一种检测液体食品中苯甲酸的胶体金免疫层析试纸条
阅读说明：本技术 一种检测液体食品中苯甲酸的胶体金免疫层析试纸条 (Colloidal gold immunochromatographic test strip for detecting benzoic acid in liquid food ) 是由 张西亚 丁明月 毛烨炫 党梦 黄现青 谢新华 马燕 乔明武 左靖南 李子哲 王尤 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于免疫学技术领域,涉及用于检测液体食品中苯甲酸的胶体金免疫层析试纸条,具体涉及胶体金粒径对侧流层析免疫分析灵敏度的影响。本发明以苯甲酸为模式分子,采用梯度柠檬酸加入,还原法合成不同纳米粒径的胶体金,作为金标探针,制备不同纳米粒径的金标抗体,系统比较不同纳米粒径的胶体金对侧流层析的影响,为提高侧流层析的灵敏度以及苯甲酸的检测提供依据。该试纸条灵敏度高,能够用于快速检测液体食品特别是牛奶中苯甲酸残留的胶体金,cut-off值是4mg/kg,能够满足检测需求。(The invention belongs to the technical field of immunology, relates to a colloidal gold immunochromatographic test strip for detecting benzoic acid in liquid food, and particularly relates to the influence of the particle size of colloidal gold on the sensitivity of lateral flow chromatography immunoassay. According to the method, benzoic acid is used as a mode molecule, gradient citric acid is added, colloidal gold with different nano-particle sizes is synthesized by a reduction method and used as a gold-labeled probe to prepare gold-labeled antibodies with different nano-particle sizes, the influence of the colloidal gold with different nano-particle sizes on lateral flow chromatography is systematically compared, and a basis is provided for improving the sensitivity of the lateral flow chromatography and detecting the benzoic acid. The test strip is high in sensitivity, can be used for rapidly detecting the residual colloidal gold of benzoic acid in liquid food, particularly milk, has a cut-off value of 4mg/kg, and can meet the detection requirement.)
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及用于检测液体食品中苯甲酸的胶体金免疫层析试纸条，具体涉及胶体金粒径对侧流层析免疫分析灵敏度的影响。
背景技术
胶体金(Colloidal Gold)也称为金溶胶(Gold Sol)，胶体金颗粒的结构包括中心的金原子以及包围在外层的双离子层，负离子AuCl2-的内层紧紧包裹着金原子的表面，外层则吸附着大量的正离子H+，并且表现出较好的单向分布状态。根据有关报道，传统的胶体金纳米粒子(20nm)具有较低的摩尔消光系数和较差的颜色性能，使其作为免疫层析技术探针载体的检测灵敏度较低。若胶体金粒径过大，在作为探针载体识别抗原的过程中会产生一定的空间位阻，对侧流层析的灵敏度造成影响。虽然有关胶体金制备方法的文献报道和研究很多，但其中最常见、最简便的方法是化学还原法，还原剂一般包括柠檬酸三钠、对苯二酚、硼氢化钠、白磷、羟胺、鞣酸等，通过改变还原剂的剂量和种类，可以制备出不同纳米粒径的胶体金颗粒。
免疫层析技术作为目前最流行的现场快速检测方法之一，因具有简单方便、准确性高、无需特殊仪器设备等特点，已被广泛应用于许多领域。胶体金纳米粒子具有容易标记、安全无毒、低成本、易合成等优势，是目前免疫层析方法中最常用的探针标记材料。有文献报道说明不同粒径胶体金对免疫分析的灵敏度具有一定影响，但是没有系统合成不同粒径的胶体金纳米颗粒以研究它们对侧流层析灵敏度的影响。因此，系统研究不同粒径的胶体金对侧流层析灵敏度的影响，十分必要。
苯甲酸作为一种常见的酸性防腐剂，对食品具有抑菌防腐的作用，能够有效延长食品货架期，然而过量添加苯甲酸会严重损害人体健康，建立一种快速有效检测食品中苯甲酸残留的方法具有重要的意义。目前，以胶体金作为探针标记材料采用免疫层析技术对食品中的苯甲酸进行分析未见相关报道。
发明内容
因此，本发明目的在于构建一种可以检测液体食品中苯甲酸残留的胶体金试纸条。
为实现本发明目的，本发明以苯甲酸为模式分子，采用梯度柠檬酸加入，还原法合成不同纳米粒径的胶体金，作为金标探针，制备不同纳米粒径的金标抗体，系统比较不同纳米粒径的胶体金对侧流层析的影响，为提高侧流层析的灵敏度以及苯甲酸的检测提供依据。
本发明通过以下具体技术方案实现：1、本发明所述试纸条包括PVC底板，PVC底板上从左到右依次为样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上包被有苯甲酸与蛋白质的偶联物作为T线、羊抗鼠多抗作为C线。
将粒径在20.94～31.47nm的胶体金溶液与苯甲醛抗体偶联制备成金标抗体作为信号探针，每毫升胶体金溶液中加入0.1M K2CO3 9μL调节pH，金标抗体用量为15ml。在此条件下，试纸条T线、C线显色较好，适合做侧流层析的标记物。优选，粒径为23.27nm的胶体金作为最优标记探针。
所述胶体金颗粒通过如下方法制备：将氯金酸溶液(质量百分浓度为0.01％)用加热磁力搅拌器加热至沸腾；然后加入质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，用量分别为1000、950、900、850、800、500、450、400μL；反应后停止加热，冷却后得到20.94、23.27、27.9、31.47、38.5、59.56、74.8、90nm不同粒径的胶体金溶液，保存备用。
2、建立标准曲线：
(1)在优化出不同粒径胶体金反应的最佳条件下，添加一系列浓度的苯甲酸标准品，以苯甲酸标准品添加浓度的对数值为横坐标，以显色读数仪检测的比色数值作为纵坐标进行标准曲线的绘制，对比胶体金的抑制曲线，以cut-off值和IC50值(半数抑制浓度)值进行判定，筛选出对侧流层析免疫分析灵敏度最高的纳米粒径胶体金。
(2)最终筛选出粒径为23.27nm胶体金与苯甲醛抗体偶联制备成金标抗体作为信号探针，以其标准曲线为参照，采用侧流层析免疫分析方法对液体食品中苯甲酸进行测定，从而实现定性、定量检测。其优选检测条件为：每毫升胶体金溶液中加入0.1M K2CO3 9μL调节pH，金标抗体加入量为15ml。
本发明创新点及优点：1、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过改变加入的柠檬酸三钠与氯金酸比例制备不同粒径的胶体金，并将制备好的胶体金利用静电吸附原理与抗体偶联制备金标抗体作为信号探针。探究了不同粒径的胶体金对侧流层析灵敏度的影响，优化了胶体金的pH值、金标抗体的添加量、筛选出灵敏度最高的胶体金粒径，并建立了标准曲线，制备出灵敏度较高，能够用于快速检测液体食品特别是牛奶中苯甲酸残留的胶体金试纸条，cut-off值是4mg/kg，能够满足检测的需求。
附图说明
图1为本发明不同粒径胶体金颜色对比图；
图2为本发明不同粒径胶体金紫外吸收图谱；
图3为本发明不同粒径胶体金的20nm尺寸透射电镜图；
图4为本发明不同粒径胶体金与抗体标记最佳K2CO3量的确定；
图5为本发明不同金标抗体用量检测线显色强度变化柱形图；
图6为本发明不同粒径胶体金免疫竞争结果图；
图7为本发明不同粒径胶体金免疫层析试纸条测定苯甲酸的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，以下没特别说明，百分比均为质量百分比含量。
实施例1、苯甲酸胶体金试纸条的组装
1.1溶液的配制
样品垫处理液：准确称取牛血清白蛋白2g，吐温-20 0.2mL，蔗糖10g，proclin 3000.04mL，用磷酸盐缓冲液(PBS，10mmol/L，pH 7.4)溶解且定容至200mL。
碳酸盐缓冲液(CB，0.05mol/L，pH 9.6)：准确称取Na2CO3 1.59g、NaHCO32.93g，去离子水溶解且定容至1000mL。
二抗稀释液：牛血清白蛋白1g，Proclin 300 0.02mL，磷酸盐缓冲液(PBS)溶解定容至100mL。
1.2样品垫的处理
将切割好的样品垫用样品垫处理液充分浸泡后取出放入鼓风干燥机，37℃干燥12h备用。
1.3质控线和检测线的包被
T线(检测线)：用碳酸盐缓冲液将苯甲酸抗原配制成浓度为0.7mg/mL的溶液，用划膜仪包被在硝酸纤维素膜的检测区域，并37℃干燥12小时。
C线(质控线)：用羊抗鼠二抗稀释液将羊抗鼠IgG二抗配制成浓度为0.5～1.0mg/mL的溶液，用划膜仪喷涂在硝酸纤维素膜的质控区域，并37℃干燥12小时。
1.4试纸条的组装
将处理过的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，分别粘贴于PVC底板上，且样品垫和吸水垫对硝酸纤维素膜均有2mm的重叠。
1.5切条
将粘贴完成且充分干燥的试纸板放入数控切条机切割成3.2mm宽的试纸条，将切割好的试纸条装入密封袋备用。
实施例2胶体金的制备与鉴定
2.1胶体金的制备
2.1.1制备胶体金玻璃器皿的处理
制备胶体金的锥形瓶首先用自来水冲洗干净再放入浓酸(重铬酸钾100g，浓硫酸200mL，加蒸馏水至1000mL)当中浸泡24小时，用超纯水洗3-4遍，然后放入干燥箱中烘干备用。
2.1.2溶液的配制
1％氯金酸的配制：称取1g氯金酸加入100mL超纯水中，混匀，用1.5mL离心管分装，每管l mL，4℃冰箱保存备用。
1％柠檬酸三钠的配制：取1.14g二水合柠檬酸三钠溶于100mL超纯水中，溶解后用滤膜过滤，封口备用。
2.1.3柠檬酸三钠还原法制备不同粒径胶体金
(1)取250mL三角瓶，加100mL去离子水及1mL 1％氯金酸溶液(最终浓度为0.01％)，用加热磁力搅拌器加热至沸腾；
(2)当氯金酸水溶液沸腾后2min后，在搅拌的过程中迅速加入1％柠檬酸三钠溶液的量分别为1000、950、900、850、800、500、450、400μL；
(3)金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，当溶液由紫红色逐渐向红色转变，最后形成酒红色澄清溶液；
(4)停止加热，冷却后重新定容至原来体积，4℃保存备用。
2.2胶体金的鉴定
金溶胶颗粒的直径和制备与加入的柠檬酸三钠量是密切相关，保持其他条件恒定仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶。本发明主要制备了粒径为20-90nm的胶体金颗粒，该范围内的金颗粒最适用于快速诊断使用。
外观鉴定：通过肉眼观察所制备的8种不同粒径的胶体金溶液，如图1所示，均呈现澄清透明、无聚沉物，说明所制备的胶体金溶液质量较好，并且随着粒径的增大，胶体金溶液由鲜红色逐渐变为紫红色。
紫外扫描鉴定：将制备好的胶体金进行紫外扫描，通过紫外扫描图谱确定最大吸收波长，如图2所示八种胶体金的最大吸收波长分别为523.5、524.5、526.5、528、531、540、546.5、553nm，根据公式Y＝0.4271X+514.56(其中Y为胶体金的最大吸收波长，X为胶体金的粒径)计算为所对应的胶体金粒径大小分别为20.94、23.27、27.9、31.47、38.5、59.56、74.8、90nm。
电镜透射鉴定：应用透射电镜对胶体金颗粒的结构进行评价，通过电镜透射观察胶体金颗粒大小及均匀度，理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在；劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大。通过透射电镜表征如图3可以看出，所制备的8种不同粒径的胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，具有一定规则的形状，均一性较好，且所测得的胶体金颗粒大小与紫外扫描鉴定结果基本一致。
实施案例3胶体金侧流层析法的构建
3.1溶液的配制
0.1mol/L的K2CO3：准确称取0.138g K2CO3，加入6mL的去离子水溶解混匀，用超纯水定容至10mL。
碳酸盐缓冲液(CB，0.05mol/L，pH 9.6)：准确称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，使用去离子水溶解并定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液(PBS，10mmol/L，pH 7.4)：准确称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g于烧杯中，用去离子水溶解并定容至1000mL。
样品稀释缓冲液(0.5％PBST)：量取磷酸盐缓冲液1000mL，加入Tween-200.5mL，涡旋混匀。
金标抗体重悬液：准确称取牛血清白蛋白1g，Proclin 300 0.02mL，葡萄糖400001g，PEG 20000 0.05g，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液溶解并定容至100mL。
3.2金标抗体的制备
(1)取出1.5mL EP管用超纯水润洗，用移液枪吸取1mL胶体金于每管内；
(2)加入最适添加量的0.1M K2CO3溶液调pH值至最佳状态，涡旋混合器混匀，静置10min；
(3)加入抗苯甲酸的单克隆抗体10μg，涡旋混匀，静置20min；
(4)每管加入20μL 10％的BSA溶液，静置30min；
(5)将金标抗体放入高速离心机8500rpm/min离心10min；
(6)将离心后的金标抗体弃去上清液。然后用胶体金探针重悬液将沉淀重悬至0.2mL，混匀后放在4℃备用。
3.3最佳pH值的优化
(1)取出一系列EP管用超纯水润洗，用移液枪吸取1mL胶体金于管内；
(2)调pH值：20.94nm和31.47nm胶体金的碳酸钾添加量分别为3、5、7、9μL；23.27nm、27.90nm、38.50nm、59.56nm胶体金的添加量分别为5、7、9、11μL；74.80nm和90.00nm胶体金的碳酸钾添加量分别为0、10、15、20μL；(3)加入抗苯甲酸的单克隆抗体10μg，涡旋混匀，静置20min；
(4)通过肉眼观察胶体金颜色的变化及试纸条显色情况来进行初步的判定。
(5)以肉眼观察胶体金第一管颜色呈现出透亮的酒红色、无聚沉的金标抗体所对应的碳酸钾的添加量为最适pH值，进行后续优化。
不同粒径的胶体金溶液标记抗体的最佳pH值不同，因此在标记抗体的时候添加的碳酸钾量不同，以调整最佳标记pH条件。对不同粒径的胶体金溶液来说，随着碳酸钾添加量的逐渐增大，胶体金溶液的颜色会逐渐加深，由浅紫色变成鲜红色再变为紫红色，当碳酸钾添加量过少或为0时，胶体金溶液的pH值会低于抗体的等电点，此时抗体带正电荷，与带负电荷的胶体金结合形成较大颗粒，胶体金的稳定状态被破坏，造成胶体金颗粒聚沉，颜色发生改变。当碳酸钾添加量过大时，胶体金溶液pH值偏大，不利于实验的进行。因此，在本研究中，仅展示每种粒径适宜范围内的四组pH值作为对比，如图4所示，20.94nm、31.47nm的胶体金溶液碳酸钾添加量为3、5、7、9μL，23.27nm、27.90nm、38.50nm、59.56nm的胶体金溶液碳酸钾添加量为5、7、9、11μL，74.80nm、90.00nm的胶体金溶液的碳酸钾添加量为0、10、15、20μL。
通过肉眼观察图4不同K2CO3用量下各粒径胶体金颜色变化，可以明显看出，对于20.94nm、23.27nm、27.90nm、31.47nm及59.56nm的胶体金溶液，添加0.1M K2CO3 9μL时胶体金与抗体反应时颜色变化最小，颜色仍呈现红色，说明胶体金与抗体吸附较好，所以最终确定20.94nm、23.27nm、27.90nm、31.47nm及59.56nm粒径的胶体金每毫升加入0.1M K2CO3 9μL调节pH至最佳；对于38.50nm粒径的胶体金溶液，添加0.1M K2CO3 11μL时颜色变化最小，且无聚沉现象发生，所以38.50nm胶体金与抗体标记的最佳pH为每毫升胶体金加入0.1M K2CO311μL；对于74.80nm和90.00nm的胶体金溶液，当0.1MK2CO3添加量为15和20μL时，两者溶液颜色均呈红色，由于碳酸钾添加量过大不利于实验的进行，因此74.80nm和90.00nm的胶体金溶液选择15μL的0.1M K2CO3添加量最为最佳标记pH条件。
3.4金标抗体用量的优化
根据试纸条颜色判断，选取呈色较好、仪器显色读值T线数值在900±50之间，且在进行竞争实验过程中呈现出较高的抑制率，同时质控线和检测线差别较大的金标抗体添加量；从灵敏度方面来判断，在呈色较好的基础上，选取cut-off值(最低检出限)最低的金标抗体的添加量。图5为不同粒径胶体金随着金标抗体用量不同，T线的读值变化情况，由图可知，八种不同粒径的胶体金制备的金标抗体添加量为10μL时，T线显色普遍较浅，容易出现假阴性的现象，不利于肉眼的判读；当金标抗体添加量为20μL时，T线显色较深，但过低的抑制率导致试纸条的灵敏度较低，容易出现假阳性的判读结果；当金标抗体添加量为15μL时，试纸条显色适中，且抑制率较高。因此，选用金标抗体添加量为15μL。
3.5标准曲线的建立
优化出不同粒径胶体金反应的最佳条件后，添加一系列浓度的苯甲酸标准品，以苯甲酸标准品添加浓度的对数值为横坐标，以显色读数仪检测的比色数值作为纵坐标进行标准曲线的绘制，对比胶体金的抑制曲线，以cut-off值和IC50值(半数抑制浓度)值进行判定，筛选出对侧流层析免疫分析灵敏度最高的纳米粒径胶体金。具体操作步骤如下：
(1)用移液枪取最适添加量的金标抗体于一系列的微孔板中；
(2)在一系列的微孔内添加不同量的标准品，使标准品的浓度从左到右依次为0、0.1、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10μg/mL；
(3)用移液枪加入稀释一倍的脱脂牛奶，每孔200μL，用移液枪反复吹打混匀；
(4)垂直将试纸条插入微孔内，定时反应8min；
(5)将反应结束后的试纸条用定量读数仪进行读数，并记录数据；
(6)以标准品的添加浓度的对数值为横坐标，以定量读数仪检测的比色数值作为纵坐标进行标准曲线的绘制。
通过定量检测，结果如图6不同粒径胶体金免疫层析试纸条检测结果图，通过肉眼观察，可得到8种不同粒径的胶体金cut-off值分别为5、4、4、6、6、8、10、10mg/L；图7为不同粒径胶体金免疫层析试纸条检测苯甲酸的标准曲线，通过定量检测，得到8种不同粒径的胶体金IC20值分别为0.326、0.319、0.416、1.011、1.423、0.397、0.393、0.331mg/L，IC50值分别为2.133、2.083、2.412、2.755、3.062、3.112、3.292、3.824mg/L，IC80值分别为7.666、6.556、6.834、5.349、5.886、6.159、5.691、6.003mg/L，同时由不同粒径胶体金检测苯甲酸的标准曲线图可看出，在0.1～8mg/L范围内线性良好。
3.6不同粒径胶体金侧流层析试纸条的检测性能比较
通过系统研究不同粒径胶体金的优化条件，比较不同粒径胶体金侧流层析免疫分析试纸条通过肉眼所观察到的cut-off值、通过标准曲线计算所得半数抑制浓度(IC50)，即通过定性判断参数及定量检测参数，来分析不同粒径的胶体金对侧流层析免疫分析灵敏度的影响。表1为不同粒径胶体金侧流层析免疫分析试纸条的最佳检测条件及测定结果，由图6和表1可看出，在20～90nm胶体金粒径范围内，23.27nm胶体金纳米颗粒作为探针，侧流层析的颜色鲜艳，且T线、C线显色较好，IC50值2.083mg/L，cut-off值为4mg/L，灵敏度最高。由图7不同粒径胶体金免疫探针对苯甲酸标准品浓度的试纸条检测结果可看出，当胶体金粒径大于40nm时，颜色性能及稳定性较差，胶体金颗粒粒径不均一，不易标记等缺陷使其不能得到广泛应用。虽有文献报道制备出80nm的胶体金进行实验，且取得不错的实验结果，但其采用的标记方法与一般标记方法不同。对于20.94～31.47nm粒径范围内的胶体金，当胶体金粒径为23.27nm时，侧流层析颜色鲜艳，IC20值为0.319mg/L，IC50值为2.083mg/L，IC80值为6.556mg/L，cut-off值为4mg/L，灵敏度最高，可作为最优标记探针。
表1不同粒径胶体金侧流层析试纸条最佳检测条件及测定结果
3.7结论
本实验系统研究了胶体金粒径大小对侧流层析灵敏度的影响，以牛奶为例构建了液体食品中苯甲酸高灵敏度的胶体金侧流层析分析方法，结果表明，粒径在20.94～31.47nm的胶体金颗粒作为免疫标记探针，试纸条T线、C线显色较好，适合做侧流层析的标记物，此外，本研究选择23.27nm的胶体金作为最优标记探针，其侧流层析颜色鲜艳，IC50值为2.083mg/L，cut-off值为4mg/L，灵敏度最高，为侧流层析灵敏度的提高提供了直接的实验证据，同时通过实际样品检测方法验证，该方法也能满足碳酸饮料中苯甲酸检测的需要，应用前景广泛。
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