具体实施方式

材料

焦脱镁叶绿酸A(PpaPpa)，氯化钆六水合物(GdCl3·6H2O)， 2,2'-[偶氮双(1-甲基亚乙基)]双[4,5-二氢-1H-咪唑]二盐酸盐 (VA044)，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CTA)，N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，1-羟基苯并三唑(HOBt)， O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N,N-二异丙基乙胺 (DIPEA)，三氟乙酸(TFA)，组织蛋白酶B从SIGma-Aldrich公司购买，并无需进一步纯化即可使用。单体MA-GFLG-PTX，MA-DOTA， MA-GFLGK-MA按以前报道过的方法合成。所有其他试剂和溶剂购自科龙化工试剂厂(成都，中国)，并且无需进一步纯化即可使用。

4T1乳腺肿瘤细胞购买于中国科学院典型培养物保藏中心细胞库(中国,上海),用RPMI 1640培养基(包含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液，美国生命技术公司)于恒温恒湿细胞培养箱(5％ CO₂；37℃)培养。雌性BALB/c小鼠(体重20±1.2g和6～8周龄) 购买于成都达硕生物科技有限公司。所有动物实验均按照中国有关国家和四川大学伦理委员会的规定执行。

各类单体的中间体和最终产物的结构鉴定通过¹H NMR(Bruker AVⅡ-400spectrometer，瑞士Bruker公司)，电喷雾电离质谱(ESI MS，美国waters公司)以及液相色谱质谱联用(LC-MS/MS，美国ABI 公司)来确定。聚合物的平均分子量和多分散指数(PDI)利用快速蛋白色谱仪(FPLC系统，GE Healthcare，瑞典)通过尺寸排阻色谱(SEC)测量得到。选择乙酸钠缓冲液(H₂O:ACN＝70:30， v/v，pH＝6.5)作为流动相。色谱柱选用GEHealthcare Superose 6HR10 /30，流速为0.4mL/min。通过¹H NMR表征聚合物结构。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)测量聚合物在水溶液中的纳米粒径和ζ电势(3mg/mL)。每次测量设置3 个平行样，结果用DTS软件3.32版本进行处理。利用透射电子显微镜(TEM)(GF-20S-TWIN,FEI Tecnai，美国)检测聚合物粒径。使用紫外可见分光光度计(Cary 400，Varian，美国)测试UV-vis光谱。用荧光分光光度计(RF-5301-PC，Shimadzu，日本)测定聚合物的荧光波谱。使用Student’s t检验来来进行统计分析。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。p值<0.05的被认为具有统计学显着性差异，p 值<0.01被认为具有高度显著性差异。

实施例1、合成支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd

合成步骤如图1所示。

GAEMA(1.34g,4.38mmol)，MA-DOTA(803mg,1.56mmol)， MA-GFLG-PTX(648mg,0.5mmol)，PTEMA(31.8mg,0.13mmol)， MA-GFLG-CTA(68.9mg,72μmol)以及MA-GFLGK-MA(61.5mg, 93.8μmol)加入到聚合瓶中，并将聚合瓶置于氩气中进行保护。VAO44 (9.0mg,28μmol)溶于15ml H₂O/CH₃OH:1/3的混合溶液中，并加入到上述的聚合瓶，冰浴冷却，氩气鼓泡50min。聚合瓶避光下46℃油浴加热反应20h，液氮淬灭反应。反应液升至室温后滴加至300ml 丙酮溶液中，得到粉红色沉淀。粗产物通过SEC分馏进一步纯化。并于2K透析袋中透析2天，冻干得粉红色固体中间产物 pGAEMA-DOTA1.63g，收率55％。

在氩气氛下，将pGAEMA-PTX-DOTA(1.5g)溶于15mL DMSO 中，并将二硫苏糖醇(DTT，300mg)加入上述溶液中。室温搅拌10 h，于2K透析袋中去离子水透析2天，冻干得粉红色固体产品1.2g。将支化pGAEMA-PTX-DOTA-SH(1.2g)溶于25mL去离子水中，加入GdCl₃.6H₂O(600mg)，室温搅拌，此时溶液pH值为5.2～5.4。将产物透析冻干之后再次溶于DMSO中。将maleimide-Ppa(12mg) 溶解于2mL DMSO中，并加入到上述反应体系中，避光室温反应6h，于2K透析袋在RO水中透析1天，冻干得到浅绿色固体1.07g。最终产物中PTX，Ppa和Gd的含量分别为6.4％，0.8％以及4.9％。

实施例2、支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的纳米粒子的制备

聚合物支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(100mg)均匀分散于10mL色谱纯DMSO中，冰浴下，缓慢滴加至剧烈搅拌的 10mL超纯水中。继续搅拌2h后，将混合溶液在4℃，避光条件下透析至除尽DMSO。将透析后的溶液冻干即得到载药纳米粒子支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd NPs，置于4℃下储存备用。

试验例1、化学结构及分子量确认

1)实验材料

实施例1制备的pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

通过¹H NMR谱图分析pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的化学结构。如图2A所示，在7.0-8.5ppm处可以观察到含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA的质子峰，表明该聚合物存在芳香基团。其可能来自于由PTX，Ppa或GFLG中的苯环，另一方面，该聚合物在 5.0-6.0ppm并没有观察到质子峰，由于单体中的双键特征峰会出现在 5.60ppm(s,-CH₃-CH(r)-CH₂-H^a)和5.20ppm(s,-CH₃-CH(r)-CH₂-H^b) 的位置，表明反应中的单体已经被完全耗尽。

通过EDX法进行元素识别。如图2B所示，对C，O，S和Gd 元素的识别可以证实Gd³⁺已经成功连接到了聚合物上。

通过荧光分光光度计测试荧光波谱，如图2C所示，在673nm 处可以检测到支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd和游离Ppa 的特征峰，表明Ppa的荧光特性在共价偶联的过程中也保持不变。

通过氨基酸分析验证氨基酸的比重，结果显示聚合物中甘氨酸、苯丙氨酸以及亮氨酸这三种氨基酸的比重分别为2.57％，3.26％和 2.54％，摩尔比约为2:1:1，表明了聚合物中GFLG的存在。

通过快速蛋白色谱仪(FPLC系统，GE Healthcare，瑞典) 通过尺寸排阻色谱(SEC)测量聚合物的平均分子量和多分散指数 (PDI)。选择乙酸钠缓冲液(H₂O:ACN＝70:30，v/v，pH＝6.5)作为流动相。色谱柱选用GE Healthcare Superose 6HR10/30，流速为0.4mL/min。结果表明支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的分子量约为244kDa，PDI为2.48(表1)。

表1：含糖支化聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的表征参数。

^a分子量(Molecular weight，MW)单位为kDa；

^b氨基酸，PTX，Gd和Ppa百分比占比(％)；

^cDLS测得的纳米微粒直径大小(nm)；

^dZeta电位(ζ)单位为mV.

试验例2、粒径分布、zeta电位、形貌及稳定性的评价

1)实验材料

实施例2制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的纳米粒子。

2)实验方法与结果

纳米粒子的粒径和zeta电位通过DLS进行表征。利用去离子水配制纳米粒子溶液(1mg/mL),随后，利用马尔文纳米粒度及电位分析仪检测粒径及zeta电位(n＝3)。纳米粒子在PBS中的稳定性按同样的方法进行测定。

透射电子显微镜(TEM Tecnai G2 F20 S-TWIN，FEI，Hillsboro， Oregon，USA)用于检测纳米粒子的表面形态。将纳米粒子的水溶液 (0.5mg/mL)滴加到铜网上，用滤纸吸走多余的液体后，待风干进行TEM检测。如图2D所示，DLS结果显示支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd纳米粒子的流体力学直径为95.17nm，并具有负的表面电荷。如图2E所示，TEM的测试结果显示该偶合物能够形成分布均匀的70nm左右的纳米颗粒，进一步证明了该偶合物自组装行为的存在。如图2F所示，稳定性检测结果进一步表明纳米粒子在PBS中具有良好的稳定性，在PBS中存储48h后粒径和PDI均没有发生显著的变化。

采用芘荧光法测量聚合物纳米粒子在超纯水中的临界聚集浓度 (CAC)。首先准确称取并配置一系列不同浓度梯度的纳米粒子溶液 (0.01μg/mL～500μg/mL)。随后，吸取25μL芘的丙酮溶液(5×10^-5M) 于一系列10mL样品瓶中，待丙酮完全挥发干后，分别加入2mL上述各浓度梯度的纳米粒子溶液(芘的终浓度为6.25×10^-7M)。最后，将上述溶液置于37℃的恒温振荡器中避光孵育2h后，利用荧光分光光度计测定芘的荧光光谱(Em:390nm,Ex:300nm～350nm)。结果如图3所示，形成的纳米颗粒的临界聚集浓度为23.7μg/mL，这样低的CAC值表明该纳米粒子有望具有较好的稳定性。

试验例3、生物降解和药物释放评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd和实施例2制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的纳米粒子。

2)实验方法与结果

将支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd溶于含有组织蛋白酶B(2.8μM)的McIlvaine缓冲液(pH 5.4，50mM柠檬酸盐，0.1M 磷酸盐和2mM EDTA)中，聚合物浓度为6mg/mL。将聚合物溶液置于37℃摇床中孵育，在预定的时间点(0，2，6，12，20h)，取出 1mL混合溶液用SEC法测定样品的分子量，流动相为乙酸钠缓冲液与甲醇的混合溶液，溶剂配比为7:3，溶剂最终pH值为6.5，流速为 0.4mL/min。实验中样品准备三个平行样。

支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的药物释放实验同样在含有组织蛋白酶B(2.8μM)的McIlvaine的缓冲液(pH 5.4)中进行，样品浓度为3mg/mL。将溶液置于37℃的摇床中孵育12h。在预定的时间点(0，2，6，12，20h)，取出100μL溶液与色谱纯甲醇等体积混合后，利用RP-HPLC高效液相色谱仪检测分析(液相分析柱 C8 column 4.6×150mm)，流动相为等体积的乙腈和水，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长为227nm。支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在不含组织蛋白酶B的McIlvaine缓冲液 (pH5.4和pH 7.4)中的纳米颗粒的药物释放性质也按上述方法进行测定。

如表2所示，随着孵育时间的增加，含糖聚合物的分子量逐渐降低，表现出明显的降解行为。与之相反，在没有加入组织蛋白酶B 的对照组中，孵育20h后，聚合物分子量没有明显的变化。这一结果表明该含糖聚合物的降解可归因于聚合物结构中GFLG短肽的断裂。图4A展示了聚合物与组织蛋白酶B共孵育后，降解产物出现峰值的时间。降解后的聚合物分子量(28kDa)远低于肾阈值，因此有助于其快速代谢出体外。同时，该聚合物在生理条件下良好的稳定性也有助于延长其体内循环时间。

表2：含糖支化聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd与组织蛋白酶B (2.8μmol/L,pH＝5.4)在McIlvaine缓冲溶液中共孵育后的降解产物，孵育温度为37℃。

如图4B所示，在24h内，在不含组织蛋白酶B的PBS溶液(pH＝5.4， 37℃)中几乎观察不到PTX的释放(少于3％)，而在含有组织蛋白酶B的条件下，含糖聚合物的PTX累计释放量超过了90％。另一方面，在模拟的生理条件下(pH 7.4，37℃)，PTX在24h内的释放量约有25％。这一结果与先前的研究一致，可归因于酯键连接的PTX 在弱酸性条件下比中性条件下具有更好的稳定性。以上的研究结果表明，含糖聚合物在被肿瘤细胞摄取后，可以在肿瘤微环境的刺激下快速释放出所载的PTX药物，进而产生相应的细胞毒性。

试验例4、体外弛豫率评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

通过临床Siemens 3.0T MRI扫描仪测量支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在PBS中的1H水弛豫率。将不同Gd3+浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mM)支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd溶解在0.1M的PBS中，通过T1 SE 序列扫描材料的磁共振信号强度，扫描参数如下：TE＝8.7ms，TR＝ 20、30、50、70、90、125、150、175、200、300、400、500、700、 850和1000ms，Fov＝200mm，slice thickness＝1.0mm，matrix dimensions＝256×256。并通过它们的T1加权MR图像获取相应的 1/T1值。通过将1/T1绘制为不同Gd³⁺浓度的函数来计算弛豫率值r1。另外，将相同浓度的临床用DTPA-Gd作为对照，然后通过与上述相同的方法获得样品的纵向弛豫率。

结果如图4C所示，与相对Gd³⁺含量相同的Gd-DTPA比，支化聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组的信号强度更高。图4D展示了支化聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd以及临床用Gd-DTPA和Gd³⁺的线性相关，且两者的R²均约等于1.0。支化聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的弛豫效率r₁算得为7.1L/(mmol·s)，约为 Gd-DTPA(r_1＝3.6)的1.97倍。多氨基多羟基含Gd聚合物是否能用于临床诊断主要取决于它的旋转相关时间(τ_R)，而τ_R则可通过提高分子质量来降低，从而提高弛豫效率。pGAEMA-PTX-DOTA-Gd中小分子Gd-DOTA通过共价连接在支化聚合物上，极大提高了弛豫效率，因此提高MRI的对比率。

试验例5、体外细胞摄取、细胞毒性以及渗透和生长抑制评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

将小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1)细胞悬液接种于35×12mm的玻璃皿(细胞数量为1×10⁵)中，孵育24h后，除去原培养基，加入含有支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(浓度相当于PpaPpa浓度为0.25μg.mL^-1)的RPMI 1640培养基。接着，将细胞在培养箱中分别孵育1，3，5h后，除去培养基，细胞用PBS(pH＝7.4)清洗三次，加入含有Hoechst 33342(10μg/mL的)的PBS于避光条件下染色15min。随后，除去染料并用PBS清洗3次后，用激光共聚焦显微镜(CLSM) 观察细胞入胞情况，获得细胞摄取材料的荧光图像。

选用小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1)来评价对比游离紫杉醇(free PTX) 和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd对4T1细胞的相对细胞毒性，以验证材料的安全性。将4T1细胞种于96孔板中，每孔中细胞密度为5×10³个，在培养箱中贴壁生长24h后，除去RPMI 1640 培养基，分别加入含有不同浓度梯度(浓度相当于PTX浓度0.039到40μM)的游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd培养基。再次孵育48h后，去除培养基，用PBS清洗三次。再在每孔加入细胞毒性评价试剂盒CCK-8(Dojindo，Japan)。在细胞培养箱中孵育2h后，通过多功能酶标记仪(Thermo Fisher SCIENTIFIC)来检测吸光度，用酶标仪检测每个样品的吸光度，并按说明书计算细胞存活率。

制备4T1细胞的多细胞肿瘤球(MTS)并将其用于研究支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的肿瘤穿透力及肿瘤细胞的生长抑制能力。首先将2mL熔融的2％琼脂糖溶液加入到直径5cm的玻璃皿中。在琼脂糖溶液固化后，将4mL含新鲜RMPI 1640培养基的 4T1细胞悬浮液(5mL×10⁶细胞/mL)添加到琼脂糖上。孵育约5 天后形成MTS并且细胞球直径约为200μm。为了研究支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的穿透力，将MTS与支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd共同孵育了2h和6h，并在CLSM下观察细胞球的情况。数据由Image J软件进行进一步处理。为了研究肿瘤细胞的生长抑制能力，将存活的和死亡的4T1细胞进行了染色。首先在MTS直径达到约200μm后，添加新鲜的RPMI 1640培养基，其中两组的培养基中分别添加了含有2μg/mL PTX的支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd和游离PTX，而对照组则不含PTX相关的治疗药物。在MTS继续孵育48h后，除去培养基，并将MTS转移到1mL的EP管中。之后，采用荧光素钙黄绿素AM/碘化丙啶(CAM /PI)双重染色来区分存活的以及死亡的4T1细胞，并将MTS固定并转移到玻璃皿中，在CLSM下观察经染色后的肿瘤细胞球。所得到的实验数据利用NIS-Elements AR软件进行进一步处理。

如图5A所示，激光共聚焦显微镜(CLSM)显示Ppa的红色荧光主要分布于细胞质中。孵育后，支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的Ppa荧光增强与溶酶体荧光染色的溶酶体荧光有较好的重合，这表明该聚合物可能是通过内吞溶酶体途径被细胞所摄取。随着时间的延长，荧光强度逐渐增强，呈现明显的时间依赖性。如图5B所示，流式定量分析进一步揭示了纳米粒子时间依赖性的细胞摄取情况，这与激光共聚焦显微镜(CLSM)实验所得的结果一致。

如图5C所示，游离PTX组和支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组都显示出明显的浓度依赖性的细胞毒性。其中，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的IC₅₀值为1.99μM，约为游离PTX的1.7倍(1.17μM)。产生这一结果的原因可能是由于游离PTX通过自由扩散入胞，而支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd采用不同的内吞入胞途径以及药物释放过程。

此外，通过对4T1细胞的二维细胞毒性研究显示，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的抗肿瘤作用与游离PTX相当。其抗肿瘤作用也通过将其应用于三维MTS得以进一步证实。从拓扑3D图像和CLSM图像(图5D-F)可以看出在应用支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd之后2h，该聚合物大量聚集在MTS的外围。延长孵化时间至6h后，可以观察到MTS上的信号有明显的增强，证明支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd深入渗透到了三维MTS中。同时，与用游离PTX处理的MTS相比，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd孵育的MTS中存在大量形态异常和分离的细胞。孵育48h后，在用游离PTX和支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd孵育的MTS均表现出PI阳性细胞(死亡细胞)的增加，而支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd处理的 MTS中产生了更多异型性4T1细胞，而整个肿瘤球相对更小。因此，这些实验结果证明了支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd能够深入到三维实体肿瘤组织中并且增强PTX的抗肿瘤作用。

支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd对4T1 MTS的抑制效果如图5G所示。MTS的生长情况如图6所示。在经过游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd处理的MTS中，均能观测到大片细胞形态异常及细胞死亡。在孵育48h后，游离PTX组和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组MTS均能观测到显著增加的PI阳性区域。细胞形态异常可能由于较长时间的孵育以及细胞坏死造成。因此，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd对3D实体肿瘤有深穿透能力且与游离PTX有等效的抗肿瘤能力。

试验例6、体外抗肿瘤机制研究

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

细胞微管蛋白检测：将4T1细胞系接种在接种于直径20mm的玻璃皿(细胞数量为5×10³)中。孵育24h后，除去原培养基，分别加入含有游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(浓度均为0.5μg/mL)的新鲜RPMI 1640培养基，并设置一组加入不含游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的新鲜RPMI 1640培养基作为对照。接着将4T1细胞孵育24h。除去培养基，并按照制造商所提供的规程，通过Tubulin-Tracker Red溶液(C1050， Beyotime，中国成都)测定细胞微管。进行细胞微管染色后，将细胞用PBS漂洗两次，并接着在Hoechst 33342(10μg/mL)PBS溶液中孵育10分钟。去除染料，使用PBS将细胞冲洗两次，并置于CLSM 下观察。实验所得数据由NIS-Elements AR软件进行进一步处理和分析。

细胞周期检测：将4T1细胞系接种在接种于直径5cm的玻璃皿 (细胞数量为2×10⁴)中。除去原培养基，分别加入含有游离PTX 和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(浓度均为0.5μg/mL) 的新鲜RPMI 1640培养基，并设置一组加入不含游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的新鲜RPMI 1640培养基作为对照。接着将细胞孵育24h。除去培养基，并将细胞进行胰蛋白酶消化和离心。随后，按照制造商所提供的规程，通过PI/RNase染色溶液测定增殖周期。将细胞进行固定并染色后，利用流式细胞仪检测细胞增殖周期。实验所得数据由ModFit LT 3.1软件进行进一步处理和分析。

细胞凋亡检测：将4T1细胞悬液接种于6孔板(细胞数量为1.5 ×10⁵每孔)中，孵育24h后，除去原培养基，分别加入含游离PTX 和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的培养基(浓度分别为 0.8μg/mL PTX和1.8μg/mL PTX)，并设置一组加入不含游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的新鲜RPMI 1640培养基作为对照。继续孵育24h后，除去培养基，并将细胞进行胰蛋白酶消化和离心。随后，按照Annexin V-FITC凋亡测试盒中的操作步骤对细胞进行染色，利用流式细胞仪定量检测细胞凋亡情况，实验所得数据通过WinMDI2.9软件进行进一步处理和分析。

图7A可以清楚观察到通过微管蛋白染色后的4T1细胞的微管结构。Tubulin-Tracker Red标记的正常微管结构已网格状地分布在4T1 细胞内，而在经过支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd和游离 PTX治疗处理之后，可以观察到微管的聚集以及多核结构均存在于单一细胞之类，证明在细胞分裂过程中出现了微管稳定性增强的显像。两组细胞结果表明，与游离PTX相比，支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd具有相同的抗肿瘤机制和抗肿瘤作用。

如图7B和7C所示，未经治疗处理的4T1细胞处于G1期的数量(37.84％)明显高于处于G2/M期的数量(9.39％)。而在经游离 PTX处理后的4T1细胞中，处于G1期和G2/M期的细胞数百分比分别为14.06％和23.34％，在支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd 组中，这个百分比分别为18.33％和22.98％，证明游离PTX和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的加入都能够有效抑制肿瘤细胞的分裂，使其G2/M期阻滞率明显增加。

如图7D和7E所示，与对照组相比，经过药物处理后，游离PTX 和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd均能够有效的诱导细胞发生凋亡和坏死，其中游离PTX诱导37.2％的细胞发生凋亡和坏死，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd诱导31.2％。以上这些结果表明，基于纳米结构的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd 能够有效地被细胞摄取，并在细胞微环境中特异性释放化疗药物，高效地杀死肿瘤细胞。

试验例7、药代动力学及药物体内散布评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在正常小鼠体内的代谢分析：将10只雌性健康BALB/c小鼠(20±2g，8-10周)任意分为两组(n＝5)。通过尾静脉分别注射支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(0.08mmol/kg Gd³⁺)剂量后，在0min，5 min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h的时间点经眼底静脉采血收集20μL血液，血液经过HNO₃和H₂O₂(1：3)消化，通过电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)测得Gd(III)的含量。药物动力学参数通过 PKSolver软件计算得出。

采用荧光成像检测小鼠主要脏器中支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在不同时间点在小鼠体内的生物分布情况。将肿瘤生长至约150mm³的小鼠随机分为两组，分别通过尾静脉注射相对Ppa含量均为1.5mg/kg的支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd和游离Ppa。在注射前和注射后1,6,12, 24,48和72h均拍摄活体荧光图片，检测并记录药物在小鼠肿瘤部位的分布情况。

此外，为了进一步探究支化物的体内分布，另外将上述注射药物的荷瘤小鼠，按每组每个时间点3只，分别于给药1，6，12，24， 48以及72h后对小鼠实施安乐死。剥下肿瘤和主要器官(心，肝，脾，肺，肾)，称重，并利用Maestro In-Vivo成像系统对这些组织和脏器的荧光图像进行了半定量分析。注射生理盐水的小鼠用作对照组分析。

同时采用ICP-MS检测小鼠主要脏器中Gd³⁺的含量来研究支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在不同时间点在小鼠体内的分布情况。将4T1荷瘤小鼠(肿瘤体积约为150mm³)随机分成4组(n＝ 5)。通过尾静脉分别注射临床造影剂Gd-DTPA和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。每种试剂各给两组，分别做好标记，给药剂量均为0.08mmol Gd³⁺/kg小鼠。分别在给药24h和96h后，对 Gd-DTPA和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd给药组中的一组小鼠实施安乐死。剥下肿瘤和主要器官(心，肝，脾，肺，肾)，称重，并在浓盐酸和浓硝酸(3：1，v/v)的混合溶液中消化。然后将各个样品在120℃下加热使其完全溶解。用超纯水将完全消化后的各样品溶液稀释至相同体积，并使用ICP-MS检测样品中Gd³⁺的浓度。 Gd在各器官中分布的计算公式为：Gd³⁺相对含量(ng Gd/g组织)＝各样品中Gd³⁺的质量/对应器官的质量。

如图8A所示，临床试剂Gd-DTPA显示出非常快速的血液清除速率，给药1h后在血浆中就几乎检测不到Gd的存在。与之相反，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在血液中的浓度下降明显减慢，表现出显著延长的血液循环时间，在给药4h之后，血浆中可检测到高达10μg/mL的Gd浓度，而在12h之后仍可检测到7μg/mL 的Gd浓度。如表3所示，双室模型分析结果表明Gd-DTPA显示出非常短的血液半衰期(14.2min)，与之相对，纳米粒子显示出显著延长的血液半衰期时间，为1255.4min。此外，相比于Gd-DTPA,纳米粒子还具有显著降低的平均系统清除速率和延长的平均停留时间。

表3：PKSolver 2.0软件的二室模型药代动力学相关参数。

如图9所示，展示了荷瘤小鼠肿瘤部位Ppa的信号分布情况。在游离Ppa组中，只有很微弱的Ppa信号在12h被检测到。而支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组在所有时间点均检测到较高的 Ppa荧光信号，其荧光信号在24h前持续增加，然后才开始下降。此外，如图8B所示，给药之后，游离Ppa和Ppa标记的纳米粒子表现出显著不同的器官组织分布情况。其中，在游离Ppa给药组中，给药 1h后在肝脏部位观察到强烈的荧光信号，表明其在肝脏部位大量聚集，而在肿瘤部位几乎观察不到荧光信号。随着时间延长，各脏器中荧光强度均明显降低，在12h后几乎观察不到荧光信号。与之相反， Ppa标记的纳米粒子显示出逐渐增强且持续的荧光分布，并且在肿瘤部位观察到明显的荧光信号增强的过程。荧光半定量分析进一步揭示了这一结果，如图8C所示，Ppa标记的纳米粒子组中，给药24h后，肿瘤部位荧光信号达到最大值，随后出现缓慢的下降。PpaPpa组给药后各脏器和肿瘤中荧光信号均逐渐减弱(图10)。这些结果表明Ppa 标记的纳米粒子具有较长的体内循环时间，能够通过EPR效应靶向至肿瘤部位，因此有望改善小分子药物的体内分布，提高其抗肿瘤疗效。

如图11所示，在注射Gd-DTPA 24h之后，小鼠的器官和肿瘤中可以检测到微量的Gd³⁺，其中肝脏中可检测到0.1％ID/g Gd³⁺，为总 Gd³⁺注射量的0.2％，肿瘤中可检测到0.1％ID/g，而其他器官中的Gd³⁺浓度则小于0.1％ID/g。此结果与荧光成像的结果一致。但是，在注射支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd 24h之后，可在小鼠的肝脏(30.9％ID/g)和脾脏(18.4％ID/g)中检测到大量的Gd³⁺，而在肾脏中这个数值为4.8％ID/g。同时，在肿瘤组织中也可检测到约 4.3％ID/g Gd³⁺。而在注射后96h，肝脏和脾脏中的Gd³⁺浓度明显降低，前者为11.9％ID/g，后者为6.1％ID/g。而在肿瘤和其他器官中检测到的Gd³⁺浓度极低(图8D)。尽管Gd³⁺的生物分布结果与Ppa 荧光成像的结果相似，但当Gd³⁺从聚合物中解离之后，Gd³⁺具有较高的清除速率，而Ppa键合的含糖聚合物骨架及其降解产物从体内清除的速率相对较慢。这些体内分布实验的结果表明，具有生物可降解性的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd在体内发挥其生物学功能后，可以通过代谢快速排出体外，避免了Gd³⁺在体内长期滞留所带来的潜在毒性。

试验例8、体内磁共振成像评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

将异种移植的4T1荷瘤小鼠(肿瘤体积约为150mm³)随机分成两组(n＝5)，分别通过尾静脉注射临床造影剂Gd-DTPA和支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd(给药剂量相当于0.08mmol Gd³⁺/ kg小鼠)。扫描使用异氟烷气体麻醉小鼠，然后将小鼠固定于定制线圈中。运用T1 SE序列进行对比度增强的成像扫描，扫描序列如下： TE＝20ms，TR＝500ms，FOV＝40ms，thickness＝1.0mm，Flip angle ＝90°。分别在注射前，注射后10min，30min，1h，4h和24h获取每个实验组的MRI图像。MRI信号强度的相对增强值(SI％)定义为SI(注射后)/SI(注射前)×100％。通过绘制SI％与时间的关系，应用半定量分析来评估肿瘤部位的信号变化。

注射前后各时间点支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组和Gd-DTPA组的小鼠的肿瘤MRI信号变化如图12A所示。对于支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组而言，小鼠注射造影剂后，其肿瘤部位与周围组织的对比度随着时间的延长而逐渐增强，肿瘤的轮廓清晰可见，且在24h内一直保持较高的对比度。与之相反， Gd-DTPA组在给药30分钟内亮度逐渐增强，随后肿瘤信号值迅速下降，在给药1h后就已经变得非常微弱，在4h后已经基本恢复到注射前的水平。肿瘤部位的相对强化信号(The relative enhanced intensity signal，SI)的半定量分析如图12B所示。支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组SI在24h内持续增强，而Gd-DTPA组在注射后30min达到顶峰，然后开始下降。这一结果表明小分子的 Gd-DTPA造影剂在体内没有肿瘤靶向性，可以快速从体内清除。值得注意的是，在给药后的各个时间点，支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组的相对增强信号强度均高于Gd-DTPA组。以上这些结果说明了相比于小分子Gd-DTPA造影剂，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd具有更好的体内成像效果。这一方面可能归因于其更好的弛豫效能，另一方面可能归因于其由于具有较大的分子量，因而具有更长的体内循环时间，从而能够更多的在肿瘤部位积累。

试验例9、体内抗肿瘤评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

通过建立皮下异种移植的4T1肿瘤模型来研究支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd的体内抗肿瘤效果。将4T1细胞悬浮于 70μL PBS(1.4×10⁵个细胞)中并通过皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后腿部位。肿瘤体积计算如下：V＝L×W²×0.5，其中L指的是肿瘤最长的直径，W指的是肿瘤最短的直径)。当肿瘤体积达到大约60-80mm³时，将小鼠随机分成生理盐水组，PTX组合和支化含糖聚合物PTX-DOTA-Gd组(n＝7)。每隔3天分别用上述制剂通过尾静脉注射治疗小鼠，给药剂量为10mg PTX/kg小鼠，共给药4次。同时，每2天记录一次每只小鼠的体重和肿瘤体积。在第21天，对所有的小鼠实施安乐死，分别剖离出肿瘤及主要器官(心，肝，脾，肺，肾)。对每组的肿瘤称重，并使用公式计算抑瘤率(TGI)：TGI ＝(1-W1/W2)×100％，其中W1和W2分别表示治疗组和对照组的平均肿瘤重量。

如图12C所示以异种移植的4T1乳腺肿瘤为模型，观察了不同给药组对小鼠肿瘤生长的抑制情况，各给药组小鼠肿瘤体积变化如图 12D和12E所示，第一次给药后，生理盐水组的肿瘤表现出快速增长的趋势，PTX组的肿瘤生长速度与生理盐水组相似，而支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组肿瘤生长受到了明显的抑制。从第二次给药之后，PTX组小鼠肿瘤的生长速率相比生理盐水组开始减慢，但经支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd治疗的小鼠的肿瘤生长抑制更为明显，并且在之后的治疗过程中肿瘤生长一直处于抑制状态，没有复长的趋势。给药的第21天后，与生理盐水组相比(相对肿瘤体积约1631％)，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组表现出非常显著的抗肿瘤效果，部分小鼠的肿瘤已经完全消失，其余肿瘤未消失的小鼠肿瘤大小也保持在非常小的水平。而游离PTX所表现的抗肿瘤效果相对较弱(相对肿瘤体积约1049％)，这可能是由于小分子的PTX不具备肿瘤靶向以及长循环的能力，药物进入体内后会快速地从体内清除，难以在肿瘤部位达到足够的药物浓度。

如图12F相比于生理盐水组，材料组的肿瘤重量远低于PTX组和生理盐水组(分别为114.0±49.1mg，873.8±178.1mg和 1214.1±133.1mg),显示出非常明显的肿瘤抑制作用(TGI为90.6％)。与之对比，按照同样PTX浓度给药的游离PTX组TGI仅为28.0％(图 13)。这一结果的原因可能是因为我们制备纳米尺度的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd材料具有长的体内循环时间，能够被动靶向至肿瘤区域，从而提高了药物在肿瘤部位的富集，并且能够在肿瘤特异性的微环境中触发治疗药物的快速释放，由此提升其肿瘤杀伤的作用。此外，在整个治疗期间，荷瘤小鼠的体重变化曲线如图12G 所示。由图可看出在整个治疗期间，各组小鼠的体重没有发生明显的变化，说明支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd材料在具有优异的抗肿瘤疗效的同时，还具有较好的体内安全性。

试验例10、H&E染色，免疫组化分析以及TUNEL分析评价

1)实验材料

实施例1制备的支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd。

2)实验方法与结果

H&E染色方法如下：将固定好的小鼠脏器用自来水冲洗过夜，然后用全自动脱水机各级乙醇脱水、二甲苯透明、两次浸蜡。使用包埋机进行常规石蜡包埋，轮转式切片机将石蜡块切成5μm的石蜡片用于苏木精-伊红(H&E)染色。最后镜检，将所用标本照像。

免疫组化分析采用链霉亲和素-过氧化物酶法：首先将脱蜡并复水后的肿瘤切片分别与单克隆抗CD31抗体(1:200)(北京生物合成生物技术有限公司)和抗Ki-67单克隆抗体(1:200)(北京生物合成生物技术有限公司)在4℃下孵化过夜。然后滴加生物素化山羊抗鼠 /兔IgG二抗(1:200)室温下反应20min；最后通过Motic Images Advanced软件(MoticChina Group CO.,LTD.)获取免疫组化图像，并利用Image-Pro Plus 6.0软件(MediaCybernetics,Bethesda,MD)对 CD31的正染色积分光密度(IOD)进行测量。肿瘤微血管密度(MVD) 通过计算CD31与每张照片总面积的比值来进行测量。

脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL) 分析方法如下：根据制造商所提供的规程，使用原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche Molecular Biochemicals,Laval,Quebec,Canada)来进行 TUNEL分析。光学显微镜被用来观察TUNEL染色阳性的细胞(即凋亡细胞)并且计算每个显微镜视野中凋亡细胞数与总肿瘤细胞数之比作为凋亡指数。

如图14所示，通过H&E染色对治疗结束后各组小鼠的主要器官进行组织学考察发现相比于支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组正常的肝脏组织，生理盐水组和PTX组的肝脏组织切片中均发现较严重的炎细胞浸润。在其他各组脏器中，三个实验组中均未发现明显的器质性毒性。

利用CD31抗原染色来评估肿瘤细胞增殖过程中的血管生成情况，利用TUNEL法检测程序性细胞凋亡情况结果如图12H和图12I所示，血管生成对大多数实体瘤的生长和转移是至关重要的，抑制血管生成是一种重要的抑制肿瘤生长的方法。与生理盐水组相比，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd组中小鼠肿瘤组织MVD-CD31计数明显降低，具有非常显著的统计学意义(p<0.05)。而游离药物PTX组与生理盐水组相比MVD-CD31计数无明显差异，不具备统计学意义 (p>0.05)。该结果说明支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd具有非常好的抑制肿瘤新生血管生成的作用。如图12J的TUNEL染色结果显示，游离药物PTX治疗组的小鼠肿瘤细胞凋亡率约为33.6％，高于生理盐水组凋亡率(15.7％)，但低于支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd治疗组的肿瘤细胞凋亡率(37.7％)。这些结果表明，支化含糖聚合物pGAEMA-PTX-DOTA-Gd能够通过抑制肿瘤部位新生血管的生成和发展，并且高效诱导肿瘤细胞发生凋亡坏死来有效地抑制4T1肿瘤的生长。

综上，本发明通过RAFT聚合，制备了一种多功能的可生物降解的基于含糖聚合物的支化聚合物药物递送系统(支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd)来实现肿瘤的诊疗一体化。该支化聚合物选用具有较高的官能团密度和较大的流体动力学尺寸且拓扑结构与树状聚合物相似的支化含糖聚合物作为骨架，并装载了荧光染料焦脱镁叶绿酸A(Ppa)和金属钆离子螯合物(Gd-DOTA)作为成像基团，同时装载了紫杉醇(PTX)作为治疗性基团。此外，为了确保该支链聚合物的生物降解性和生物安全性，使用了在过表达组织蛋白酶B 的肿瘤微环境中可降解的GFLG四肽接头来制造支链结构。通过对各功能单体与交联剂的比例设计制备了支化含糖聚合物 pGAEMA-PTX-DOTA-Gd纳米粒子，相比于临床造影剂Gd-DTPA, 本发明制备的纳米粒子能够显著改善小分子造影剂的药理学性质，使其具有更长的血液半衰期，更多的肿瘤部位积累量，更高的肿瘤信号强化程度和更长的强化持续时间以及更好的肿瘤强化特异性等。同时，体外实验表明该纳米粒子能够快速被细胞摄取，并在肿瘤细胞内组织蛋白酶B响应性降解和释放化疗药物PTX，诱导产生与游离药物接近的细胞毒性。体内实验表明，该纳米粒子能够显著改善小分子药物的体内分布，可以通过EPR效应在肿瘤部位有效积累，通过降低新生血管生成以及诱导肿瘤细胞凋亡等方式显著抑制4T1异种移植瘤的生长，并具有良好的生物安全性。因此，本发明开发的基于支化的含糖聚合物载体的多功能纳米药物递送系统在肿瘤诊疗一体化研究领域具有巨大的发展潜力。