具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提出一种用于检测T-2毒素的胶体金试纸条，通过配合手持式读卡器可以定性测定样品中的T-2毒素。本发明实施例通过对试纸条的条件进行深入的研究，从而大大降低了T-2毒素的最低检出限，从而获得一种线性范围宽、检测限低、灵敏度高的T-2毒素定量检测方法。胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，NC膜上设置有T线和C线。

其中，样品垫中包被有T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金；包被量为2～5μg/mL的T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金4～6μL，优选为4μg/mL的T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金5μL。经氯化钠聚沉法测定，3μg/mL的T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金标记最为稳定，为了让胶体金跟单抗的偶联更为充分，另加入20％单抗量，即单抗标记终浓度为4μg/mL的胶体金用于试纸条的制备。

T线处包被有T-2毒素完全抗原，用于竞争结合T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金；包被量为1～1.5mg/mL的T-2毒素完全抗原4～6μL；优选为1mg/mL的T-2毒素完全抗原5μL。根据筛选试验发现，包被量为1～1.5mg/mL的T-2毒素完全抗原显色效果良好，差异不大，从成本角度考虑，可采用1mg/mL的抗原浓度。如果T-2毒素完全抗原的浓度低于这个范围可能会因为结合的胶体金数量较少而使最大显色值降低，使得检测范围变窄；如果T-2毒素完全抗原的浓度高于这个浓度，可能会因为结合的胶体金数量过多而使得检测限升高。

C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金；包被量为0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体4～6μL，优选为0.3mg/mL羊抗小鼠抗体5μL。C线抗体划线液制备而成，C线抗体划线液为含有0.1～0.3mg/mL羊抗小鼠抗体、质量百分比浓度为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液；优选的，羊抗小鼠抗体的浓度为0.3mg/mL；更优选的，C线抗体划线液的pH值为8.5。

经实验发现，该浓度与包被量与T线配合，可提高试剂盒的灵敏度。如果羊抗小鼠抗体的浓度低于这个范围可能会因为无法完全结合的胶体金，而使显色值降低，影响对T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金性能的判定；如果羊抗小鼠抗体的浓度高于这个浓度，可能会导致材料浪费，增大制备成本。

在本发明实施例中，T线和C线之间的距离为4～7mm，优选4.5～5.5mm，最优选5mm，T线与C线距离5mm的T线阴性显色效果最佳。如果距离过宽，则导致金标抗体在层析过程中吸附在NC膜上过多，导致背景值较高，阴阳性的T线显色抑制信号不明显。

在本发明实施例中，T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金的制备方法具体为：

S1、制备胶体金溶液；其中，采用1.5mL 1％柠檬酸钠溶液与1mL 1％氯金酸溶液制备胶体金溶液；经实验证实，该条件制备得到的胶体金溶液的稳定性良好。

S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入4μg T-2毒素单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，离心，最后加入100μL的抗体稳定液重悬；得到T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金。采用该浓度T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金的稳定性最佳。

抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、质量百分比浓度为10％蔗糖、0.02M的PB缓冲液，pH为6.2。

进一步优选的，胶体金的制备方法为：在S1中，在沸水浴的容器中加入1％柠檬酸钠1.5mL，在搅拌状态下迅速加入1mL 1％氯金酸，待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至45～55℃、优选50℃停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL。

在本发明实施例中，T线由T线抗原划线液制备而成，T线抗原划线液的pH为7.5～8.5、优选8.0～8.5、更优选8.5；T线抗原划线液中T-2毒素完全抗原的浓度为1～1.5mg/mL。优选的，T线抗原划线液为含有1～1.5mg/mL的T-2毒素完全抗原、质量百分为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液。

在本发明实施例中，C线由C线抗体划线液制备而成，C线抗体划线液为含有0.1～0.3mg/mL羊抗小鼠抗体、质量百分为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液。羊抗小鼠抗体的浓度优选为0.3mg/mL。

在本发明实施例中，划线液的流量均为1μL/cm，优选的，划好的NC膜放入烘箱36～37℃条件下烘干4～8h。

本发明实施例中还涉及一种用于检测T-2毒素的试剂盒，试剂盒中含有上述的胶体金试纸条，试剂盒中还含有样本处理液、T-2毒素加标溶液和样品稀释液；

其中：样本处理液为体积百分比浓度为70％甲醇水溶液；

T-2毒素加标溶液中T-2毒素的浓度范围为0～200ng；

样品稀释液为：含有质量百分比含量为0.05％PEG6000、质量百分比含量为5％蔗糖、20mM的PB溶液，pH为6.2。

本发明实施例还涉及一种T-2毒素的检测方法，采用上述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：

S1、对待测样本加入样本处理液，得混合物；

S2、在混合物中加入所述T-2毒素加标溶液使T-2毒素加标样品的浓度为0～200ng/g，混合后离心，取100μL上清，用样品稀释液0.6mL稀释混匀，得到待测液；

S3、在试纸检测卡的样品孔中加入待测液200μL，计时6min后通过手持式读卡器测定显色值。

可选的：待测样本选自食用油或粮食作物制备的粉状物。

下面通过实施例和实验例进一步说明本发明实施例：

实施例和实验例所用到的主要实验试剂：T-2标准品，氯金酸、柠檬酸钠、碳酸钠购于天津渤化试剂，牛血清白蛋白、SDS购自索莱宝(北京)生物技术有限公司，Sartorius-95硝化棉(NC)膜、样品垫、吸水纸、玻璃纤维和聚氯乙烯衬底均购自上海杰一生物科技有限公司。T-2毒素单克隆抗体购自上海飞测生物科技有限公司，T-2毒素完全抗原(T2-BSA)购自天津浩泰科技有限公司，其他化学品均为分析级，来自中国上海国药化学试剂有限公司。采用Mill-Q纯化的超纯水(18.2MΩcm-1)制备相关溶液。

手持式读卡器为FD-200性手持式食品安全快速检测仪，购自上海飞测生物技术有限公司。

实施例1

步骤一胶体金纳米颗粒的制备

将搅拌桨、玻璃器皿均放在酸缸中浸泡过夜，清洗干净；组装搅拌桨至搅拌器上，打开电热套预热5min；待烧瓶中水沸腾后，加入1.5mL、的1％柠檬酸钠。

之后打开搅拌器使其混匀，调整转速至500rpm，迅速加入1mL 1％氯金酸。待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL。

步骤二T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

取1mL胶体金，加入0.1M碳酸钠20μL调整pH至8.5左右，加入4μg/mL T-2毒素单克隆抗体，混匀30min，加入10％BSA 120μL，封闭15min，10000rpm离心15min，弃上清，加入抗体稳定液1mL，复溶沉淀，继续8000rpm离心15min，重复2次，最后再加入100μL的抗体稳定液重悬。

抗体稳定液的组成为：含有质量百分比浓度为0.05％PEG6000、质量百分比浓度为10％蔗糖的0.02M的PB缓冲液，pH为6.2。

实施例2试纸条的制备

配制T线抗原划线液：含有1.5mg/mL的T-2毒素完全抗原(T2-BSA)，蔗糖2.5wt％、50mM的PB溶液，pH值为8.5；

配制C线抗体划线液：含有0.3mg/mL羊抗小鼠抗体，含有2.5wt％蔗糖、50mM PB溶液稀释，pH值为8.5。

将T线抗原划线液、C线抗体划线液分别划线包被到NC膜上，划线流量均为1μL/cm，T线与C线的距离5mm。将划好的NC膜放入烘箱37℃烘干4h，取出。

将实施例1制备的T-2毒素单克隆抗体标记的胶体金以5μL/cm的速度喷涂在结合垫上，每条结合垫重复喷涂3次，完成后置于37℃烘箱中烘干6h，取出；粘贴样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫。

具体粘贴方法：首先粘贴NC膜，再将结合垫粘贴在NC膜下端，与NC膜重叠2mm，随即粘贴样品垫在结合垫下端，同样与NC膜重叠2mm；取吸水垫粘贴到NC膜上方，与NC膜重叠2mm，将上述的材料压紧后裁成5mm宽的试纸条，装入检测卡槽内备用。

试纸条的使用方法为：

S1、对待测样本加入样本处理液，得混合物；样本处理液为体积百分比浓度为70％甲醇水溶液；

S2、在混合物中加入T-2毒素加标溶液使T-2毒素加标样品的浓度为0～200ng/g，混合后离心，取100μL上清，用样品稀释液0.6mL稀释混匀，得到待测液；T-2毒素加标溶液中T-2毒素的浓度范围为0～200ng；品稀释液为：含有质量百分比含量为0.05％PEG6000、质量百分比含量为5％蔗糖的浓度为20mM的PB溶液，pH为6.2；

S3、在试纸检测卡的样品孔中加入待测液200μL，计时6min后通过手持式读卡器测定显色值。

实验例1

1、胶体金纳米颗粒的优化

将搅拌桨、玻璃器皿均放在酸缸中浸泡过夜，清洗干净；组装搅拌桨至搅拌器上，打开电热套预热5min；待烧瓶中水沸腾后，通过加入1.5mL、1.6mL、1.7mL、1.8mL、1.9mL的1％柠檬酸钠以优化合成的胶体金的稳定性。

之后打开搅拌器使其混匀，调整转速至500rpm，迅速加入1mL 1％氯金酸。待溶液变成酒红色后，撤去热源，继续搅拌；温度降至50℃左右停止搅拌，取胶体金用容量瓶定容至100mL，测定紫外吸收峰。结果如图1所示。

由图1可知，在加入1.5mL 1％柠檬酸钠其合成的胶体金最大吸收峰为524nm，通过加入乙酸破坏的破坏试验，未出现变紫、聚沉的情况，说明胶体金稳定性良好。

2、T-2毒素单克隆抗体标记量的优化

取OD值为1的胶体金1mL于EP管中，每管加入20μL 0.1M Na₂CO₃，混匀后加入0、1μg、2μg、3μg的T-2毒素单克隆抗体，37℃震荡30min，加入10％NaCl 100μL，混匀后静置30min，分析结果。

采用Mey氏稳定性实验，即氯化钠聚沉法推测最佳单克隆抗体标记量，由图2所示，单克隆抗体标记终浓度为3μg/mL胶体金，加入氯化钠后其几乎无变色，因而可选取单抗标记终浓度为3μg/mL胶体金，另加入20％单抗量，即单抗标记终浓度为4μg/mL的胶体金用于试纸条的制备。

实验例2反应膜的制备及包被抗原浓度

将T-2毒素-牛血清白蛋白偶联物即T-2毒素完全抗原包被到T线上构成检测线，将羊抗小鼠抗体包被在C线上构成质控线。为了提高试纸条的灵敏度与稳定性，对于T线抗原划线液的pH值、抗原浓度以及T线与C线的间距进行了优化。

具体实验方法为：(1)调节T线抗原划线液的pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，其余步骤均同实施例2。制备得到试纸条A1～A6(未装入检测卡槽)。每种试纸条取4个，2个加入阴性待测液(0.02M的PB缓冲液)，2个加入阳性待测液(20ng/mL的T2毒素)，获得pH优化的实验结果如图3所示。

由图3可知，pH的改变对于T线显色效果会产生一定的影响，但偏碱性可以提高显色效果，原因是以碱性的条件包被可提高蛋白在膜上的吸附效率。后续实验均采用pH为8.5的划线缓冲液体系。

(2)调节T线抗原划线液的抗原划线浓度分别为1mg/mL、1.25mg/mL、1.5mg/mL，其余步骤均同实施例2。制备得到试纸条B1～B3(未装入检测卡槽)。每种试纸条取4个，均加入阳性待测液(20ng/mL的T2毒素)，获得抗原浓度优化的实验结果如图4所示。

由图4可知，抗原划线浓度在1～1.5mg/mL差异不大，在2min内即可有明显的显色效果。

(3)调整划线仪的T线与C线划线笔的间距，分别调整距离为5～8mm，其余步骤均同实施例2；制备得到试纸条C1～C4(未装入检测卡槽)。每种试纸条取4个，2个加入阴性待测液(蒸馏水)，2个加入阳性待测液(20ng/mL的T2毒素)，获得T线与C线的间距优化如图5所示。

由图5可知，试纸条上T线与C线距离5mm的T线阴性显色效果最佳，相距较宽的实验组(相距8mm)阴性样本、阳性样本的T线显色抑制信号不明显。

实验例3

以食用油为样品，进行实际样品检测。

针对食用油的前处理：称取1g食用油，加入样本处理液，即70％甲醇水溶液0.5mL，再加入T-2毒素加标溶液使加标浓度为200ng/g，震荡2min，5000rpm离心5min，取100μL上清，用0.6mL样品稀释液稀释混匀，得到待测液。

取实施例2制备的胶体金试纸检测卡，于样品孔加入200μL待测液，静置2min后插入纸条，计时6min后通过手持式读卡器测定显色值。检测食用油的结果见图6～图8。

由图6～图8可知，其检测T-2毒素的样品的线性范围为：3.13～50μg/kg(1.78～28.57ppb)；检出限为：1.52μg/kg(0.869ppb)。

实验例4

以玉米粉为样品，进行实际样品检测。

针对玉米样品的前处理：称取1g玉米粉，加入样本处理液，即70％甲醇水溶液2mL，再加入T-2毒素加标溶液使加标浓度为200ng/g，震荡2min，5000rpm离心5min，取100μL上清，用0.6mL样品稀释液稀释混匀，得到待测液。

取实施例2制备的胶体金试纸检测卡，于样品孔加入200μL待测液，静置2min后插入纸条，计时6min通过手持式读卡器测定显色值。检测玉米粉的结果见图9～图11。

由图图9～图11可知，检测T-2毒素的线性范围为：6.25～100μg/kg(0.44～7.14ppb)；检出限为：6.68μg/kg(0.47ppb)。

本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。