一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法
阅读说明：本技术 一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法 (Method for researching micro distribution of hemicellulose in plant cell wall ) 是由 吉喆 李新婷 吴越 姜小凡 陈夫山 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物超微结构检测技术领域,特别涉及一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法。本发明首先对植物组织切片进行脱蜡质、脱灰分、脱木素,随后,对其进行氢氧化钡选择性分级抽提分离半纤维素；然后对不同抽提阶段的植物组织切片进行洗涤、封闭和第一抗体孵育处理；第一抗体孵育后对植物组织切片进行洗涤并进行第二抗体孵育；最后用激光共聚焦显微镜观察植物组织切片。本发明将氢氧化钡选择性分级抽提半纤维素和可特异性结合不同种类半纤维素的第一抗体结合起来,有效准确地识别观察不同种类半纤维素在植物细胞壁中的分布。(The invention belongs to the technical field of plant ultrastructure detection, and particularly relates to a method for researching micro-distribution of hemicellulose in plant cell walls. Firstly, carrying out wax removal, ash removal and lignin removal on a plant tissue slice, and then carrying out barium hydroxide selective fractional extraction on the plant tissue slice to separate hemicellulose; then, washing and sealing the plant tissue slices at different extraction stages and incubating the slices with a first antibody; washing the plant tissue section after the first antibody incubation and performing second antibody incubation; and finally observing the plant tissue section by using a laser confocal microscope. According to the invention, the hemicellulose is selectively extracted by barium hydroxide in a grading manner and the first antibody capable of specifically binding different types of hemicellulose is combined, so that the distribution of different types of hemicellulose in plant cell walls can be effectively and accurately identified and observed.)
技术领域
本发明属于植物超微结构检测技术领域，特别是涉及一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法。
背景技术
木质纤维生物质来源广泛，可再生，资源丰富，价格低廉，经过一定的生化转化过程可实现木质纤维生物质的高值化利用，制备生物质基能源、生物质基材料、生物质基化学品，替代化石燃料、石油产品等，为开发高效清洁新能源提供可能。半纤维素作为自然界中含量仅次于纤维素的第二大可再生生物质资源，在食品、制药、化学等行业中应用广泛，具有广阔的发展前景。然而，对于不同的原料，组成半纤维素的聚糖种类也各不相同，并且半纤维素与细胞壁中其他组分有着紧密结合或者化学键连接，使得半纤维素在细胞壁中的分布及提取存在巨大困难。例如，半纤维素与木素之间存在化学链接，形成木素与碳水化合物复合体；半纤维素与纤维素之间存在氢键连接和范德华力作用力，形成二者之间的紧密结合。
研究植物细胞壁中半纤维素分布传统的方法有染色法、骨架法、化学剥皮法等，主要是通过化学分析及色谱方法间接地判断半纤维素的分布，实验操作复杂且不能区分聚糖的种类和分枝度以进行精准定位。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法，采用本发明能够显示不同种类、不同分枝度的聚糖在细胞壁中的分布，弥补了传统的半纤维素分布规律研究方法的缺陷。
本发明所述的一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法，包括对植物组织切片依次进行脱蜡质、脱灰分、脱木素处理，对脱木素处理后的植物组织切片进行氢氧化钡选择性分级抽提分离半纤维素；然后对不同抽提阶段的植物组织切片进行洗涤、封闭和第一抗体孵育处理；第一抗体孵育后对植物组织切片进行洗涤并进行第二抗体孵育；最后用激光共聚焦显微镜观察植物组织切片。
其具体步骤为：
(I)截取树干(茎)中部靠近树皮(外皮)的部分为样本，切取厚度为5um的切片，放进索氏提取器，采用体积比为2：1的甲苯/乙醇于90℃下抽提8小时，以去除灰分和蜡质等。抽提后的切片置于通风橱中风干过夜，在40℃烘箱中烘干20小时；
(II)利用pH＝3.6-4.0的6w/v％NaClO2对抽提后的植物样本进行脱木素处理，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素在细胞壁中的分布情况；
(III)利用1.8w/v％Ba(OH)2水溶液处理脱木素的样本，固液比为1g：20mL，室温反应8-10小时；再利用10w/v％KOH水溶液处理样本，固液比为1g：20mL，室温反应10小时；将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏后将其滴入到无水乙醇中，静置过夜，得到半纤维素1，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素1在细胞壁中的分布情况；
(IV)利用1w/v％NaOH水溶液处理步骤(3)处理后的切片样本，固液比为1：20(g/mL)，室温反应10小时，将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏后将其滴入到无水乙醇中，静置过夜，得到半纤维素2，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素2在细胞壁中的分布情况；
(V)利用3w/v％H3BO3水溶液处理步骤(4)处理后的切片样本，固液比为1g：20mL，室温反应8-10小时；再利用18w/v％NaOH水溶液处理样本，固液比为1g：20mL，室温反应10小时；将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏后将其滴入到无水乙醇中，静置过夜，得到半纤维素3，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素3在细胞壁中的分布情况；
(VI)分别对半纤维素1、半纤维素2和半纤维素3进行核磁分析得到相应半纤维素的结构，定位每一步溶出的半纤维素聚糖；
(VII)对上述每一步所剩的植物切片进行激光共聚焦显微镜图像结果分析，观察半纤维素组分分布及溶出情况，还原细胞壁中不同半纤维素的分布。
优选的，步骤(II)中利用pH＝3.6-4.0的6w/v％NaClO2对抽提后的植物样本脱木素的主要步骤如下：样本、NaClO2和蒸馏水按照固液比1：20(g/mL)、固固比1：1.2(g/g)的比例添加，用乙酸调节pH＝3.6-4.0，于70-80℃下反应1小时后，加入NaClO2和乙酸，以质量比计，样本：NaClO2：乙酸＝1：0.5：0.5，反应2小时后，样本反复用蒸馏水冲洗，最后用乙醇洗。
优选的，步骤(III)对于不同来源的样本，KOH的浓度不同，样本来自针叶木植物、阔叶木植物、禾本科植物所对应的KOH的浓度分别为10w/v％、10w/v％、5w/v％。
优选的，步骤(III)、(IV)、(V)中将减压蒸馏后的滤液滴入到无水乙醇时需不断搅拌。
优选的，步骤(II)、(III)、(IV)、(V)中的免疫荧光标记主要包括以下步骤：
(1)用蒸馏水洗样本2分钟，重复一次；
(2)用含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2-7.4，以下出现的0.01M磷酸盐缓冲溶液均为此pH值)洗样本30分钟；
(3)用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗2分钟，重复三至五次；
(4)用羊血清在室温下封闭样本40至50分钟，羊血清需用0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释；
(5)对样本进行第一抗体孵育；第一抗体用含1-3w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释，样品置于无菌的培养皿中加盖，在4℃冰箱中孵育48小时；
(6)用含1-3w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液洗样本2分钟，重复一次；
(7)用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗样本2分钟，重复四次；
(8)对样本进行第二抗体孵育，第二抗体用含1-3w/v％的0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释，样品置于无菌的培养皿中加盖，在室温下孵育2-4小时；
(9)用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗10分钟，重复三次；
(10)用蒸馏水洗样本3分钟；
(11)样品置于无菌的培养皿中加盖虚掩，在室温黑暗的条件下风干过夜；
(12)用防荧光淬灭剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察。
优选的，所述第一抗体为抗线性或低分枝度木聚糖的LM10或者抗低分枝度和高分枝度木聚糖的LM11或者抗线性半乳糖葡萄糖甘露聚糖的LM21或者抗高分枝度半乳糖甘露聚糖的LM22。
优选的，所述第二抗体是Alexa 488标记的羊抗鼠抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提出了一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法，能够显示不同种类、不同分枝度的聚糖在细胞壁中的分布，弥补了传统的半纤维素分布规律研究方法的缺陷。本发明对半纤维素的局部化学研究有积极地促进作用，为研究植物细胞壁形成过程中半纤维素沉积规律以及半纤维素的选择性分离提取等提供了有效手段。
附图说明
图1为线性或低分枝度木聚糖在马尾松细胞壁中分布的激光共聚焦显微镜观察结果；
图2为线性半乳糖葡萄糖甘露聚糖在马尾松细胞壁中分布的激光共聚焦显微镜观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围由权利要求书限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布规律的方法，所述方法包括：
步骤1：截取马尾松树干中部靠近树皮的部分为样本，切取厚度为5μm的切片，放进索氏提取器，采用体积比为2：1的甲苯/乙醇于90℃下抽提8小时，以去除灰分和蜡质等。抽提后的切片置于通风橱中风干过夜，在40℃烘箱中烘干20小时；
步骤2：利用pH＝3.6-4.0的6w/v％NaClO2对抽提后的植物样本进行脱木素处理，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素在细胞壁中的分布情况；
上述的脱木素处理步骤：样本、NaClO2和蒸馏水按照固液比1：20(g/mL)、固固比1：1.2(g/g)的比例添加，用乙酸调节pH＝3.6-4.0，于70-80℃下反应1小时后，加入NaClO2和乙酸，以质量比计，样本：NaClO2：乙酸＝1：0.5：0.5，反应2小时后，样本反复用蒸馏水冲洗，最后用乙醇洗。
上述的免疫荧光标记步骤如下：
a.用蒸馏水洗样本2分钟，重复一次；
b.用含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，以下出现的0.01M磷酸盐缓冲溶液均为此pH值)洗样本30分钟；
c.用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗2分钟，重复三次；
d.用羊血清在室温下封闭样本40分钟，羊血清用0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释；
上述的羊血清与0.01M磷酸盐缓冲溶液体积比为1：20；
e.对样本进行第一抗体(LM10，可特异性结合线性或低分枝度木聚糖；LM11，可特异性结合低分枝度和高分枝度木聚糖；LM21，可特异性结合线性半乳糖葡萄糖甘露聚糖；LM22，可特异性结合高分枝度半乳糖葡萄糖甘露聚糖)孵育；第一抗体用含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释，样品置于无菌的培养皿中加盖，在4℃冰箱中孵育48小时；本发明实施例所用第一抗体LM10、LM11、LM21、LM22的生产厂家是Paul Knox Cell WallLab at the University of Leeds。
上述的第一孵育液由第一抗体LM10：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液按1：20(v/v)制得；或者由第一抗体LM11：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液按1：20(v/v)制得；或者由第一抗体LM21：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液按1：50(v/v)制得；或者由第一抗体LM22：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液按1：50(v/v)制得；
f.用含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液洗样本1分钟，重复一次；
g.0.01M磷酸盐缓冲溶液洗样本2分钟，重复四次；
h.对样本进行第二抗体(可特异性结合第一抗体)孵育，第二抗体用含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液稀释，样品置于无菌的培养皿中加盖，在室温下孵育4小时；
上述的第二抗体孵育液由第二抗体：含1w/v％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液＝1：50(v/v)制得；
i.用0.01M磷酸盐缓冲溶液洗10分钟，重复三次；
j.用蒸馏水洗样本3分钟；
k.样品置于无菌的培养皿中加盖虚掩，在室温黑暗的条件下风干过夜；
l.用防荧光淬灭剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察。得到的激光共聚焦显微镜的图像用于分析马尾松细胞壁中线性或低分枝度木聚糖、低分枝度和高分枝度木聚糖、线性半乳糖葡萄糖甘露聚糖和高分枝度半乳糖葡萄糖甘露聚糖的分布特征。
步骤3：利用1.8w/v％Ba(OH)2水溶液处理脱木素的样本，固液比为1g：20mL，室温反应8-10小时；再利用10w/v％KOH水溶液处理样本，固液比为1g：20mL，室温反应10小时；将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏至30mL左右，将其滴入到三倍体积无水乙醇中，在这期间需不断搅拌，后静置过夜，得到半纤维素1，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素1在细胞壁中的分布情况；
上述的KOH的浓度随样本来源的变化而变化，来自针叶木植物、阔叶木植物、禾本科植物的样本所对应的KOH的浓度分别为10w/v％、10w/v％、5w/v％。
上述的免疫荧光标记操作步骤与步骤2中相似，不同之处在于第一抗体孵育液由第一抗体LM21：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：50(v/v)制得；或者由第一抗体LM22：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：50(v/v)制得；
步骤4：利用1w/v％NaOH处理上述样本，固液比为1：20(g/mL)，室温反应10小时，将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏至30mL左右，将其滴入到三倍体积无水乙醇中，在这期间需不断搅拌，后静置过夜，得到半纤维素2，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素2在细胞壁中的分布情况；
上述的免疫荧光标记操作步骤与步骤2中相似，不同之处在于第一抗体孵育液由第一抗体LM10：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：20(v/v)制得；或者由第一抗体LM11：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：20(v/v)制得；
步骤5：利用3w/v％H3BO3水溶液处理步骤(4)处理后的切片样本，固液比为1g：20mL，室温反应8-10小时；再利用18w/v％NaOH水溶液处理样本，固液比为1g：20mL，室温反应10小时；将滤液pH值调至5.5-6.0，减压蒸馏至30mL左右，将其滴入到三倍体积无水乙醇中，在这期间需不断搅拌，后静置过夜，得到半纤维素3，进行核磁分析，同时对此步切片样本进行免疫荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察半纤维素3在细胞壁中的分布情况；
上述的免疫荧光标记操作步骤与步骤2中相似，不同之处在于第一抗体孵育液由第一抗体LM10：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：20(v/v)制得；或者由第一抗体LM11：含1w/v％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液＝1：20(v/v)制得；
线性或低分枝度木聚糖在马尾松细胞壁中分布的激光共聚焦显微镜观察结果如图1所示。
线性半乳糖葡萄糖甘露聚糖在马尾松细胞壁中分布的激光共聚焦显微镜观察结果如图2所示。
结果表明本发明方法通过对每一级分离得到的半纤维素聚糖及相应切片的局部化学分析，不仅可观察半纤维素在植物细胞壁中的分布，而且能有效地区分不同种类的半纤维素在植物细胞壁中的分布情况。本方法对其他类型木质纤维生物质原料的研究具有普适性。
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