具体实施方式

以下，举例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明不受以下的说明限定。

在本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法中，例如，上述碳同素异形体可以为类金刚石碳(DLC)、石墨烯、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、石墨、金刚石、碳纳米角或碳纤维。

在本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法中，例如，可以通过上述表面处理工序将上述碳同素异形体表面氧化，上述碳同素异形体表面经改性的物质可以是碳同素异形体表面被氧化的物质。

在本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法中，例如，在上述表面处理工序中，可以不对反应体系进行光照射。

在本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法中，例如，上述表面处理工序的反应体系可以是气体反应体系或液体反应体系。

在本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法中，例如，上述卤素氧化物自由基可以是二氧化氯自由基。

在本发明的碳同素异形体表面导入有官能团的物质的制造方法中，例如，上述官能团可以为选自羟基(hydroxy)、羧基、醛基(甲酰基)、羰基、醚键和酯键中的至少一种。

在本发明的第一有机物质中，例如，上述碳同素异形体可以为类金刚石碳(DLC)、石墨烯、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、石墨、金刚石或碳纤维。

本发明的有机物质中，例如，上述官能团可以为选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键和酯键中的至少一种。

本发明的冷冻电子显微镜用栅格例如也可以是进一步结合有冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的冷冻电子显微镜用栅格。

本发明的冷冻电子显微镜用栅格能够用于使用了冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的结构分析方法。具体的使用方法没有特别限定，例如可以是与通常的冷冻电子显微镜用栅格相同的使用方法。上述结构分析对象物质也没有特别限定，例如可以是选自蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合体中的至少一种。

在本发明中，根据上述表面处理工序，能够对上述碳同素异形体表面进行改性。在本说明书中，有时将上述表面处理工序称为“改性处理”或“改性方法”。在通过上述表面处理工序将上述碳同素异形体氧化的情况下，上述表面处理工序可以说是上述碳同素异形体的氧化方法。

在本发明中，盐没有特别限制，例如可以是酸加成盐，也可以是碱加成盐。形成上述酸加成盐的酸例如可以是无机酸也可以是有机酸，形成上述碱加成盐的碱例如可以是无机碱也可以是有机碱。上述无机酸没有特别限定，例如可举出硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸等。上述有机酸没有特别限定，例如可举出对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸等。上述无机碱没有特别限定，例如可举出氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土类金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等，更具体而言，例如可举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙等。上述有机碱没有特别限定，例如可举出乙醇胺、三乙胺和三(羟基甲基)氨基甲烷等。

以下，举出例子更具体地对本发明的实施方式进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

[1.碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法]

如上所述，本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法的特征在于，包括使碳同素异形体表面与卤素氧化物自由基进行反应的表面处理工序，通过上述表面处理工序，对上述碳同素异形体表面进行改性。

(1)碳同素异形体

上述碳同素异形体没有特别限定，例如，如上所述，可以为类金刚石碳(以下有时省略为“DLC”)、石墨烯、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、石墨、金刚石或碳纤维。上述碳纳米管没有特别限定，例如可以为单层碳纳米管。在用于后述的冷冻电子显微镜用栅格的情况下，优选石墨烯或DLC，特别优选DLC。

另外，在本发明中，上述碳同素异形体可以包含碳以外的其他元素，也可以不包含碳以外的其他元素。作为上述其他元素，例如可举出氢、氧、氮、硫、硼、硅、磷、各种金属元素等。上述碳同素异形体例如可以仅通过碳原子彼此的键合而形成骨架，在表面键合有上述其它原子。例如，上述碳同素异形体可以在表面存在羟基、甲基、羧基、醛基、羰基、醚键、酯键等基团。在上述碳同素异形体包含上述其他元素的情况下，其含有率没有特别限定，例如以原子数计可以为整体的40％以下、20％以下或5％以下，例如以原子数计可以为整体的0.01％以上、0.1％以上或1％以上。

根据本发明的上述表面处理工序，例如，如后所述，可以将碳同素异形体的表面氧化而导入羟基、羧基等官能团。其机理尚不明确，但推测是由于例如上述碳同素异形体表面的甲基等被氧化而转化为羟基甲基、羧基等。但是，该说明是例示性的推测，本发明不受该说明限定。

(2)卤素氧化物自由基

在本发明中，上述卤素氧化物自由基包含在上述表面处理工序的反应体系中。上述卤素氧化物自由基例如可以通过在上述反应体系中生成而包含在上述反应体系中，也可以使另行生成的上述卤素氧化物自由基包含在上述反应体系中。上述卤素氧化物自由基的产生方法没有特别限制。关于上述卤素氧化物自由基的产生，在后面叙述具体例。

上述卤素氧化物自由基例如可以为任一种，也可以并用两种以上。上述卤素氧化物自由基例如可以根据改性对象的碳同素异形体的种类、反应条件等适当选择。

上述卤素氧化物自由基例如可举出F₂O·(二氟化氧自由基)、F₂O₂·(二氟化二氧自由基)、ClO₂ ^·(二氧化氯自由基)、BrO₂·(二氧化溴自由基)、I₂O₅·(氧化碘(V))等卤素的氧化物自由基等。

(3)反应体系

上述表面处理工序中的上述反应体系是包含上述碳同素异形体和上述卤素氧化物自由基的反应体系。上述反应体系如上所述，例如可以为气体反应体系，也可以为液体反应体系。在上述表面处理工序中，可以对上述反应体系例如进行光照射，也可以不进行光照射。即，即使不对上述碳同素异形体进行光照射，也能够使上述碳同素异形体与上述卤素氧化物自由基进行反应。通过可以不对所述碳同素异形体进行光照射，例如可以得到安全性的提高、成本节约等效果。例如，可以在与上述表面处理工序的反应体系不同的自由基生成用反应体系中通过光照射而产生卤素氧化物自由基，在上述表面处理工序的反应体系中不进行光照射。需要说明的是，上述卤素氧化物自由基的发生方法本身也如上所述，没有特别限定，可以进行光照射，也可以不进行光照射。

(3A)气体反应体系

在上述反应体系为气体反应体系的情况下，例如，在包含上述卤素氧化物自由基的上述气体反应体系中配置上述碳同素异形体，进行光照射。然而，在本发明中，上述表面处理工序不限于此。例如，只要能够使上述碳同素异形体表面与上述卤素氧化物自由基进行反应，则也可以不进行光照射地进行上述表面处理工序。上述气体反应体系例如只要包含上述自由基即可，上述气体反应体系中的气相的种类没有特别限制，为空气、氮、稀有气体、氧等。

本发明例如可以在上述表面处理工序前或与上述表面处理工序同时地对上述气体反应体系导入上述卤素氧化物自由基，也可以在上述气体反应体系中产生上述卤素氧化物自由基。在前者的情况下，例如将包含上述卤素氧化物自由基的气体导入到气相中即可。在后者的情况下，例如，如后所述，可以通过使在液相的自由基生成用反应体系中产生的上述卤素氧化物自由基转移至气相中而进行导入。

作为具体例，在上述卤素氧化物自由基为上述二氧化氯自由基的情况下，例如可以通过在上述气相中导入二氧化氯气体而使上述二氧化氯自由基存在于上述气相中。上述二氧化氯自由基例如可以通过电化学方法而在上述气相中产生。

(3B)液体反应体系

在上述反应体系为液体反应体系的情况下，例如包含有机相。上述液体反应体系例如可以是仅包含上述有机相的单相反应体系，也可以是包含上述有机相和水相的两相反应体系。在仅包含上述有机相的单相反应体系的情况下，例如，如后所述，可以另行准备包含上述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在上述水相中生成上述卤素氧化物自由基后，在上述水相中混合上述有机相，使上述水相的上述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于上述有机相中。

(3B-1)有机相

如上所述，上述有机相中配置有上述碳同素异形体，例如为包含上述卤素氧化物自由基且配置有上述碳同素异形体的有机溶剂的相。

上述有机溶剂没有特别限定。上述有机溶剂例如可以仅使用1种，也可以并用多种。在本发明中，上述有机溶剂例如如上所述，可举出卤代溶剂、氟溶剂等。在上述液体反应体系为上述两相反应体系的情况下，上述有机溶剂例如优选为可以形成上述二相体系的溶剂，即与构成上述水相的后述水性溶剂分离的溶剂、对于上述水性溶剂为难溶性或非溶性的溶剂。

“卤代溶剂”是指例如烃的氢原子的全部或大部分被卤素取代的溶剂。上述卤代溶剂例如可以是烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上被卤素取代的溶剂。上述卤代溶剂没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四溴化碳和后述的氟溶剂等。

“氟溶剂”是上述卤代溶剂的1种，例如是指烃的氢原子的全部或大部分被氟原子取代的溶剂。上述氟溶剂例如可以是烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上被氟原子取代的溶剂。在本发明中，如果使用上述氟溶剂，则例如由于上述溶剂本身的反应性低，所以具有能够进一步抑制或防止副反应的优点。上述副反应例如可举出上述溶剂的氧化反应、基于上述自由基的上述溶剂的夺氢反应或卤化反应(例如氯化反应)、以及来自于原料化合物的自由基与上述溶剂的反应(例如上述碳同素异形体的侧链或末端的烃基为乙基时，乙基自由基与上述溶剂的反应)等。上述氟溶剂不易与水混溶，因此例如适于上述两相反应体系的形成。

上述氟溶剂的例子例如可举出下述化学式(F1)～(F6)所示的溶剂等，其中，例如优选下述化学式(F1)中的n＝4的CF₃(CF₂)₄CF₃等。

【化学式F1-F6】

上述有机溶剂的沸点没有特别限定。上述有机溶剂例如可以根据上述表面处理工序的温度条件适当选择。在上述表面处理工序中，在将反应温度设定为高温的情况下，作为上述有机溶剂，可以选择高沸点溶剂。需要说明的是，本发明例如如后所述，加热不是必须的，例如可以在常温常压下进行。这种情况下，上述有机溶剂例如无需为高沸点溶剂，从操作容易性的观点出发，可以使用沸点不太高的溶剂。

上述有机相例如可以仅包含上述碳同素异形体、上述卤素氧化物自由基和上述有机溶剂，也可以进一步包含其他成分。上述其他成分没有特别限定，例如可举出布郎斯台德酸、路易斯酸和氧(O₂)等。在上述有机相中，上述其他成分例如可以为溶解于上述有机溶剂中的状态，也可以为不溶解于上述有机溶剂中的状态。在后者的情况下，上述其他成分例如可以为分散于上述有机溶剂中的状态，也可以为沉淀的状态。

如上所述，上述有机相包含上述卤素氧化物自由基。上述卤素氧化物自由基例如可以通过在上述有机相以外生成并利用上述有机相进行萃取而包含于上述有机相中。即，在上述反应体系为仅包含有机相的单相反应体系的情况下，例如，除了作为上述反应体系的上述有机相以外，可以另行生成上述卤素氧化物自由基，利用上述有机相来萃取所生成的上述卤素氧化物自由基，将萃取出的包含上述卤素氧化物自由基的上述有机相作为上述反应体系，供于上述表面处理工序。上述卤素氧化物自由基的生成例如如后所述，可以在另行准备的水相中进行。另一方面，在上述液体反应体系为包含上述有机相和上述水相的两相体系反应体系的情况下，例如可以在上述水相中生成上述卤素氧化物自由基，将生成的卤素氧化物自由基在上述有机相中从上述水相中萃取，将上述水相和包含上述卤素氧化物自由基的有机相作为上述两相反应体系，供于上述表面处理工序。

上述碳同素异形体位于上述有机相中。在上述碳同素异形体为上述成形体的情况下，例如从后述的反应处理的效率的方面出发，上述成形体优选例如以要进行表面处理的部分浸渍于上述有机相中、不从上述有机相中露出的方式固定于上述有机相中。

(3B-2)水相

上述水相例如为水性溶剂的相。上述水性溶剂例如为与上述有机相中使用的溶剂分离的溶剂。上述水性溶剂例如可举出H₂O、D₂O等水。

上述水相例如如后所述，可以包含路易斯酸、布郎斯台德酸、自由基产生源等任意的成分。在上述水相中，这些任意的成分例如可以为溶解于上述水性溶剂的状态，也可以为不溶解于上述水性溶剂的状态。在后者的情况下，上述任意的成分例如可以为分散于上述水性溶剂中的状态，也可以为沉淀的状态。

(4)表面处理工序

如上所述，上述表面处理工序是使上述碳同素异形体表面与上述卤素氧化物自由基进行反应的工序。上述表面处理工序例如可以对上述反应的反应体系进行光照射，也可以不进行光照射。以下，主要说明对上述反应体系进行光照射的方法，但本发明不限于此。如上所述，只要能够使上述碳同素异形体表面与上述卤素氧化物自由基进行反应即可，也可以不进行光照射地进行上述表面处理工序。在该情况下，例如，在以下的说明中，省略光照射地进行上述表面处理工序即可。如上所述，通过不对上述碳同素异形体进行光照射，可以得到例如安全性的提高、成本节约等效果。

上述反应体系中配置有上述碳同素异形体，能够对上述碳同素异形体进行改性。具体而言，根据本发明，在上述卤素氧化物自由基存在下，能够容易地对上述碳同素异形体进行改性。根据本发明，例如通过调整上述卤素氧化物自由基的量、光照射的时间的长度等，也能够容易地调整上述碳同素异形体的改性程度(例如氧化等改变的程度)。因此，例如也能够防止因过度的氧化等而导致的上述碳同素异形体的分解，例如也能够避免损害上述碳同素异形体原本所具有的特性。

在上述表面处理工序中，在上述碳同素异形体表面存在甲基的情况下，甲基(-CH₃)被氧化为例如羟基甲基(-CH₂OH)、甲酰基(-CHO)和羧基(-COOH)中的至少任一者。推测其机理如下。即，通过光照射，由上述卤素氧化物自由基(例如，二氧化氯自由基)产生上述卤素的自由基(例如，氯自由基(Cl·))和上述氧的分子。并且，对于上述碳同素异形体表面的甲基(-CH₃)，上述卤素的自由基(例如氯自由基(Cl·))作为夺氢剂发挥作用而成为碳自由基(-CH₂·)，接着，上述氧的分子(例如O₂)作为氧化剂发挥作用而成为羟基甲基(-CH₂OH)。另外，羟基甲基(-CH₂OH)通过进一步的氧化而成为甲酰基(-CHO)或羧基(-COOH)。

在上述表面处理工序中，在上述碳同素异形体表面存在乙基的情况下，乙基(-CH₂CH₃)被氧化为例如羟基乙基(-CH₂CH₂OH)、乙醛基(-CH₂CHO)、羧甲基(-CH₂COOH)。

另外，例如在上述碳同素异形体表面包含亚甲基(-CH₂-)的情况下，例如上述亚甲基被氧化为羟基亚甲基(-CHOH-)、羰基(-CO-)等。

在上述表面处理工序中，光照射的条件没有特别限制。照射光的波长没有特别限定，下限例如为200nm以上，上限例如为800nm以下，光照射时间没有特别限定，下限例如为1秒以上，上限例如为1000小时，反应温度没有特别限定，下限例如为-20℃以上，上限例如为100℃以下、40℃以下，范围例如为0～100℃、0～40℃。反应时的氛围压力没有特别限定，下限例如为0.1MPa以上，上限例如为100MPa以下、10MPa以下、0.5MPa以下，范围例如为0.1～100MPa、0.1～10MPa、0.1～0.5MPa。作为上述表面处理工序的反应条件，例如可例示温度0～100℃或0～40℃、压力0.1～0.5MPa。另外，如上所述，例如，即使省略光照射，也可以进行上述表面处理工序。根据本发明，例如也可以不进行加热、加压、减压等，而在常温(室温)和常压(大气压)下进行上述表面处理工序或包含其在内的全部工序。“室温”没有特别限定，例如为5～35℃。因此，即使上述碳同素异形体包含例如耐热性低的碳同素异形体，也能够应用。另外，根据本发明，例如也可以不进行非活性气体置换等而在大气中进行上述表面处理工序或包含其在内的全部工序。

上述光照射的光源没有特别限定，例如可以利用太阳光等自然光中包含的可见光。如果利用自然光，则例如能够简便地进行激发。另外，作为上述光源，例如，也可以代替上述自然光或者在上述自然光的基础上使用氙灯、卤素灯、荧光灯、汞灯、LED灯等光源。在上述光照射中，例如也可以进一步适当使用将所需波长以外的波长截止的滤波器。

本发明也可以通过针对上述碳同素异形体仅对任意的区域进行光照射，从而仅对上述区域进行改性处理。这样的选择性的光照射的控制方法没有特别限制，例如可以仅对任意的区域进行光照射，也可以仅遮蔽不进行光照射的区域而对整体进行光照射。

在上述反应体系为上述液体反应体系的情况下，在上述表面处理工序中，例如可以至少对上述有机相进行光照射。在仅由上述有机相构成的单相反应体系的情况下，例如可以通过对上述单相反应体系进行光照射来实施上述表面处理工序。在包含上述有机相和上述水相的两相反应体系的情况下，例如可以仅对有机相进行光照射，也可以对上述两相反应体系进行光照射。在上述液体反应体系的情况下，例如可以一边使上述液体反应体系与空气接触，一边对上述液体反应体系进行光照射，在上述两相反应体系的情况下，可以在上述水相中溶解有氧的状态下进行光照射。

根据本发明，在上述表面处理工序中，例如，通过仅在上述卤素氧化物自由基的存在下进行光照射的极其简便的方法产生上述卤素的自由基(例如氯原子自由基Cl·)和氧分子O₂，进行对于上述碳同素异形体的反应(例如氧化反应)，能够对上述碳同素异形体进行改性。而且，例如，即使在常温和常压等极其温和的条件下，也能够简便地使上述碳同素异形体高效地变化而进行改性。

根据本发明，例如可以在不使用有毒重金属催化剂等的情况下得到上述碳同素异形体表面经改性的物质。因此，如上所述，例如能够在极其温和的条件下进行反应，并且能够以对环境的负荷极小的方法高效地进行上述碳同素异形体表面的改性。

作为碳同素异形体的表面的氧化方法，例如有使用高锰酸钾(KMnO₄)等强力的氧化剂的方法。但是，这样的方法不仅限于碳同素异形体的表面的氧化，还可能切断骨架的碳-碳键，分解上述碳同素异形体。与此相对，根据本发明的上述表面处理工序，如上所述，由于在温和的反应条件下进行反应，所以能够抑制或防止碳同素异形体骨架的碳-碳键的断裂。另外，根据本发明的上述表面处理工序，容易控制反应条件。具体而言，例如可以通过停止光照射、停止上述卤素氧化物自由基的供给等来任意地停止上述表面处理工序中的反应。由此，例如能够进一步抑制上述碳同素异形体骨架的碳-碳键的切断，另外，例如容易控制上述碳同素异形体表面的反应的进行。因此，根据本发明，例如能够在不分解碳同素异形体的情况下高效地对上述碳同素异形体表面进行改性。

(5)卤素氧化物自由基生成工序

本发明例如可以进一步包括生成上述卤素氧化物自由基的卤素氧化物自由基生成工序。上述卤素氧化物自由基生成工序例如可以在上述表面处理工序之前或与上述表面处理工序同时进行。上述卤素氧化物自由基的生成方法没有特别限制。

上述卤素氧化物自由基生成工序例如可以使用自由基生成用反应体系来产生上述卤素氧化物自由基。上述表面处理工序中的反应体系例如可以为上述气体反应体系(气相)，也可以为上述液体反应体系(液相)。上述自由基生成用反应体系例如可以在生成上述卤素氧化物自由基后，直接作为上述表面处理工序中的上述液体反应体系使用。

在上述表面处理工序的反应体系为上述气体反应体系的情况下，例如可以与上述表面处理工序的反应体系分开地准备上述自由基生成用反应体系。上述自由基生成用反应体系例如可以为包含上述卤素氧化物自由基的产生源的水相。上述水相例如包含上述卤素氧化物自由基的产生源，在上述卤素氧化物自由基生成工序中，由上述卤素氧化物自由基的产生源生成上述卤素氧化物自由基。上述水相例如为水性溶剂的相，上述水性溶剂与上述同样。在上述水相中产生的上述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含上述有机相和上述水相的两相反应体系，能够将上述卤素氧化物自由基转移至上述有机相。如上所述，在上述气体反应体系中进行上述表面处理工序的情况下，上述卤素氧化物自由基的生成用反应体系例如可以仅为水相，也可以为水相与有机相的两相反应体系。在上述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，由于能够在上述水相中产生自由基而直接转移至上述气相，所以上述自由基生成用反应体系可以仅为上述水相。

上述表面处理工序的反应体系和上述自由基生成用反应体系例如可以为图1所示的反应体系。具体而言，首先，如图1所示，在培养皿3内配置自由基生成用反应体系5。自由基生成用反应体系5例如可以为包含上述卤素氧化物自由基的产生源的水相。上述卤素氧化物自由基的产生源没有特别限定，例如如后所述。另一方面，在另一个培养皿4内配置碳同素异形体6。将这些培养皿3和4容纳在另一个大的培养皿1中，并且将盖2盖在培养皿1上，以防止内部气体泄漏。然后，对培养皿3内的自由基生成用反应体系5进行光照射。通过该光照射，在培养皿3内产生卤素氧化物自由基的气体，该卤素氧化物自由基的气体流入到培养皿4内而与碳同素异形体6发生反应。如此可以进行上述表面处理工序。另外，在图1中，例示了自由基生成用反应体系5中的卤素氧化物自由基的产生源为亚氯酸钠水溶液(NaClO₂aq)和盐酸(HCl)，通过它们的反应而产生的卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基(ClO₂ ^·)的情况。但是，如上所述，在本发明中，卤素氧化物自由基的产生源和卤素氧化物自由基并不限定于这些。

在上述表面处理工序的反应体系为上述液体反应体系、且包含上述水相的情况下，例如上述水相可以为上述自由基生成用反应体系。上述水相例如可以与上述表面处理工序的反应体系为上述气体反应体系时的上述自由基生成用反应体系相同。在上述水相中产生的上述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含上述有机相和上述水相的两相反应体系，可以将上述卤素氧化物自由基转移至上述有机相中。

上述卤素氧化物自由基的产生源(自由基生成源)没有特别限制，例如可以根据上述卤素氧化物自由基的种类适当选择。上述卤素氧化物自由基的产生源例如可以使用1种，也可以并用多种。

上述卤素氧化物自由基的产生源例如为包含氧和卤素的化合物，作为具体例，例如可以举出亚卤酸(HXO₂)或其盐。上述亚卤酸的盐没有特别限定，例如可举出金属盐，上述金属盐例如可举出碱金属盐、碱土类金属盐、稀土类盐等。上述卤素氧化物自由基的产生源例如可以为包含氧、卤素和第IA族元素(例如选自H、Li、Na、K、Rb和Cs中的至少一种)的化合物，例如为上述亚卤酸或其碱金属盐。在上述卤素氧化物自由基为上述二氧化氯自由基的情况下，其产生源没有特别限定，例如为亚氯酸(HClO₂)或其盐，具体而言，例如为亚氯酸钠(NaClO₂)、亚氯酸锂(LiClO₂)、亚氯酸钾(KClO₂)、亚氯酸镁(Mg(ClO₂)₂)、亚氯酸钙(Ca(ClO₂)₂)等。其中，从成本、操作容易性等观点出发，优选亚氯酸钠(NaClO₂)。例如，对于其他卤素氧化物自由基的产生源，也可以采用同样的盐等。作为其他产生源，例如可举出亚溴酸钠等溴酸盐类、亚碘酸钠等亚碘酸盐类等。

在上述水相中，上述产生源的浓度没有特别限定。在上述产生源为上述化合物的情况下，其浓度在换算为上述卤素氧化物离子浓度的情况下，例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下，另外，其浓度在换算为上述卤素氧化物离子的摩尔数的情况下，例如，下限为上述原料的摩尔数的1/100000倍以上，上限为1000倍以下。在上述产生源为亚卤酸或亚卤酸盐(例如亚氯酸或亚氯酸盐)的情况下，其浓度换算为亚卤酸根离子(例如亚氯酸根离子(ClO₂ ^-))浓度的情况下，例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下。另外，上述产生源的浓度在换算为亚卤酸根离子(例如亚氯酸根离子(ClO₂ ^-))的摩尔数的情况下，例如下限为上述原料的摩尔数的1/100000倍以上，上限为1000倍以下。对于其他产生源，也可以援用例如上述浓度。

上述水相例如可以进一步包含路易斯酸和布郎斯台德酸中的至少一者，使其与上述卤素氧化物离子发生作用而生成上述卤素氧化物自由基。上述路易斯酸和布郎斯台德酸中的至少一者例如为包含上述第IA族元素的路易斯酸和布郎斯台德酸中的至少一者。上述卤素氧化物离子例如为亚氯酸根离子(ClO₂ ^-)。上述水相例如可以仅包含上述路易斯酸和上述布郎斯台德酸中的一者，也可以包含两者，1种物质可以兼具上述路易斯酸和上述布郎斯台德酸这两者。上述路易斯酸或上述布郎斯台德酸可以分别仅使用1种，也可以并用多种。在本发明中，“路易斯酸”是指例如对于上述卤素氧化物自由基的产生源而言作为路易斯酸发挥作用的物质。

在上述水相中，上述路易斯酸和上述布郎斯台德酸中的至少一者的浓度没有特别限定，例如可以根据上述改性对象的碳同素异形体的种类等适当设定。上述浓度例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下。

上述布郎斯台德酸没有特别限定，例如可以为无机酸，也可以为有机酸，作为具体例，例如可举出三氟甲磺酸、三氟乙酸、乙酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸、亚磷酸等。上述布郎斯台德酸的酸解离常数pK_a例如为10以下。上述pK_a的下限值没有特别限定，例如为-10以上。

上述水相例如包含上述卤素氧化物离子和上述布郎斯台德酸，例如优选为上述化合物和布郎斯台德酸(例如盐酸)溶解于水性溶剂中而成的水相。作为具体例，在上述卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基的情况下，上述水相例如包含亚氯酸根离子(ClO₂ ^-)和布郎斯台德酸，例如优选上述亚氯酸钠(NaClO₂)和上述布郎斯台德酸(例如盐酸)溶解于水性溶剂中而成的水相。

上述水相中，例如上述路易斯酸、上述布郎斯台德酸、上述自由基产生源等可以为溶解于上述水性溶剂中的状态，也可以为非溶解的状态。后者的情况下，它们例如可以为分散于水性溶剂中的状态，也可以为沉淀的状态。

上述卤素氧化物自由基生成工序没有特别限定，例如通过使上述水性溶剂中含有上述卤素氧化物自由基的产生源，从而可以由上述卤素氧化物离子(例如亚氯酸根离子)自然产生上述卤素氧化物自由基(例如二氧化氯自由基)。上述水相例如优选上述产生源溶解于上述水性溶剂中，另外，优选使其静置。在上述卤素氧化物自由基生成工序中，上述水相例如通过进一步共存上述路易斯酸和上述布郎斯台德酸中的至少一者，从而能够进一步促进上述卤素氧化物自由基的产生。上述卤素氧化物自由基生成工序例如也可以通过对上述水相实施光照射来产生上述卤素氧化物自由基，但即使不进行光照射，例如仅进行静置，也能够产生上述卤素氧化物自由基。

在上述水相中，推测由上述卤素氧化物离子产生上述卤素氧化物自由基的机理例如与后述的图15(液相反应体系中，有机相和水相的两相体系的情况)相同。但是，该说明仅是例示，本发明不限定于此。

在上述反应体系为上述液体反应体系、且为包含上述有机相和上述水相的两相反应体系的情况下，如上述那样产生上述卤素氧化物自由基后，将上述液体反应体系直接供于上述表面处理工序即可。由上述反应体系中的上述水相中的上述产生源产生的上述卤素氧化物自由基难溶于水，因此溶解于上述反应体系中的上述有机相中。例如，对于产生了上述卤素氧化物自由基的上述液体反应体系，也可以进一步进行通过进行光照射而对上述碳同素异形体的表面进行改性的上述表面处理工序。此时，例如通过对上述液体反应体系进行光照射，能够连续地进行上述卤素氧化物自由基生成工序和上述表面处理工序。在本发明中，通过在上述两相反应体系中进行上述卤素氧化物自由基生成工序和上述表面处理工序，例如可以得到更好的反应效率。

另一方面，在上述表面处理工序中的上述反应体系为上述液体反应体系、且为仅包含上述有机相的单相反应体系的情况下，例如可以通过上述方法在上述水相中产生上述卤素氧化物自由基，使产生的上述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于上述有机相后，除去上述水相，将包含上述卤素氧化物自由基的上述有机相作为上述单相反应体系，供于上述表面处理工序。

在图15中示意性地示出使用了上述两相反应体系的上述卤素氧化物自由基生成工序和上述表面处理工序的一个例子。在图15中，作为上述卤素氧化物自由基，示出上述二氧化氯自由基作为具体例，但本发明不受这些例子任何限制。如图15所示，就上述反应体系而言，在反应容器中，水层(上述水相)和有机层(上述有机相)这两层分离，彼此仅在界面接触。上层为水层(上述水相)12，下层为有机层(上述有机相)11。图15是截面图，但为了容易观察，省略了水层12和有机层11的阴影线。如图15所示，水层(水相)12中的亚氯酸根离子(ClO₂ ^-)与酸反应，产生二氧化氯自由基(ClO₂ ^·)。二氧化氯自由基(ClO₂ ^·)难溶于水，因此溶解于有机层11中。接下来，对包含二氧化氯自由基(ClO₂ ^·)的有机层11进行光照射，赋予光能，由此有机层11中的二氧化氯自由基(ClO₂ ^·)分解，产生氯自由基(Cl·)和氧分子(O₂)。由此，有机层(有机相)11中的碳同素异形体被氧化，表面被改性。但是，图15是例示，本发明不限定于此。

在图15中，水层12为上层，有机层11为下层，但例如在有机层11的密度(比重)较低的情况下，有机层11成为上层。例如，可以以在上层的有机层中配置上述碳同素异形体的方式在上述反应容器中进行固定化。此时，固定上述碳同素异形体的固定部例如可以设置在上述反应容器中，也可以设置在上述反应容器的外部。后者的情况下，例如可举出从外部悬挂上述碳同素异形体并浸渍于上述有机层中的方式等。

在图15中例示了上述两相反应体系，但在本发明的制造方法中，上述表面处理工序也可以在仅有机相的单相反应体系中进行。此时，例如，另行准备包含上述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在上述水相中生成上述卤素氧化物自由基后，在上述水相中混合上述有机相，使上述水相的上述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于上述有机相中。然后，将上述水相与上述有机相分离，回收上述有机相，配置上述碳同素异形体，将其作为单相反应体系，单独地在上述卤素氧化物自由基的存在下进行基于上述光照射的上述表面处理工序。另外，在上述表面处理工序中的反应体系为气体反应体系的情况下，如上所述，可以在上述水相中生成上述卤素氧化物自由基后，在上述气体反应体系中进行上述表面处理工序。

[2.碳同素异形体表面导入有官能团的物质的制造方法]

如上所述，本发明的碳同素异形体表面导入有官能团的物质的制造方法的特征在于，包括：通过本发明的碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法来制造上述碳同素异形体表面经改性的物质的工序以及向上述经改性的表面导入官能团的官能团导入工序。

通过导入上述官能团，能够对上述碳同素异形体赋予各种功能。具体而言，例如，如后述的实施例所示，通过上述官能团，容易利用冷冻电子显微镜捕捉结构分析对象物质(例如蛋白质)。此外，例如通过适当选择上述官能团的种类，能够赋予与该官能团的种类相应的任意的功能。

上述官能团导入工序例如可以向被氧化(改性)而导入了羟基、羧基、醛基(甲酰基)等取代基的碳同素异形体表面，通过上述羟基、羧基、醛基等取代基与其他物质的反应(例如缩合反应)，而导入官能团。由此，例如能够导入通过与导入至上述碳同素异形体表面的上述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。

作为上述官能团导入工序，例如可举出后述的实施例3的方案E3的例子。具体而言，例如，如方案E3的左侧的反应式所示，可以将导入至碳同素异形体表面的羧基的氢用琥珀酰亚胺基取代。而且，如上述反应式所示，可以进一步通过与1H,1H-十一氟己胺的缩合反应而生成酰胺键。另外，例如，如方案E3右侧的反应式所示，可以将导入至碳同素异形体表面的羟基的氢用2,3-环氧丙基取代。此外，如上述反应基团所示，可以在上述环氧基与1H,1H-十一氟己胺之间进行加成反应。需要说明的是，在实施例3中，使用纳米金刚石作为碳同素异形体，但并不限定于纳米金刚石，也可以是其他任意的碳同素异形体。另外，1H,1H-十一氟己胺并不限定于此，也可以是其他任意的胺。上述胺没有特别限定，例如可以为伯胺，也可以为仲胺。

另外，通过上述官能团导入工序能够导入的官能团没有特别限定，例如，如上所述，可以导入通过与导入到上述碳同素异形体表面的上述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。例如可以使作为具体的官能团的琥珀酰亚胺基、异硫氰基、磺酰氯基、羧酰氯基、环氧乙烷基、烷基氯基、羧酸酐基、马来酰亚胺基、酰肼等官能团与上述碳同素异形体表面的羟基、羧基、醛基等取代基反应而导入至上述碳同素异形体表面。如此导入的官能团能够与例如氨基、巯基(也称为-SH、巯基、硫醇基)、醛基等基团反应，因此可以结合具有这些基团的化合物(例如蛋白质等)而捕获。

上述官能团导入工序中的反应条件也没有特别限定，可以任意设定。上述反应条件例如可以与现有的同样或类似的反应的反应条件相同或以其为基准。例如，在通过与羟基或羧基的反应而导入官能团的情况下，可以使用与羟基或羧基中的现有反应的反应条件相同或以其为基准的反应条件。

[3.有机物质]

如上所述，本发明的第一有机物质是具有如下结构的有机物质：在碳同素异形体表面导入有选自羟基、羧基和醛基中的至少一个取代基，进一步将上述取代基转化为其他官能团。另外，如上所述，本发明的第二有机物质是在类金刚石碳(DLC)表面导入有官能团的有机物质。

这些本发明的有机物质的制造方法没有特别限定，例如可以通过上述的本发明的碳同素异形体表面导入有官能团的物质的制造方法来制造。如上所述，该制造方法包括上述表面处理工序和上述官能团导入工序。

另外，例如通过对上述碳同素异形体省略上述表面处理工序而进行上述官能团导入工序，也能够制造本发明的有机物质。更具体而言，例如，如果未进行上述表面处理工序的上述碳同素异形体表面具有羟基、羧基等取代基，则通过对这些取代基进行上述官能团导入工序，能够制造本发明的有机物质。

[4.冷冻电子显微镜用栅格等]

本发明的有机物质的用途没有特别限定，例如，如上所述，可以用于本发明的冷冻电子显微镜用栅格。

对于本发明的冷冻电子显微镜用栅格，例如通过使冷冻电子显微镜的结构分析对象物质与上述官能团结合，能够抑制或防止上述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。上述官能团与上述结构分析对象物质的键合没有特别限定，例如可举出共价键、离子键、金属配位键、主客体相互作用、氢键等，从键合的强度的观点出发，特别优选共价键。

以往的冷冻电子显微镜用碳栅格由于上述栅格与结构分析对象物质的结合力弱，所以如上所述，在上述碳栅格上发生上述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化)、取向性的偏差等，有可能对结构分析带来障碍。与此相对，如上所述，本发明的冷冻电子显微镜用栅格能够使结构分析对象物质强力地结合。由此，能够抑制或防止上述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。

使上述结构分析对象物质与上述官能团结合的方法没有特别限定。例如，可以根据上述官能团与上述结构分析对象物质的组合，适当设定与公知的类似反应的反应条件相同或以其为基准的反应条件。例如，可以使具有上述官能团的本发明的冷冻电子显微镜用栅格在上述结构分析对象物质的溶液(例如水溶液)中浸渍适当的时间，但并不限定于该方法。

上述结构分析对象物质也没有特别限定，例如，可以与通常的冷冻电子显微镜的结构分析对象物质相同，也可以不同。作为上述结构分析对象物质，例如可举出蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合体等。作为上述蛋白质，例如可举出以物性分类时的膜蛋白质、水溶性蛋白质、糖蛋白质、以功能分类时的酶蛋白质、结构蛋白质、转录因子、转运蛋白质、储存蛋白质、收缩蛋白质、防御蛋白质等，例如除了作为分析的标准蛋白质使用的脱铁铁蛋白以外，还可举出核糖体、蛋白酶体、RNA聚合酶、衣壳、GPCR、光化学系复合体、ATP合成酶、与抗体的复合体等。另外，由它们构成的微管蛋白等也可以成为本发明中的上述结构分析对象物质。此外，作为本发明中的上述结构分析对象物质，还可举出肌肉、胶原蛋白、鞭毛这样的组织本身。另外，例如，也可以使用抗体等作为标记蛋白质，将生命体本身、组织表面等作为本发明中的上述结构分析对象物质。

根据本发明的冷冻电子显微镜用栅格，如上所述，能够抑制或防止上述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。另外，根据本发明的冷冻电子显微镜用栅格，对于在以往的冷冻电子显微镜用栅格中难以进行结构分析的物质也能够进行结构分析。例如，由于膜蛋白质等难以结晶化，所以利用以往的冷冻电子显微镜用栅格难以进行三维结构分析。与此相对，本发明的冷冻电子显微镜用栅格能够强力地结合上述膜蛋白质等结构分析对象物质而使结构稳定化，因此能够进行结构分析，例如也能够进行三维结构分析。另外，根据本发明的冷冻电子显微镜用栅格，例如也能够进行蛋白质的单粒子分析等。

本发明的冷冻电子显微镜用栅格的使用方法没有特别限定，例如可以与通常的冷冻电子显微镜用栅格的使用方法相同。例如，与通常的冷冻电子显微镜用栅格同样地，通过使用冰包埋法对所捕捉的结构分析对象物质进行显微镜观察，能够进行结构分析。

另外，本发明的有机物质的用途不限定于冷冻电子显微镜用栅格，可以用于任意广泛的用途，例如，除了生物反应器、酶传感器、微反应器等用途以外，还可以用于将抗体、各种蛋白质与珠等连接时的检测试剂、亲和柱色谱等。

【实施例】

以下，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。

[实施例1]

如下所述，通过本发明的上述表面处理工序对碳同素异形体表面进行改性，制造碳同素异形体表面经改性的物质。

在本实施例中，使用气相中的反应进行上述表面处理工序。

首先，如图1所示，在直径5cm的培养皿3中加入去离子水20mL，进一步使亚氯酸钠NaClO₂(300mg)和36质量％HCl水溶液(100μL)溶解，制成盐酸酸性NaClO₂水溶液(自由基生成用反应体系)5。另一方面，在直径3cm的培养皿4中放入10mg的碳同素异形体6。将这些培养皿3和4收纳在直径11cm的培养皿1中。此外，在培养皿1上盖上盖2以使内部的气体不泄漏。然后，在室温下，对培养皿3内的盐酸酸性NaClO₂水溶液5，从培养皿1的上方以光量10mW/cm²照射波长365nm的LED光3分钟、10分钟、30分钟或60分钟。通过该光照射，在培养皿3内盐酸与NaClO₂反应而产生ClO₂自由基的气体，该ClO₂自由基的气体流入到培养皿4内而与碳同素异形体6反应。通过该表面处理工序而将碳同素异形体6的表面氧化。将氧化后的碳同素异形体6在减压下干燥24h，得到目标物(碳同素异形体6的表面经改性的物质)。

在本实施例中，作为碳同素异形体6，分别使用粉末状的石墨烯(富士胶片和光纯药株式会社：商品名“06-0313”)、碳纳米管(株式会社Meijo Nano Carbon：商品名“MEIJOeDIPS”)、富勒烯C₆₀(东京化成工业株式会社：商品名“B1641”)、纳米金刚石(株式会社Daicel)和类金刚石碳(通过以石墨烯为原料的物理蒸镀(Physical Vapor Deposition，PVD)法制备)，制造各个碳同素异形体6的表面经改性的物质。需要说明的是，上述碳纳米管为单层碳纳米管(SWNT)。

对于上述各碳同素异形体6，在表面处理工序(氧化反应)之前和之后分别进行X射线光电子能谱法(XPS)测定，检测C1s(碳原子的1s轨道)的能量峰位置，由此确认氧化反应的进行。在图2～图6的图表中示出各自的XPS测定结果。在各图中，横轴为结合能(eV)，纵轴为峰强度的相对值(cps)。

图2表示石墨烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后没有大的变化，但在反应60分钟后，观察到C=C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，因此确认到石墨烯表面的氧化。另外，将上述基于XPS的元素分析结果示于下述表1。如表1所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到石墨烯表面的氧化。

【表1】

石墨烯的元素比率

另外，推测本实施例中的氧化后的石墨烯表面的结构例如如下述化学式E1所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。

【化学式E1】

图3表示碳纳米管的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，因此确认到碳纳米管表面的氧化。另外，将上述基于XPS的元素分析结果示于下述表2。如表2所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到碳纳米管表面的氧化。

【表2】

碳纳米管的元素比率

另外，推测本实施例中的氧化后的碳纳米管表面的结构例如如下述化学式E2所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。

【化学式E2】

图4表示富勒烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后，观察到C=C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，因此确认到富勒烯表面的氧化。另外，将上述基于XPS的元素分析结果示于下述表3。如表3所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到富勒烯表面的氧化。

【表3】

富勒烯的元素比率

此外，将氧化反应后的富勒烯的MALDI/TOFMAS的测定结果示于图7的图表。该图中，横轴为质量(m/z)，纵轴为峰强度(相对值)。如图所示，除了富勒烯C₆₀原本的峰(m/z＝720)以外，还观察到多个m/z以16或17为单位增加的峰。由此也能够推断富勒烯表面的氧化。

此外，确认到氧化反应后的富勒烯稍微溶解于水而显色为淡褐色。由此可以推断富勒烯表面被氧化而亲水性稍微变高。

另外，推测本实施例中的氧化后的富勒烯表面的结构例如为如下述化学式E3所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。

【化学式E3】

图5表示纳米金刚石的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后，观察到C-C键峰的衰减、C-OH键峰和C=O-C键峰的增大，因此确认到纳米金刚石表面的氧化。另外，将上述基于XPS的元素分析结果示于下述表4。如表4所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到纳米金刚石表面的氧化。

【表4】

纳米金刚石的元素比率

另外，推测本实施例中的氧化后的纳米金刚石表面的结构例如如下述化学式E4所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。

【化学式E4】

图6表示类金刚石碳的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应3分钟后没有大的变化，但在反应10分钟后，观察到C-C键峰的衰减、C-OH键峰和C=O-C键峰的增大，因此确认到类金刚石碳表面的氧化。此外，根据上述基于XPS的元素分析，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到类金刚石碳表面的氧化。另外，推测本实施例中的氧化后的类金刚石碳表面的结构例如与纳米金刚石的氧化后相同。但是，该结构是推测的结构的一个例子。另外，将上述基于XPS的元素分析结果示于下述表5。如表5所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到类金刚石碳表面的氧化。

【表5】

DLC的元素比率

另外，在下述表6中示出本实施例中的石墨烯(GP)、碳纳米管(SWNT)，富勒烯(C₆₀)和纳米金刚石(ND)的氧化反应前后的含氧率的变化。如表6所示，仅由sp²键构成的碳同素异形体(GP、SWNT和C₆₀)的曲率半径越大，反应后含氧率越大幅上升，因此暗示反应性高。另外，在各氧化反应中，根据上述XPS测定结果可以推断，对于sp²导入了OH基，对于sp³碳导入了OH基和COOH基。

【表6】

含氧率的变化

[实施例2]

对于实施例1的石墨烯和纳米金刚石，利用以下的方法使若丹明B结合，进而测定荧光强度。

首先，在试管内加入6mg的若丹明B。接下来，向其中加入去离子水2ml，进一步加入0.1M乙酸水溶液，使pH为6.5。将这些溶液准备4个，分别向各个中加入氧化反应前的石墨烯、氧化反应60分钟后的石墨烯、氧化反应前的纳米金刚石和氧化反应30分钟后的纳米金刚石，在室温下进行15分钟搅拌。各反应后使用去离子水3mL清洗2次，减压干燥24h。然后，分别使用UV-vis光谱仪，以555nm作为激发光，在560～660nm的范围内测定荧光强度。

在图8中示出石墨烯的荧光强度测定结果，在图9中示出纳米金刚石的荧光强度测定结果。在图8和图9中，横轴为波长(nm)，纵轴为峰强度(相对值)。如图所示，石墨烯和纳米金刚石均在氧化反应后575nm附近的峰强度增大，因此确认到结合有若丹明B。需要说明的是，由此可以推断，在氧化反应后，在石墨烯和纳米金刚石的表面导入了羟基或羧基或者这两者。

[实施例3]

对于实施例1的纳米金刚石，通过以下的方法分别导入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基和2,3-环氧丙基，此外，进一步将它们用氟烷基氨基取代。

[使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺的官能团导入]

将实施例1中的氧化反应前和氧化反应后的纳米金刚石分别放入到单独的试管中。接下来，加入100mM的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride，有时省略为EDC)水溶液(2mL)，在室温下搅拌60分钟。然后，加入80mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimide)，进一步在室温下搅拌60分钟，使其反应。由此，得到在纳米金刚石中导入了NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基的有机物质。进而，加入1H,1H-十一氟己胺(1H,1H-Undecafluorohexylamine)40μL，搅拌60分钟使其反应，得到上述NHS基被氟烷基氨基取代的有机物质。将得到的有机物质使用去离子水清洗2次，在减压下干燥24h。

[使用表氯醇的官能团导入]

将实施例1中的氧化反应前和氧化反应后的纳米金刚石分别放入到单独的试管中。接下来，加入100mM的表氯醇(Epichlorohydrin)水溶液(2mL)，在室温下搅拌60分钟使其反应。由此，得到在纳米金刚石中导入了2,3-环氧丙基的有机物质。此外，加入1H,1H-十一氟己胺(1H,1H-Undecafluorohexylamine)40μL，搅拌60分钟使其反应，得到在纳米金刚石中导入了氟烷基氨基的有机物质。将所得到的有机物质使用去离子水清洗2次，在减压下干燥24h。

需要说明的是，本实施例中的官能团导入反应推测如下述方案E3所示。左侧的反应式表示使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的反应。如下所述，认为纳米金刚石表面的羧基的氢被琥珀酰亚胺基取代，进而通过与1H,1H-十一氟己胺的缩合反应而生成酰胺键。另外，右侧的反应式表示使用了表氯醇的反应。如下所述，认为纳米金刚石表面的羟基的氢被2,3-环氧丙基取代，进而在环氧基与1H,1H-十一氟己胺之间发生加成反应。

【化学式SE3】

此外，对本实施例中的氟烷基氨基导入后的纳米金刚石进行XPS测定。下述表7表示使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺导入氟烷基氨基时的XPS测定结果。下述表8表示使用表氯醇导入氟烷基氨基时的XPS测定结果。如下述表7所示，氧化反应前和氧化反应后的任一纳米金刚石均在与1H,1H-十一氟己胺的反应后导入了氟原子，因此暗示了在表面存在羧基。但是，氧化反应后的纳米金刚石导入了更多的氟原子，因此暗示了与氧化反应前相比羧基增加。同样地，根据下述表8可知，氧化反应前和氧化反应后的任一纳米金刚石均在与1H,1H-十一氟己胺的反应后导入了氟原子，因此暗示了在表面存在羟基(hydroxy group)。但是，氧化反应后的纳米金刚石导入了更多的氟原子，因此暗示了与氧化反应前相比羟基增加。

【表7】

使用了N-羟基硫代琥珀酰亚胺的氟烷基氨基导入

【表8】

使用了表氯醇的氟烷基氨基导入

[实施例4]

如下所述，通过表面处理工序(氧化反应)对冷冻电子显微镜用栅格的类金刚石碳(DLC)膜进行改性，进一步与N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)或表氯醇反应而导入官能团，制造冷冻电子显微镜用栅格。此外，使用该冷冻电子显微镜用栅格捕捉蛋白质。

[担载DLC栅格的制造]

在云母板上，按照常规方法，通过PVD法蒸镀厚度10nm左右的类金刚石碳(DLC)薄膜。然后，使上述DLC薄膜漂浮于在底部排列有QUANTIFOIL(Quantifoil Micro Tools GmbH公司的商品名，冷冻电子显微镜用栅格)的水槽的水面，轻轻地除去水，由此制造QUANTIFOIL被DLC被覆的冷冻电子显微镜用栅格(以下，有时称为“DLC担载栅格”)。将该DLC担载栅格干燥24小时，用于后续工序。

[气相中的DLC担载栅格的氧化]

作为图1的碳同素异形体6，使用上述DLC担载栅格代替实施例1的碳同素异形体，并且将光照射时间设为1分钟、3分钟或10分钟，除此以外，与图1(实施例1)同样地操作，进行上述表面处理工序(氧化反应)后在减压下干燥24h，制造上述DLC担载栅格的DLC薄膜表面被氧化(被改性)的冷冻电子显微镜用栅格。

[使用了脱铁铁蛋白的负染色实验和电子显微镜观察]

在上述表面处理工序(氧化反应)之前或之后的上述DLC担载栅格中，作为偶联反应用的水溶液(偶联水溶液)，加入1质量％表氯醇水溶液(2μL)，或者加入1质量％EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride)水溶液和1质量％N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)水溶液，然后，在室温下静置5分钟。然后，使用滤纸除去上述偶联水溶液。由此得到用表氯醇或Sulfo-NHS进行了处理的DLC担载栅格。进一步，在该DLC担载栅格中添加1质量％脱铁铁蛋白水溶液(20mM磷酸氢二钠(Disodium phosphate)、150mM的NaCl，pH7.0)，静置10分钟。进一步用2质量％钼酸二铵(Ammoniummolybdate)水溶液清洗后，使用滤纸除去上述水溶液。然后，使用冷冻电子显微镜(株式会社日立制作所，商品名“H-7650”，80kV，mag：80000)进行基于冰包埋法的测定，观察由上述DLC担载栅格捕捉到的脱铁铁蛋白。

在图10～图14中示出利用上述冷冻电子显微镜拍摄到的负染色TEM图像(照片)。

图10是将未氧化(氧化反应前)的上述DLC担载栅格用Sulfo-NHS处理，再用脱铁铁蛋白处理后的物质的负染色TEM图像。如图所示，由于未确认到脱铁铁蛋白的图像，所以在该DLC担载栅格中，基于冷冻电子显微镜的观察无法捕捉到充分的脱铁铁蛋白。认为这是因为，DLC表面未氧化且未被改性，因此即使利用Sulfo-NHS进行处理，也无法导入官能团。

图11是将进行了10分钟上述表面处理工序(氧化反应)后的上述DLC担载栅格用Sulfo-NHS处理，再用脱铁铁蛋白处理后的物质的负染色TEM图像。如图所示，在该DLC担载栅格中，能够确认到脱铁铁蛋白的图像。认为这是因为，DLC表面通过上述表面处理工序中的氧化反应而被改性，从而通过Sulfo-NHS处理而导入官能团，该官能团与脱铁铁蛋白结合。另外，也未观察到脱铁铁蛋白的不均匀分布和取向性的偏差。即，根据该DLC担载栅格，能够抑制作为结构分析对象物质的脱铁铁蛋白(蛋白质)的不均匀分布、取向性的偏差等。

图12是将未氧化(氧化反应前)的上述DLC担载栅格直接用脱铁铁蛋白进行处理，而不用表氯醇或Sulfo-NHS处理的物质的负染色TEM图像。如图所示，由于未确认到脱铁铁蛋白的图像，所以在该DLC担载栅格中，利用冷冻电子显微镜的观察无法捕捉到充分的脱铁铁蛋白。

图13是将未氧化(氧化反应前)的上述DLC担载栅格用表氯醇处理，再用脱铁铁蛋白处理后的物质的负染色TEM图像。如图所示，在该DLC担载栅格中，虽然很少，但可以确认到脱铁铁蛋白的图像。推测这是因为，即使DLC表面未氧化而未被改性，也具有少量的羟基，通过表氯醇处理而导入了官能团。另外，也未观察到脱铁铁蛋白的不均匀分布和取向性的偏差。即，根据该DLC担载栅格，能够抑制作为结构分析对象物质的脱铁铁蛋白(蛋白质)的不均匀分布、取向性的偏差等。

图14是将进行了10分钟上述表面处理工序(氧化反应)后的上述DLC担载栅格用表氯醇处理，再用脱铁铁蛋白处理后的物质的负染色TEM图像。如图所示，在该DLC担载栅格中，能够确认到在整个画面中均等分散(没有不均匀分布)的脱铁铁蛋白的图像。另外，也未观察到脱铁铁蛋白的取向性的偏差。即，根据该DLC担载栅格，能够抑制作为结构分析对象物质的脱铁铁蛋白(蛋白质)的不均匀分布、取向性的偏差等。

[实施例5]

制造石墨烯栅格，进行使该石墨烯栅格与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，对表面进行改性(氧化)，制造表面经改性(氧化)的石墨烯栅格。此外，进行向上述表面经改性(氧化)的石墨烯栅格表面导入官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的石墨烯栅格。此外，使作为冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的蛋白质与导入有上述官能团的石墨烯栅格接合(结合)。

[石墨烯栅格的制造]

使由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-石墨烯-Cu这三层构成的片材以Cu面与0.5mol/L的过硫酸铵水溶液的水面接触的方式漂浮，静置30分钟，由此使Cu层溶解。将这样除去Cu层而得到的PMMA-石墨烯片在超纯水中每次漂浮10分钟，共计2次进行清洗。然后，在充满超纯水的膜张紧器(应研商事公司制，商品名collodion膜张紧器)的底部排列TEM用的Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制，商品名QUANTIFOIL)和Au栅格(Quantifoil MicroTools GmbH公司制，商品名QUANTIFOIL)。此外，使上述PMMA-石墨烯片漂浮于该膜张紧器的水面，轻轻地将水排出，由此在上述栅格上贴附上述PMMA-石墨烯片。将该栅格在室温下干燥1小时后，在130℃下进行20分钟加热处理。然后，将上述栅格依次浸渍于60℃的丙酮中60分钟、室温(约25℃)的氯仿中30分钟、乙酸中3小时、异丙醇中10分钟各个共计2次，除去PMMA。最后，在100℃下进行10分钟加热处理，制造Mo栅格或Au栅格表面被石墨烯被覆的石墨烯栅格。

[石墨烯栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)]

将由上述Mo栅格或Au栅格制造的上述石墨烯栅格各自在130℃下进行15分钟加热处理。利用与实施例1和图1中说明的方法相同的方法，对该加热处理后的石墨烯栅格进行利用二氧化氯自由基(ClO₂自由基)的表面处理工序(表面的氧化)。然而，在本实施例中，以LED光(UV光)不直接照射上述石墨烯栅格的方式用铝箔覆盖上述石墨烯栅格而进行上述表面处理工序(表面的氧化)。反应时间(光照射时间)设为10分钟，反应温度与实施例1同样地设为室温。对于表面处理工序前后的上述石墨烯栅格，分别与实施例1同样地进行XPS测定。由此，在上述表面处理工序后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，此外，O原子数的比率增加，因此确认了石墨烯表面的氧化。

[官能团导入工序]

根据下述方案1，向上述表面处理工序后的石墨烯栅格表面导入官能团(官能团导入工序)。

【化学式S1】

具体而言，上述官能团导入工序如下进行。首先，使上述表面处理工序后的石墨烯栅格浸渍于2mmol/L聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸、Poly(ethylene glycol)2-aminoethylether acetic acid(平均分子量2100)DMSO溶液中，在室温下静置过夜。由此，如上述方案1所示，使上述石墨烯栅格表面的环氧化物与上述聚乙二醇2-氨基乙基醚乙酸反应而导入官能团。

此外，使作为冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的蛋白质与进行了上述官能团导入工序的石墨烯栅格接合(结合)。具体而言，将上述石墨烯栅格在包含5mmol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和5mmol/L的EDC的水溶液中浸渍15分钟之后，在包含0.2mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的水溶液中浸渍60分钟，如上述方案1所示，通过与β-半乳糖苷酶(B-gal)中存在的氨基进行反应而结合。

[实施例6]

制造无定形碳栅格，进行使该无定形碳栅格与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，对表面进行改性(氧化)，制造表面经改性(氧化)的无定形碳栅格。此外，进行向上述表面经改性(氧化)的无定形碳栅格表面导入官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的无定形碳栅格。此外，使作为冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的蛋白质与导入有上述官能团的无定形碳栅格接合(结合)。

[无定形碳栅格的制造]

在充满超纯水的膜张紧器(应研商事公司制，商品名collodion膜张紧器)的底部排列TEM用的Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制，商品名QUANTIFOIL)和Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制，商品名QUANTIFOIL)。通过将在云母板上生长的碳膜轻轻地放入水中，仅使碳膜在水面上剥离，轻轻地除去水，从而在栅格上贴附无定形碳膜。将该栅格在室温下干燥过夜，制造Mo栅格或Au栅格表面被无定形碳被覆的无定形碳栅格。

[无定形碳栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)]

使用由上述Mo栅格或Au栅格制造的上述无定形碳栅格来代替实施例5的上述石墨烯栅格，并且将反应时间(光照射时间)设为5分钟，除此以外，通过与实施例5相同的方法，进行利用二氧化氯自由基(ClO₂自由基)的表面处理工序(表面的氧化)。对于表面处理工序前后的上述无定形碳栅格，分别与实施例1同样地进行XPS测定。由此，在上述表面处理工序后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，此外，O原子数的比率增加，因此确认到无定形碳表面的氧化。

[官能团导入工序]

根据下述方案2，向上述表面处理工序后的无定形碳栅格表面导入官能团(官能团导入工序)。

【化学式S2】

具体而言，上述官能团导入工序如下进行。首先，将上述表面处理工序后的无定形碳栅格在200℃下进行10分钟加热处理后，浸渍于包含10mmol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和10mmol/L的EDC的水溶液中，在室温下静置10分钟。然后，浸渍于包含10mmol/L的NH₂-PEG8-丙酸的水溶液中，在室温下静置60分钟。由此，如上述方案2所示，使上述无定形碳栅格表面的羧基与上述NH₂-PEG-丙酸反应而导入官能团。

此外，使作为冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的蛋白质与结合有上述β-半乳糖苷酶(B-gal)的无定形碳栅格接合(结合)。具体而言，将上述无定形碳栅格浸渍于包含10mmol/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和10mmol/L的EDC的水溶液中10分钟之后，在包含0.2mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的水溶液中浸渍60分钟，如上述方案2所示，通过与β-半乳糖苷酶(B-gal)中存在的氨基进行反应而结合。

以上，参照实施方式说明了本发明，但本发明并不限定于上述实施方式。可以在本发明的范围内对本发明的构成和细节进行本领域技术人员可以理解的各种修改。

产业上的可利用性

如上所述，根据本发明，能够提供在利用冷冻电子显微镜进行的结构分析中，能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等的、碳同素异形体表面经改性的物质的制造方法、碳同素异形体表面导入有官能团的物质的制造方法、冷冻电子显微镜用栅格的制造方法、有机物质、冷冻电子显微镜用栅格。另外，本发明的用途并不限定于冷冻电子显微镜用，能够用于任意广泛的用途，其产业上利用价值极大。

本申请基于2019年3月27日提出申请的日本申请特愿2019-061938主张优先权，将其公开的全部内容援引于此。

符号说明

1：培养皿

2：盖

3：培养皿

4：培养皿

5：自由基生成用反应体系

6：碳同素异形体

11：有机层(有机相)

12：水层(水相)。