方法：

OxLDL与Alexa Fluor-568轭合

利用Alexafluor-568蛋白标记试剂盒(分子探针，尤金，俄勒冈州)，遵循制造商方案，用Alexafluor-568标记500微升人类氧化LDL(1mg/ml，Intracel，弗雷德里克，马里兰州)。简单地说，将OxLDL与Alexafluor-568在0.1M碳酸氢盐(pH 8.3)在室温下孵育一小时。然后用纯化树脂柱纯化Alexafluor-568-轭合-OxLDL。

HAEC摄入Alexa Fluor-568-轭合-OxLDL

将HAEC在含血清培养基中接种在涂布纤连蛋白(10μg/ml)的盖玻片上八小时，然后血清饥饿18小时。

然后将细胞与0、0.5、1、5或10nM LX5140110((“514”)或10nM对照抗体NIP在无血清培养基中孵育一小时。用新无血清培养基完全洗掉抗体，然后将约50ng/mlAlexaFluor568-OxLDL添加至培养基中摄入一小时。然后用在3％多聚甲醛(西格玛)中的0.5％Triton X-100(飞世尔科技(Fisher Scientific))使细胞透性化2分钟，随后用3％多聚甲醛固定20min。用荧光素鬼笔环肽(生命技术公司(Life Technologies)，格兰德岛，NY)和DAPI(生命技术公司)标记固定的细胞，并在表面荧光尼康TE-200显微镜(epifluorescence Nikon TE-200microscope)上观察。用具有Volocity软件(珀金埃尔默，列克星敦，MA)的Rolera EMCCD相机(QImaging，温哥华，加拿大)拍照。用Volocity软件，通过对HAEC细胞内的Alexafluor-568-轭合-OxLDL红色荧光颗粒(排除尺寸小于0.1μm2的颗粒)进行计数来进一步分析图像(图像未显示)。每组获取约12幅图，并分析每个细胞中的Alexafluor-568-轭合-OxLDL红色荧光颗粒的平均数量。剂量反应数据示出在图9A中(每个细胞的囊泡数量和标准偏差)。如图9A中所示，5nM或10nM LX5140110显著抑制HAEC摄入OxLDL(对应地，p＝0.0003或p＝0.0002)。

B.LX5140110减弱HAEC中的NFkB信号传导(图9B)

方法：共表达NFκB-荧光素酶和GFP的HAEC的汇合6孔板经过血清饥饿24小时，然后使它们经历以下条件(数字指示图9B中从左往右的棒)：1.对照；2.只有OxLDL(50μg/ml)；3.OxLDL+LX5140110(″514″)(10nM)；4.OxLDL+NIP(对照抗体)(10nM)。

抗体在OxLDL之前1小时添加(50μg/ml)。与OxLDL额外孵育8个小时。将细胞裂解，并经历荧光素酶活性测定(普洛麦格)，并用FlexStation 3酶标仪(分子装置公司)测定发光。简单地说，用普洛麦格5x裂解缓冲液裂解HAEC，并将上清液接种在每个孔中含有50μl普洛麦格底物的白板中。转染48小时后，在冰冷的改性裂解缓冲液中裂解细胞，该裂解缓冲液由20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％NP40、1％脱氧胆酸钠、1mMNa₃VO₄、2.5mM焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸盐、1μg/mL亮抑酶肽和1∶1000稀释的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛)组成。添加加样缓冲液，至2x最终浓度，煮沸5min，旋转3分钟并加样在凝胶中。使用GFP荧光作为标准化对照。对于每组，N＝5；*指示P＜0.05(与未处理的对照相比)；#指示P＜0.05(与OxLDL+0nM ab 514(LX5140110)相比。如图9B中所示，添加10mM LX5140110但不添加NIP(对照抗体)显著减少HAEC中的OxLDL-依赖性NFkB信号传导。这表明，LX5140110能够抑制LOX1-依赖性NFkB活化，该活化是良好确立于LOX-1受体下游的信号传导途径。参见例如，赵(Zhao)W等人，“脂多糖通过TLR4/MyD88/ROS活化的p38MAPK-NF-κB途径诱导LOX-1表达(Lipopolysaccharide induced LOX-1expression via TLR4/MyD88/ROSactivated p38MAPK-NF-κB pathway)”血管药理学(Vascul Pharmacol.)(2014)。

C.LX5140110抑制HAEC中精氨酸酶的活化(图9C)

方法：HAEC的汇合6孔板经过血清饥饿24小时，然后使它们经历以下条件(数字指示图9C中从左往右的棒)：1.对照；2.OxLDL(50μg/ml)；3.OxLDL+LX5140110(“514”)(1nM)；4.OxLDL+LX5140110(“514”)(3nM)；5.OxLDL+LX5140110(“514”)(10nM)；6.OxLDL+NIP(10nM)。添加抗体，1小时后将HAEC与OxLDL(50μg/ml)又孵育3小时。裂解细胞，并利用尿素测定使用α-异亚硝基苯丙酮来测定精氨酸酶活性。简单地说，制备提取的细胞裂解物的上清液，然后与裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1mM EDTA和蛋白酶抑制剂)在4℃下孵育30分钟，并在14,000x g和4℃下离心20分钟。然后将上清液与150mM L-精氨酸在37℃下孵育1小时。1小时后，利用400μl酸溶液混合物(H2SO∶H3P04∶H2O 1∶3∶7)使反应停止，然后添加25μl 9％α-异亚硝基苯丙酮(在100％EtOH中)，并在95℃下加热30分钟，并在10分钟后在540nm下读取。对于每组，N＝3；*指示P＜0.05，与未处理的对照相比；#指示P＜0.05，与0nM ab 514(LX5140110)相比。如图9C中所示，添加3nM或10nM LX5140110但不添加10nMNIP(对照抗体)以剂量依赖方式显著降低HAEC中的OxLDL-依赖性精氨酸酶活性。这进一步表明，LX514110抑制精氨酸酶2的LOX1-依赖性活化，该活化是最近被证明与血管内皮中与LOX-1偶联的下游信号传导途径。参见例如，里奥(Ryoo)等人，动脉粥样硬化214：279-87(2011)。

D.LX5140110阻断一氧化氮产生中的OxLDL-依赖性减少(图9D)

方法：利用DAF荧光测定NO产生。简单地说，为测定NO，以约5x10⁴个细胞/孔的密度将HAEC细胞接种在白色96-孔板(ThermoLabsystems)中，并经过血清饥饿(1％血清)过夜。7个实验组中研究的细胞(数字指示图9D中从左往右的棒)：1.对照；2.OxLDL(50μg/ml)；3.OxLDL+LX5140110(“514”)(0.5nM)；4.OxLDL+LX5140110(“514”)(1nM)；5.OxLDL+LX5140110(“514”)(5nM)；6.OxLDL+LX5140110(“514”)(10nM)；7.OxLDL+NIP(10nM)。添加抗体，1小时后将HAEC与OxLDL(50μg/ml)孵育24小时。然后去除培养基，并在37℃下将细胞在37℃放置在含有DAF-FM DA(5μM)的EBM2培养基中30分钟。然后用新的培养基替换培养基，并再孵育细胞20分钟，然后用FlexStation 3酶标仪(分子装置公司)在激发495nm和发射515nm下测量总荧光。为证实NO是由eNOS生产，使用NOS抑制剂L-NAME作为对照(未示出数据)。对于每组，N＝5；*指示P＜0.05(与未处理的对照相比)。如图9D中所示，添加5nM或10nMLX5140110但不添加10nM NIP(对照抗体)以剂量依赖方式显著抑制HAEC的一氧化氮产生中的OxLDL-依赖性减少。

E.LX5140110阻断ROS产生中的OxLDL-依赖性增加(图9E和9F)

方法：利用鲁米诺类似物L-012测定超氧化物产生。为测量超氧化物(ROS)，以约5x10⁴个细胞/孔的密度将HAEC细胞铺板在白色的TC-处理的96-孔板(ThermoLabsystems)中，并经过血清饥饿(1％血清)过夜。7个研究群体如下(数字指示图9E中从左往右的棒)：1.对照；2.OxLDL(50μg/ml)；3.OxLDL+LX5140110(“514”)(0.5nM)；4.OxLDL+LX5140110(“514”)(1nM)；5.OxLDL+LX5140110(“514”)(5nM)；6.OxLDL+LX5140110(“514”)(10nM)；7.OxLDL+NIP(10nM)。添加抗体，1小时后将HAEC与OxLDL(50μg/ml)孵育24小时。然后去除培养基，并在37℃下在含有400μM鲁米诺类似物L-012(Wako)的无苯酚DMEM(西格玛)中再孵育最少20分钟，之后添加激动剂。利用FlexStation 3酶标仪(分子装置公司)随时间量化发光。通过与超氧化物清道夫SOD(5mM)共孵育确认L-012对活性氧物质的特异性，且这在对照或OxLDL-刺激的条件下产生实质上不可检测的水平的发光(参见图9F)。因此，从L-012的发光量化得到的相对光单位(RLU)指示超氧化物产生的变化。为证实超氧化物是由eNOS生产，使用NOS抑制剂L-NAME作为对照。对于每组，N＝5。如图9E和9F中所示，添加0.5nM、1nM、5nM或10nM LX5140110但不添加10nM NIP(对照抗体)抑制HAEC中的OxLDL-依赖性ROS产生。因此，LX5140110通过防止LOX-1活化和精氨酸酶2的下游活化防止OxLDL-介导的eNOS解偶联和ROS产生的后续增加。参见例如，里奥等人，动脉粥样硬化214：279-87(2011)。

F.LX5140110阻断OxDL介导的对粘着斑激酶(FAK)Y397的磷酸化(图9G和9H)。

方法：用具有5％血清的ECM培养基(ScienCell，卡尔斯巴德，CA)培养HAEC一天，然后血清饥饿18小时。然后以图9G中所示浓度将LX5140110或对照抗体NIP添加至细胞，并孵育一小时。将细胞用新培养基洗涤以去除抗体，然后将它们与50μg/ml OxLDL孵育一小时。用冰冷PBS缓冲液洗涤细胞，然后利用改性的RIPA缓冲液(在PBS中的0.1％DOC、0.1％Trition X-100、2mM EDTA、1mM PMSF、2mM钒酸钠、20mg/ml亮抑酶肽和20mg/ml抑肽酶)提取蛋白。通过以15,000x g在4℃下离心10分钟使细胞裂解物变澄清。然后通过二辛可宁酸测定(皮尔斯，罗克福德，IL)量化蛋白浓度。将10μg蛋白裂解物与2X Laemmli样品缓冲液混合，煮沸，然后利用4％-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶经历SDS-PAGE，随后转移至硝酸纤维膜进行蛋白质印迹法。

用于图9G和9H中所述的实验中使用的一级抗体包括抗-pY397-FAK(兔多克隆，生命技术公司，格兰德岛，NY)和抗-GAPDH(小鼠单克隆，罗福斯生物(Novus Biologicals)，利特尔顿，CO)。从ICN生化公司(Costa，梅萨，CA)获得辣根过氧化物酶-轭合的抗-小鼠和抗-兔二级抗体。

使用学生t检验分析对照、OxLDL-处理的和抗体预孵育的细胞中Tyr397上的FAK磷酸化的差异。图9H中提供P值，并对于所有数据而言显著性(*)被判定为以小于0.05的p值存在。这些图包括标准误差棒。代表性印迹示出在Tyr397处的FAK磷酸化，并将HAEC中GAPDH的表达示出在图9G中，同时将针对GAPDH表达标准化的Tyr397处的FAK磷酸化(pY397-FAK)的百分比增加的量化示出在图9H中。这些结果证明，添加5nM或10nM LX5140110但不添加10nMNIP(对照抗体)显著抑制HAEC中Tyr397处的OxLDL-依赖性介导的FAK磷酸化。*指示P＜0.05(与未处理的对照相比)；#指示与0nM LX5140110(514)相比P＜0.05。此数据表明，LX5140110抑制OxLDL-介导的对LOX-1依赖性FAK磷酸化的诱导，该磷酸化是调节内皮细胞骨架功能(包括细胞-细胞和细胞-基质粘附，具有对内皮屏障功能的后续影响)的过程。

G.LOX1是负责HAEC中OxLDL信号传导的主要受体(图9I、9J和9K)。

方法：构建LOX1 shRNA腺病毒：

利用pAdBLOCK-iT试剂盒(生命科学)产生Ad-sh非靶标-和AdshLOX1-编码的病毒。简单地说，用来自生命科学的专有软件设计非靶标寡核苷酸和人类LOX1的其他靶向5′UTR区域，并克隆到pU6-ENTR中。所用序列如下：非靶标：上链，5′-CAC CGA TGG ATT GCA CGCAGG TTC TCG AAA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3′(SEQ ID NO：79)；下链，5′-AAA AGATGG ATT GCA CGC AGG TTC TTT CGA GAA CCT GCG TGC AAT CCA TC-3′(SEQ ID NO：80)。LOX1sh：上链，5′-CAC CGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GCG AAC TAA GAA TGA GAG AGTGAA GC-3′(SEQ ID NO：81)；下链，5′-AAA AGC TTC ACT CTC TCA TTC TTA GTT CGC TAAGAA TGA GAG AGT GAA GC-3′(SEQ ID NO：82)。

用HAEC细胞测试所得的pU6-sh-非靶标和pU6-LOX1shRNA质粒在瞬时转染实验中的功能。将示出最大抑制的构建体与pAD/BLOCK-iTDEST(英杰)重组以产生pAd-非靶标和Ad-shLOX1。利用密理博(Millipore)试剂盒扩增、纯化和浓缩病毒。

为确认LOX1是HAEC中OxLDL信号传导所必需的，利用表达针对人类LOX1基因的5′UTR区域的干扰短发夹RNA(shRNA)(LOX1shRNA)的病毒载体来抑制LOX1 RNA表达。简单地说，用25MOI(感染复数，毒力的量度)的表达LOXlshRNA(“LOX1-shRNA”或“Ad-LOX-1shRNA”)的腺病毒转导60％汇合HAEC。24小时后，将培养基替换成含有NFKB-LUC编码病毒的低血清培养基(1％)。病毒转导的第二天，用50μg/mL OxLDL处理细胞，并孵育另外的8小时，随后通过化学发光测量荧光素酶活性。然后使细胞裂解物与抗-Lox-1或抗-GAPDH抗体经历免疫印迹法。如图9J和9K中所示，添加LOX1shRNA显著减少LOX1蛋白表达(参见例如，图9J的泳道3与泳道1和2相比)，证实LOX1shRNA有效抑制HAEC中的LOX1表达。此外，如图9I中所示，与用OxLDL孵育和对照非靶标shRNA(Ad-NTsh)构建体的细胞相比，AdshLOX1显著抑制HAEC中OxLDL-介导的NFkB信号传导。*指示P＜0.05(与未处理的对照相比)；#指示与OxLDL+Ad-NTsh相比P＜0.05。

图10中示出信号传导途径的概述，所述信号传导途径涉及LOX1受体信号传导并被本文披露的抗-LOX1抗体(包括例如LX5140110；“514Ab”)阻断。

****

具体方面的以上描述将充分地揭示本披露的总体性质，使得在不脱离本披露的一般概念的情况下，其他人可以无需过多的实验通过应用本领域的技术内的知识，容易地针对此类具体方面的各种应用修改和/或改编。因此，基于在此提出的传授和指导，此类改编和修改旨在处于所披露的含义和等效范围内。应当理解在此的短语或术语是出于描述而非限制的目的，这样使得本说明书的术语或短语可根据这些传授和指导被技术人员理解。

本文引用的所有出版物、专利、专利申请、和/或其他参考文献出于所有目的通过引用以其全部内容而结合，在程度上就像每个单独的出版物、专利、专利申请、和/其他文件被单独地指出以出于所有目的通过引用而结合相同。

序列表

<110> 免疫医疗有限公司

<120> 对LOX1具有特异性的结合蛋白及其用途

<130> LOX1-100WO1

<140> 62/058,254

<141> 2014年10月1日

<160> 82

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 CDR-1重链序列

<400> 1

Glu Leu Ser Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140110 CDR-2重链序列

<400> 2

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140110 CDR-3重链序列

<400> 3

Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140110重链序列

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Phe Lys Tyr His Thr His Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Leu Val Trp Gly Thr Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 CDR-2重链序列

<400> 5

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140011 CDR-2重链序列

<400> 6

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140014 CDR-2重链序列

<400> 7

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140016 CDR-2重链序列

<400> 8

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140038 CDR-2重链序列

<400> 9

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140094 CDR-2重链序列

<400> 10

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140108 CDR-2重链序列

<400> 11

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140092 CDR-2重链序列

<400> 12

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093 CDR-2重链序列

<400> 13

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140011 CDR-3重链序列

<400> 14

Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140108 CDR-3重链序列

<400> 15

Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140092_D CDR-3重链序列

<400> 16

Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140092_N CDR-3重链序列

<400> 17

Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093_D CDR-3重链序列

<400> 18

Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 19

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140011重链序列

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Glu Tyr Ala Tyr Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 20

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140014重链序列

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Tyr Thr Ile Arg Val Gly Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 21

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140016重链序列

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Thr His Thr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 22

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140038重链序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Thr Ile His Val Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 23

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140094重链序列

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Gln Tyr His Val Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 24

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140108重链序列

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ser Asn His Val Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Leu Thr Ser Thr Gly Arg Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 25

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140092_D重链序列

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asp Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 26

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140092_N重链序列

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Lys Tyr His Leu Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Thr His Gln Gly Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 27

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093_D重链序列

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asp Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 28

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093_N重链序列

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Trp Ala Tyr His Gln Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 29

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514重链序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Pro Asn Gly Gln Gln Gly Lys Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 CDR-1轻链序列

<400> 30

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 CDR-2轻链序列

<400> 31

Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 CDR-3轻链序列

<400> 32

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val

1 5 10

<210> 33

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140110轻链序列

<400> 33

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140094 CDR-3轻链序列

<400> 34

Gln Ser Tyr Asp Ser Met Tyr Arg Phe Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093 CDR-3轻链序列

<400> 35

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser His Arg Ala Trp Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140094轻链序列

<400> 36

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Met

85 90 95

Tyr Arg Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX5140093轻链序列

<400> 37

Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

His Arg Ala Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 CDR-1重链序列

<400> 38

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 CDR-2重链序列

<400> 39

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl CDR-3重链序列

<400> 40

Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile

1 5 10

<210> 41

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl重链序列

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960067_ngl1 CDR-2重链序列

<400> 42

Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960086_ngl1 CDR-2重链序列

<400> 43

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 CDR-3重链序列

<400> 44

Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960067_ngl1 CDR-3重链序列

<400> 45

Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_ngl1 CDR-3重链序列

<400> 46

Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960101_ngl1 CDR-3重链序列

<400> 47

Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val

1 5 10

<210> 48

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960067_ngl1重链序列

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 49

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960071_ngl1重链序列

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_ngl1重链序列

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960086_ngl1重链序列

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Met Asp Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960101_ngl1重链序列

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_gl重链序列

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696重链序列

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl CDR-1轻链序列

<400> 55

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl CDR-2轻链序列

<400> 56

Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl CDR-3轻链序列

<400> 57

Met Gly Gly Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 58

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_G82bS_gl轻链序列

<400> 58

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960116_ngl1 CDR-1轻链序列

<400> 59

Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 CDR-2轻链序列

<400> 60

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 CDR-3轻链序列

<400> 61

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960067_ngl1 CDR-3轻链序列

<400> 62

Leu Gly Arg Thr Trp Ser Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960071_ngl1 CDR-3轻链序列

<400> 63

Met Gly Ser Met Gly Arg Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 64

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960094_ngl1 CDR-3轻链序列

<400> 64

Ala Gln Arg Thr Val Ser Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 65

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960067_ngl1轻链序列

<400> 65

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gly Arg Thr Trp Ser

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 66

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960071_ngl1轻链序列

<400> 66

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 67

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960073_ngl1轻链序列

<400> 67

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Pro Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Gly Met Gly Arg

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 68

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960094_ngl1轻链序列

<400> 68

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg Thr Val Ser

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 69

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LX6960116_ngl1轻链序列

<400> 69

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Gly Ser Met Gly Arg

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 70

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696轻链序列

<400> 70

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 VH CDR2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly、Trp、Tyr或Phe

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Glu、Thr、Gln、Ser、Lys或Ala

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Thr、Tyr、Ile或Asn

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是Ile、Ala、Arg或His

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是Tyr、Val、Thr、Leu或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是Ala、Asp、Gly、Ser或His

<400> 71

Gly Phe Asp Pro Glu Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 72

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 VH CDR3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Pro、Ser或Val

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Asn、Thr、Trp或Asp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Gln、Arg或Thr

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Gln或His

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Gly或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Lys或Gly

<400> 72

Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox514 VL CDR3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Ser或Met

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Leu、Tyr或His

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Ser或Arg

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Gly、Ala或无氨基酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是Trp或Phe

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是Val、Gly或Ala

<400> 73

Gln Ser Tyr Asp Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 VH CDR2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Ile或Val

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Trp或Leu

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Asn或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Ser或Glu

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Gly、Leu或Pro

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Ser、Tyr或Asp

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Ile、Thr或Arg

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (10)..(10)

<223> Xaa是Gly或Tyr

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是Tyr或Met

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> Xaa是Ala或Asp

<400> 74

Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 75

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 VH CDR3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Asn或Ser

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Phe或Leu

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (11)..(11)

<223> Xaa是Ile或Val

<400> 75

Glu Gly Xaa Trp Asn Tyr Asp Ala Xaa Asp Xaa

1 5 10

<210> 76

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 VL CDR1

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Ser或Asn

<400> 76

Thr Gly Thr Ser Xaa Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 77

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 VL CDR2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Asn或Lys

<400> 77

Asp Val Ser Xaa Arg Pro Ser

1 5

<210> 78

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lox696 VL CDR3

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Ser、Leu、Met或Ala

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Ser、Gly或Gln

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Tyr、Arg、Ser或Gly

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Thr或Met

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是Ser、Trp、Gly或Val

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Ser或Arg

<400> 78

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Asn Trp Val

1 5 10

<210> 79

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上链Ad-非靶标合成引物

<400> 79

caccgatgga ttgcacgcag gttctcgaaa gaacctgcgt gcaatccatc 50

<210> 80

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下链Ad-sh非靶标合成引物

<400> 80

aaaagatgga ttgcacgcag gttctttcga gaacctgcgt gcaatccatc 50

<210> 81

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上链LOX1sh合成引物

<400> 81

caccgcttca ctctctcatt cttagcgaac taagaatgag agagtgaagc 50

<210> 82

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下链LOX1sh合成引物

<400> 82

aaaagcttca ctctctcatt cttagttcgc taagaatgag agagtgaagc 50