具体实施方式

本发明人经过广泛而又深入的研究，意外的开发了一种病毒密度梯度离心纯化装置。所述的病毒密度梯度离心纯化装置在用于蔗糖密度梯度纯化病毒过程中，能够简单方便及时将连续流密度梯度离心转子中气泡去除，尤其能够将蔗糖密度梯度中气泡去除，从而避免气泡引起转子的震动和转子内部蔗糖密度梯度的分布，从而能够制备高质量的病毒疫苗。本发明还提供一种狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法，所述的方法基于连续流蔗糖密度梯度离心对生产狂犬病病毒的物料进行高效纯化的工艺方法，所述的方法对狂犬病病毒有很高的回收率，能够高效去除狂犬病病毒过程中可能引入的杂质，包括来自鸡胚成纤维细胞的各种不同的杂质(包括蛋白杂质、核酸杂质等)，从而使得纯化的狂犬病病毒能够符合疫苗卫生标准。此外，本发明所述的狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法能够用本发明所述的病毒密度梯度离心纯化装置进行，制备高质量疫苗，本发明的病毒密度梯度离心纯化装置结构简单、操作方便，适合工业化生产。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“上”、“下”、“顶部”和“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限定。

如本文所用，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”和“第六”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”和“第六”等特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

如本文所用，术语“连接”与“相接”可互换使用，应该作广义理解，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接。

如本文所用，术语“连续流密度梯度离心机”是一种一端连续进液另一端连续出液的密度梯度离心机。连续流密度梯度离心机的主要工作部件为连续流密度梯度离心转子，连续流密度梯度离心机为超高速离心设备，在高速运转的过程中，转子内部不能有气泡，有气泡会引起连续流密度梯度离心转子的震动，影响转子内部密度梯度(如蔗糖密度梯度)的分布，从而影响最终的纯化效果，因此在进样于连续流密度梯度离心机前，需要排除转子内气泡。

如本文所用，术语“连续流密度梯度离心转子”与“转子”可互换使用，“连续流密度梯度离心转子的顶部”与“连续流密度梯度离心转子的上端”可互换使用，“连续流密度梯度离心转子的底部”与“连续流密度梯度离心转子的下端”可互换使用。

如本文所用，术语“密度梯度离心(density gradient centrifugation)”用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

术语“wt％”为重量百分比，如无特别说明，本发明所用浓度均为重量百分数。

本发明中，所用病毒是经灭活处理的，其可用本领域通常的灭活试剂。例如甲醛、戊二醛或β-丙酸内酯等。

狂犬病病毒

本发明中，狂犬病病毒可以来自于任何来源，只要它在对狂犬病病毒敏感的细胞中繁殖。一般使用狂犬病病毒株，它们已从原代分离株而建立，已知的狂犬病病毒毒株包括但不限于：AVO1、CVS、ERA、Kelev、HEP-FLURY、Nishigahara RCEH、Ontario fox、Ontarioskunk、Pasteur/PV、Pittman Moore(PM)、Street Alabama Dufferin(SAD)B19、SAD-Bern、ERA、SAG、SAG2、Vnukovo-32、Eth2003、毒株RC-HL、Nishigahara、SHBRV-18、SRV9、Ni-CE、Flury-LEP以及Kissling狂犬病病毒毒株。对于疫苗生产特别重要的毒株是PV、Pitman-Moore、CVS、Flury LEP、Flury HEP、Kelev和ERA。两种特别有用的毒株是VEROLAB中使用的Pitman-Moore毒株(或Wistar狂犬病PM/WI38-1503-3M毒株)和RABIPUR中使用的Flury LEP毒株。这些非常有毒力的病毒株用于生产抗狂犬病灭活疫苗。还可以使用减毒狂犬病病毒株，其目的在于生产抗狂犬病活疫苗。例如是SAD Bern株或SAD B19株或由它们衍生的株，例如由于在狂犬病病毒的糖蛋白G上点突变的存在而衍生自SAD Bern株的SAG1和SAG2株(EP350398、EP583998)。EP1253197也描述了一些更稳定的其它减毒狂犬病病毒株，它们在该狂犬病病毒的磷蛋白质P和糖蛋白G上有一个或多个点突变。

病毒密度梯度离心纯化装置

为了便于说明，以下参考附图1进一步描述本发明所述的病毒密度梯度离心纯化装置，应当理解的是，附图并不限定本发明的范围。

本发明提供一种病毒密度梯度离心纯化装置，所述的装置包括环形管路和连续流密度梯度离心机，所述的连续流密度梯度离心机包括连续流密度梯度离心转子1；

在所述的环形管路上依次设有第一管口2、第三管口3、第二管口4和第四管口5，所述的第一管口与第三管口之间的管路上设有第一阀门6，所述的第三管口与第二管口之间的管路上设有第二阀门7，所述的第二管口与第四管口之间的管路上设有第三阀门8，所述的第四管口与第一管口之间的管路上设有第四阀门9；

所述的第一管口通过第一管道10与所述的连续流密度梯度离心转子的上端相连，所述的第二管口通过第二管道11与所述的连续流密度梯度离心转子的下端相连，所述的第三管口通过第三管道12与第一瓶体13相连，所述的第四管口通过第四管道14与第二瓶体15相连；

所述的第一管道上设有第五阀门16，所述的第二管道上设有第六阀门17；

所述的第三管道上设有液体输送装置18。

具体地，所述的病毒密度梯度离心纯化装置如本发明第一方面所述。

狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法

本发明还提供一种狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一连续流密度梯度离心转子，所述连续流密度梯度离心转子被配置为围绕所述连续流密度梯度离心转子的中心轴旋转离心，并且所述连续流密度梯度离心转子设有用于容纳物料的内腔，所述内腔的体积为V0，在底部设有物料入口，顶部设有物料出口；

(2)通过所述物料入口，在所述连续流密度梯度离心转子的内腔中注入缓冲溶液，然后注入体积V1的55-65％(wt％)蔗糖溶液；

(3)对所述连续流密度梯度离心转子以T1进行离心，从而在所述连续流密度梯度离心转子的内腔形成蔗糖梯度溶液；其中，T1为3000-7000rpm；

(4)以T2离心条件下，以流速F1，将含狂犬病病毒的物料从所述物料入口注入内腔，其中，F1为90-240ml/min；其中，T2为30000-40000rpm；

(5)当含狂犬病病毒的物料注入操作结束后，在T2离心条件下，缓冲溶液从以流速F2从所述物料入口注入内腔，从而使得狂犬病病毒富集于所述蔗糖梯度溶液中，形成富含狂犬病病毒的梯度离心层；

其中，F2为90-240ml/min；

(6)对所述连续流密度梯度离心转子的离心速度进行降速，从而使得转速为0rpm；

(7)从所述连续流密度梯度离心转子的底部物料入口，收集所述富含狂犬病病毒的梯度离心层，从而获得纯化的狂犬病病毒。

具体地，本发明所述的狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法如上本发明第二方面所述。

在一个优选例中，所述狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法用本发明所述的病毒密度梯度离心纯化装置进行。

纯化的狂犬病病毒以及疫苗组合物

本发明还提供了用本发明方法制备的高纯度的狂犬病病毒以及含有所述狂犬病病毒的疫苗组合物。

经测定，本发明制备的狂犬病病毒的纯度高，杂蛋白去除率远大于90％，故杂蛋白的残留量远小于10％，更佳地≤5％。

本发明制备的狂犬病病毒(灭活)可作为免疫原，用于激发动物产生针对狂犬病病毒的免疫反应，从而保护动物(人)免狂犬病病毒的感染。

一种优选的组合物是预防性的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价的疫苗组合物。

这些疫苗包含本发明制备的高纯度狂犬病病毒，并通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。

增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。

本发明的疫苗组合物(包括狂犬病病毒，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的狂犬病病毒，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据动物(如人)的生理状况、免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度及其它的相关因素而定。

在本发明中，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。

常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。

本发明的主要优点包括：

1、本发明首次意外开发了一种病毒密度梯度离心纯化装置，所述的装置在用于蔗糖密度梯度纯化病毒过程中，能够简单方便及时将连续流密度梯度离心转子中的气泡去除，尤其能够将蔗糖密度梯度中气泡去除，从而避免气泡引起转子的震动和转子内部蔗糖密度梯度的分布，从而能够制备高质量的病毒疫苗。

2、本发明的病毒密度梯度离心纯化装置结构简单、操作方便，适合工业化生产。

3.密度梯度离心对于病毒的剪切力小，易收集完整的病毒颗粒。

4、本发明所述的狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法具有高的抗原回收率和卵清蛋白、宿主蛋白、胰酶、牛血清、抗生素以及总蛋白含量的蛋白去除率。

5、本发明所述狂犬病病毒密度梯度离心纯化方法用本发明所述的病毒密度梯度离心纯化装置进行，制备高质量疫苗，可以密度梯度离心前，不经浓缩步骤直接纯化或者经过较小倍数的浓缩，相比于传统的分子筛本发明具有更强的可操作性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

制备狂犬病病毒收获液

材料：SPF鸡胚(11日龄)

步骤：a)取胚和胚处理(去头去内脏，剪成小组织块)；b)鸡胚组织块消化；c)鸡胚成纤维细胞分散和收集；d)细胞计数和按细胞数量进行狂犬病病毒感染；e)33-35℃培养1天；f)更换培养液，33-35℃培养4天；g)收集收获液，加入新鲜维持液继续培养2天；h)进行第二次收获。

实施例2

本实施例提供一种病毒密度梯度离心纯化装置，其结构示意图如图1所示，所述的病毒密度梯度离心纯化装置包括环形管路和连续流密度梯度离心机，所述的环形管路为菱形管路，所述的连续流密度梯度离心机包括连续流密度梯度离心转子1；

在所述的环形管路上依次设有第一管口2、第三管口3、第二管口4和第四管口5，所述的第一管口与第三管口之间的管路上设有第一阀门6，所述的第三管口与第二管口之间的管路上设有第二阀门7，所述的第二管口与第四管口之间的管路上设有第三阀门8，所述的第四管口与第一管口之间的管路上设有第四阀门9；

所述的第一管口通过第一管道10与所述的连续流密度梯度离心转子的上端相通，所述的第二管口通过第二管道11与所述的连续流密度梯度离心转子的下端相通，所述的第三管口通过第三管道12与第一瓶体13相连，所述的第一瓶体为样品瓶，所述的第四管口通过第四管道14与第二瓶体15相连，所述的第二瓶体为接受瓶；

所述的第一管道上设有第五阀门16，所述的第二管道上设有第六阀门17；

所述的第三管道上设有液体输送装置18，所述液体输送装置为双向输送蠕动泵；

所述的连续流密度梯度离心机为厂家阿尔法威仕曼型号为eKII超速离心机，其中连续流密度梯度离心转子的型号为K3，所述连续流密度梯度离心转子设有用于容纳液体物料的内腔，所述内腔的体积为3.2L。

实施例3

使用实施例2的病毒密度梯度离心纯化装置对病毒进行纯化，具体步骤如下：

1、提供病毒收获液

按照实施例1的方法制备狂犬病病毒收获液279kg，日立连续流离心机离心狂犬病病毒收获液，收集上清液，超滤浓缩10倍得到28kg病毒收获液。

2、制备蔗糖密度梯度

2.1、在连续流密度梯度离心转子1处于0rpm时，将PBS缓冲溶液(pH7.4，浓度为0.01mM)加入到第一瓶体13中，关闭第一阀门6和第三阀门8，开启输送装置18(蠕动泵)，PBS依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路、第二管道11、连续流密度梯度离心转子1、第一管道10、第一管口2和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15，使PBS充满连续流密度梯度离心转子1和整个管路系统。由于在向第一瓶体13中加入PBS溶液前，第三管道12与外界空气相通过，因此，通过输送装置18(蠕动泵)输送的PBS时，第三管道12能够将空气(气泡)带入，从而使得整个管路系统和连续流密度梯度离心转子1的上端和下端均含有气泡。

2.2、打开第一阀门6和第三阀门8，关闭第五阀门16和第六阀门17，开启输送装置18(蠕动泵)，第一瓶体13中的PBS溶液经第三管道12后，分别经第三管口3、第二管口4至第四管口5之间的管路和第三管口3、第一管口2至第四管口5之间的管路，从第四管道14流出至第二瓶体15。由于第三管道12的管道口已经位于第一瓶体13PBS中，因此，在该步骤2.2中，通过输送装置18(蠕动泵)输送的PBS中不含气泡，因此，该步骤2.2能够将第三管道12、环形管路和第四管道14中的气泡除去。

2.3、打开第五阀门16和第六阀门17，关闭第一阀门6和第三阀门8，开启输送装置18(蠕动泵)，PBS依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路、第二管道11、连续流密度梯度离心转子1、第一管道10、第一管口2和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。在PBS流动过程中，PBS从连续流密度梯度离心转子1的下端流入，从连续流密度梯度离心转子1上端流出，因此，不含气泡的PBS缓冲液能够将连续流密度梯度离心转子1上端的气泡排出。

2.4、打开第一阀门6和第三阀门8，关闭第二阀门7和第四阀门9，开启输送装置18(蠕动泵)，PBS依次经第三管道12、第三管口3和第一管口2之间的管路、第一管道10、连续流密度梯度离心转子1、第二管道11、第二管口4和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。在PBS流动过程中，PBS从连续流密度梯度离心转子1的上端流入，从连续流密度梯度离心转子1下端流出，因此，不含气泡的PBS能够将连续流密度梯度离心转子1下端的气泡排出。

步骤2.1-2.4使得连续流密度梯度离心转子1和整个管路系统不含有气泡。

2.5、打开第二阀门7和第四阀门9，将第一瓶体13中的PBS溶液替换成60％(wt％)蔗糖溶液，关闭第五阀门16和第六阀门17，开启输送装置18(蠕动泵)，第一瓶体13中的蔗糖溶液依次经第三管道12后，分别经第三管口3、第二管口4至第四管口5之间的管路和第三管口3、第一管口2至第四管口5之间的管路，从第四管道14流出至第二瓶体15。由于在将第一瓶体13中的PBS溶液替换成蔗糖溶液过程中，第三管道12与外界空气相通过，因此，在通过输送装置18(蠕动泵)输送的蔗糖溶液开始时，第三管道12能够将空气(气泡)带入，然而，在该步骤2.5中，蔗糖溶液只经第三管道12、环形管路和第四管道14流出至第二瓶体15，因此，在蔗糖溶液不断流动过程中，输送装置18(蠕动泵)输送的蔗糖溶液不在含有气泡，因此，随着蔗糖溶液不断流动，第三管道12、环形管路和第四管道14中的蔗糖溶液不在含有气泡。

2.6、打开第五阀门16和第六阀门17，关闭第一阀门6和第三阀门8，开启输送装置18(蠕动泵)，无气泡的60％(wt％蔗糖溶液依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路、第二管道11，进入到连续流密度梯度离心转子1中，从而使无气泡的蔗糖溶液进入到连续流密度梯度离心转子1中并与转子1中的PBS缓冲液接触，60％(wt％)蔗糖溶液进入到连续流密度梯度离心转子的流速为100ml/min，进入量为1600ml(为连续流密度梯度离心转子的空腔体积的1/2)。其中，在蔗糖溶液进入到连续流密度梯度离心转子1过程中，转子1中的PBS溶液经第一管道10、第一管口2和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。

2.7打开第一阀门6和第三阀门8关闭第六阀门17，连续流密度梯度离心转子1以5000rpm的速度进行转动离心，使得连续流密度梯度离心转子1中的PBS和蔗糖溶液形成纵向的密度梯度，越靠近连续流密度梯度离心转子1的外壁，蔗糖的浓度越高。在连续流密度梯度离心转子1离心转动过程中，溶解在PBS和蔗糖溶液中气体会在连续流密度梯度离心转子1转动过程中产生，且产生的气泡出现在连续流密度梯度离心转子1的上端和下端。

2.8、保持连续流密度梯度离心转子1以5000rpm转动离心，将第一瓶体13中的60％(wt％)蔗糖溶液替换成PBS缓冲溶液(pH7.4，浓度为0.01mM)，关闭第五阀门16和第六阀门17，开启输送装置18(蠕动泵)，第一瓶体13中的PBS溶液依次经第三管道12后，分别经第三管口3、第二管口4至第四管口5之间的管路和第三管口3、第一管口2至第四管口5之间的管路，从第四管道14流出至第二瓶体15。由于在将第一瓶体13中蔗糖溶液替换成PBS溶液过程中，第三管道12与外界空气相通过，因此，在通过输送装置18(蠕动泵输送的PBS缓冲液开始时，第三管道12能够将空气(气泡)带入，然而，在该步骤2.8中，PBS溶液只经第三管道12、环形管路和第四管道14流出至第二瓶体15，因此，在PBS溶液不断流动过程中，输送装置18(蠕动泵)输送的PBS溶液不在含有气泡，因此，随着PBS溶液不断流动，第三管道12、环形管路和第四管道14中的PBS溶液不在含有气泡。

2.9依次除去连续流密度梯度离心转子1的下端和上端的气泡

2.9.1除去连续流密度梯度离心转子1的下端的气泡，具体步骤如下：

保持连续流密度梯度离心转子1在5000rpm转动离心过程中，打开第五阀门16和第六阀门17，关闭第二阀门7和第四阀门9，开启输送装置18(蠕动泵，PBS依次经第三管道12、第三管口3和第一管口2之间的管路、第一管道10、连续流密度梯度离心转子1、第二管道11、第二管口4和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。在PBS流动过程中，PBS以250ml/min流速从连续流密度梯度离心转子1的上端流入，将转子1中的液体从上向下推动，从密度梯度离心转子1下端流出，从而将密度梯度离心转子1下端的气泡推出除去。

2.9.2除去连续流密度梯度离心转子1的上端的气泡，具体步骤如下：

保持连续流密度梯度离心转子1在5000rpm转动离心过程中，打开第二阀门7和第四阀门9，关闭第一阀门6和第三阀门8，开启输送装置18(蠕动泵)，PBS以250ml/min流速依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路、第二管道11、连续流密度梯度离心转子1、第一管道10、第一管口2和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。在PBS流动过程中，PBS以250ml/min流速从连续流密度梯度离心转子1的下端流入，将转子1中的液体从下向上推动，从密度梯度离心转子1上端流出，从而将密度梯度离心转子1上端的气泡推出除去；

因此，步骤2.9能够及时将连续流密度梯度离心转子1旋转过程中产生气泡及时排除，从而有避免气泡会引起连续流密度梯度离心转子的震动，影响转子内部密度梯度(如蔗糖密度梯度的分布，进而影响最终的纯化效果的不利后果。

3、进样：

3.1将连续流密度梯度离心转子1的离心速度在30min内缓慢均匀的从5000rpm上升至35000rpm，同时在转子1的转速升高过程中，PBS按照步骤2.9.2以150ml/min流速进液于连续流密度梯度离心转子1。保持连续流密度梯度离心转子1以35000rpm转动离心，将第一瓶体13中PBS溶液替换成病毒收获液，打开第一阀门6和第三阀门8，关闭第五阀门16和第六阀门17，开启输送装置18(蠕动泵)，第一瓶体13中的病毒收获液依次经第三管道12后，分别经第三管口3、第二管口4至第四管口5之间的管路和第三管口3、第一管口2至第四管口5之间的管路，从第四管道14，流出至第二瓶体15。由于在将第一瓶体13中PBS溶液替换成病毒收获液过程中，第三管道12与外界空气相通过，因此，在通过输送装置18(蠕动泵)输送的病毒收获液开始时，第三管道12能够将空气(气泡)带入，然而，在该步骤3.1中，病毒收获液只经第三管道12、环形管路和第四管道14流出至第二瓶体15，因此，在病毒收获液不断流动过程中，输送装置18(蠕动泵)输送的病毒收获液不在含有气泡，因此，随着病毒收获液不断流动，第三管道12、环形管路和第四管道14中的病毒收获液不在含有气泡。

3.2保持连续流密度梯度离心转子1在35000rpm转动离心，打开第五阀门16和第六阀门17，关闭第一阀门6和第三阀门8，开启输送装置18(蠕动泵)，病毒收获液依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路和第二管道11，从连续流密度梯度离心转子1的下端进入到连续流密度梯度离心转子1中，病毒收获液的进样速度为150ml/min，此时，第一瓶体13中仍有剩余过量的病毒收获液。

3.3保持连续流密度梯度离心转子1在35000rpm转动离心，打开第一阀门6和第三阀门8，关闭第五阀门16和第六阀门17，将第一瓶体13中的病毒收获液替换成PBS缓冲液(pH7.4，浓度为0.01mM)，开启输送装置18(蠕动泵)，第一瓶体13中的PBS缓冲液依次经第三管道12后，分别经第三管口3、第二管口4至第四管口5之间的管路和第三管口3、第一管口2至第四管口5之间的管路，从第四管道14，流出至第二瓶体15。由于在将第一瓶体13中病毒收获液替换成PBS缓冲液过程中，第三管道12与外界空气相通过，因此，在通过输送装置18(蠕动泵)输送的PBS缓冲液开始时，第三管道12能够将空气(气泡)带入，然而，在该步骤3.3中，PBS缓冲液只经第三管道12、环形管路和第四管道14流出至第二瓶体15，因此，在PBS缓冲液不断流动过程中，输送装置18(蠕动泵)输送的PBS缓冲液不在含有气泡，因此，随着PBS缓冲液不断流动，第三管道12、环形管路和第四管道14中的PBS缓冲液不在含有气泡。

3.4打开第五阀门16和第六阀门17，关闭第一阀门6和第三阀门8，保持连续流密度梯度离心转子1在35000rpm转动离心，同时，在连续流密度梯度离心转子1离心过程中，开启输送装置18(蠕动泵)，PBS缓冲液依次经第三管道12、第三管口3和第二管口4之间的管路和第二管道11，从连续流密度梯度离心转子1的下端进入到连续流密度梯度离心转子1中，PBS缓冲液的进液速度为150ml/min，从PBS缓冲液进液开始计，连续流密度梯度离心转子1在35000rpm转动离心60min后，病毒收获液在连续流密度梯度离心转子1中因分子量的不同分布在不同的纵向蔗糖梯度层中，更小分子量的物质，经第一管道10、第一管口2和第四管口5之间的管路、和第四管道14，流出至第二瓶体15。

4、收样：

关闭第六阀门17，将连续流密度梯度离心转子以35000rpm/50min的速度降速至0转，连续流密度梯度离心转子1中的纵向的密度梯度，会在重力的作用下，形成横向的密度梯度。放置空的第一瓶体13，打开第六阀门17，开启输送装置18(蠕动泵)进行反向输送，空气会经第四管道14、第四管口5和第一管口2之间的管路和第一管道10进入连续流密度梯度离心转子1，因此，连续流密度梯度离心转子1中的梯度样品会依次经第二管道11、第二管口4和第三管口3之间的管路、第三管道12流入到第一瓶体13，通过不断更换新的第一瓶体13(每个第一瓶体以50ml/瓶进行收集)，从而得到连续流密度梯度离心转子1中的不同梯度样品，通过SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测蛋白，如图2所示，SDS-PAGE分离的蛋白，进行western blot测试，结果如图3所示。

从图2和图3中可以看出：狂犬病病毒的主要抗原(G)蛋白分布集中且条带较清楚，纯化效果好。

在步骤3.2中，在病毒收获液开始进样于连续流密度梯度离心转子和进样结束时，从第四管道(14)口收集连续流密度梯度离心转子上端出口的流出液(即流穿液)并进行流穿液中抗原(狂犬病病毒)的含量。测试结果如下表1。

表1流穿液中抗原(狂犬病病毒)的含量(n＝3)

从表1中可以看出，在病毒收获液开始进样于连续流密度梯度离心转子和进样结束时，连续流密度梯度离心转子上端出口不会有抗原(狂犬病病毒)流出。

实施例4狂犬病病毒收获液以200ml/min流速进样纯化

本实施例与实施例3的步骤相似，区别点在于，步骤3.2中，第一瓶体中的狂犬病病毒收获液以200ml/min流速进入到连续流密度梯度离心转子(1)中，其SDS-PAGE和westernblot测试结果分别如如图4和图5所示。

从图4和图5中可以看出：狂犬病病毒的主要抗原(G)蛋白分布集中且条带较清楚。纯化效果好，与150ml/min的上样速度差异较小。

实施例5富含狂犬病病毒的梯度离心层(即病毒梯度液)的检测

在本实施例中，按照实施例3所述的方法，平行进行3批样品的病毒纯化，对步骤4中收集的收集液通过紫外吸光值检测来确定富含狂犬病病毒的梯度离心层，从而考察批间和批内的均一性和重复性。

(A)平行3批样品(即按照实施例3的步骤1分别平行制备3批病毒收获液)中富含狂犬病病毒的梯度离心层(即病毒梯度液)的检测，将3批样品的图谱进行图谱叠加如图6所示，曲线之间表现出高度的重合性。

(B)取同样一批样品平均分成3份(即按照实施例3的步骤1制备1批病毒收获液，平行分成3份)，将3份样品的图谱进行图谱叠加如图7所示，曲线之间表现出高度的重合性。

从图6和图7中可以看出，使用实施例3的方法对病毒进行纯化能够保证批间和批内具有优异的均一性和重复性。

实施例6对不同浓缩倍数的狂犬病病毒收获液的进行分离

1、提供不同浓缩倍数的病毒收获液

按照实施例1的方法制备狂犬病病毒收获液，日立连续流离心机澄清离心狂犬病病毒收获液，收集154L上清液。取其中14L作为样品1；另取出140L上清液超滤浓缩10倍至14L，作为样品2。

2、按照与实施例3所述的方法，分别对样品1和样品2进行纯化。

检测SDS-PAGE和western blot结果图8所示。

从图8可以看出，病毒收获液10倍浓缩纯化后RABV富集十分明显，上样时间相对于未浓缩时节省了90％。因此，可使用不经浓缩的收获液或者较小浓缩倍数的收获液。但出于节省时间方面的考虑，可以在密度梯度离心前对狂犬病病毒收获液进行浓缩。

实施例7纯化效果测试

抗原回收率＝纯化后总抗原/纯化前总抗原*100％；

卵清蛋白去除率＝1-纯化后总卵清蛋白含量/纯化前总卵清蛋白含量*100％；

宿主蛋白去除率＝1-纯化后总宿主蛋白含量/纯化前总宿主蛋白含量*100％；

牛血清白蛋白去除率＝1-纯化后总牛血清白蛋白含量/纯化前总牛血清蛋白含量*100％；

总蛋白去除率＝1-纯化后总蛋白含量/纯化前总蛋白含量*100％；抗生素去除率＝1-纯化后总抗生素含量/纯化前总抗生素含量*100％；

以与实施例3所述方法，对不同的浓缩倍数(即：密度梯度离心前后样品体积的比值)进行测试，测试结果如下表2和表3。

表2

表3

结果表明：密度梯度离心后样品的浓缩倍数高，样品的抗原回收率高达约80％，卵清蛋白、宿主蛋白、抗生素、胰酶和牛血清的去除率均高达99％以上，总蛋白去除率也高达98％以上。

对比例

对比例1

1、提供病毒收获液

按照实施例1的方法制备狂犬病病毒收获液，日立连续流离心机澄清离心狂犬病病毒收获液，收集上清液，超滤浓缩10倍得到浓缩样品A、B、C、D、E、F、H、I和J，超滤浓缩60倍得到浓缩样品G。

对样品A、B和C进行分子筛(琼脂糖凝胶排阻)纯化，样品D、E和F按照实施例3的方法进行连续流蔗糖密度梯度离心纯化。分别在纯化前和纯化后进行取样检测并计算杂质去除率结果如下表4。

表4杂质去除率结果

从表4中可以看出，两种方式卵清蛋白的去除率和抗生素去除率均高达99.9％，而胰酶去除率密度梯度离心的纯化方法要优于分子筛层析。

分子筛纯化浓缩60倍而连续流密度梯度离心只需浓缩10倍，从浓缩的损失率来说，浓缩60倍的抗原损失率高于10倍浓缩。结果如下表5。

表5抗原回收率结果

抗原回收率会随着浓缩倍数的提高而降低。分子筛层析技术要求病毒液浓缩60倍才具有纯化可操作性，蔗糖密度梯度离心只需要10倍甚至不浓缩也可以进行纯化。相比于分子筛纯化，蔗糖密度梯度离心具有更强的可操作性。

对比例2

以与实施例3相同的方法，区别点在于，步骤3.2中，第一瓶体中的狂犬病病毒收获液以250ml/min流速进入到连续流密度梯度离心转子(1)中，其SDS-PAGE和western blot测试结果分别如图9和图10所示。

从图9和图10中可以看出，上样速度达到250ml/min时，泳道中的非狂犬病病毒结构蛋白的条带明显减少，病毒的纯度显著高于其它较低的上样速度纯化的样品，这是由于该上样速度条件下，连完整的病毒颗粒都来不及进入蔗糖梯度层。可以预见，随着上样速度继续增加，越来越多的病毒颗粒随着样品流出液损失，粒径大于狂犬病病毒粒子的颗粒性物质进入蔗糖层，纯化效果会显著下降。

对比例3

以与实施例3相同的方法，步骤3.2中，第一瓶体中的狂犬病病毒收获液以50ml/min流速进入到连续流密度梯度离心转子(1)，其SDS-PAGE和western blot测试结果如图11和图12所示。

从图11和图12中可以看出，以50ml/min流速进样，样品流过转子离心腔的时间较长，主要抗原(G蛋白)收获量最大，但杂蛋白去除不彻底(尤其是34-36管)，

对比例4

本实施例与实施例3的步骤相似，区别点在于，将60％(wt％)蔗糖溶液换成30％+60％(wt％)蔗糖溶液，具体地，先连续流密度梯度离心转子中加入0.6L 30％(wt％)蔗糖溶液，再加入1L 60％(wt％)蔗糖溶液，通过SDS-PAGE和WB方法检测纯化效果。

两种不同的蔗糖溶液在纯化完成后形成的连续蔗糖密度如图13所示，其中，实施例3中的3批60％(wt％)蔗糖溶液方案形成的蔗糖密度重复性实验如图14所示；30％+60％(wt％)蔗糖浓度方案中的密度梯度离心纯化后样品SDS-PAGE和western blot检测如图15和图16所示

从图13中可以看出，与60％(wt％)蔗糖溶液相比，30％+60％(wt％)蔗糖溶液形成的蔗糖浓度梯度的距离跨度较小。60％(wt％)蔗糖浓度宽度要宽，收集范围较小，较小的收集范围，易使产品富集，较大的收集范围，分离效果较好。

从图14中可以看出，60％(wt％)蔗糖溶液形成蔗糖梯度具有优良的稳定性和复现性。

从表15-16中可以看出，与60％(wt％)蔗糖溶液相比，30％+60％(wt％)蔗糖溶液方案中，纯化后不同分子量的蛋白峰之间的距离相对较近，病毒主峰后宿主蛋白的含量明显多于60％(wt％)蔗糖溶液的方案。western blot结果显示，60％(wt％)蔗糖溶液方案的G蛋白的条带更浓，量更多，表明60％(wt％)蔗糖溶液方案形成的蔗糖梯度更利于狂犬病病毒粒子的富集。

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