野生竹荪组织分离制备母种方法
阅读说明：本技术 野生竹荪组织分离制备母种方法 (Method for preparing mother seeds by tissue separation of wild dictyophora indusiata ) 是由 刘鹏 郑治洪 曹永直 彭成江 邵先强 文玉朝 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了野生竹荪组织分离制备母种方法,涉及农业科技技术领域。本发明的野生竹荪组织分离制备母种方法,所述方法是以自然野外生长的竹荪菌蕾或开伞竹荪为原材料,经过组织分离得到菌柄包被,最后培养并纯化后得到母种。本发明公开了野生竹荪组织分离制备母种方法,能够有效的利用采集的竹荪野生资源,解决菌蕾成熟或已开伞的竹荪难以有效分离的难题,为竹荪的优质种源收集和良种选育奠定了技术基础。(The invention discloses a method for preparing mother seeds by tissue separation of wild dictyophora indusiata, and relates to the technical field of agricultural science and technology. The method for preparing the mother seeds by tissue separation of wild dictyophora indusiata comprises the steps of taking natural wild dictyophora indusiata buds or dictyophora indusiata as raw materials, obtaining stipe coatings through tissue separation, and finally obtaining the mother seeds after culture and purification. The invention discloses a method for preparing mother seeds by tissue separation of wild dictyophora indusiata, which can effectively utilize collected wild dictyophora indusiata resources, solve the problem that the dictyophora indusiata with mature fungus buds or opened mushrooms is difficult to effectively separate, and lay a technical foundation for high-quality provenance collection and fine seed breeding of the dictyophora indusiata.)
技术领域
本发明涉及农业科技技术领域，尤其涉及野生竹荪组织分离制备母种方法。
背景技术
竹荪(Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers)Fisch)又名竹笙、竹参，常见并可供食用的有4种：长裙竹荪、短裙竹荪、棘托竹荪和红托竹荪，是寄生在枯竹根部的一种隐花菌类，形状略似网状干白蛇皮，它有深绿色的菌帽，雪白色的圆柱状的菌柄，粉红色的蛋形菌托，在菌柄顶端有一围细致洁白的网状裙从菌盖向下铺开，被人们称为“雪裙仙子”、“山珍之花”、“真菌之花”、“菌中皇后”。竹荪营养丰富，香味浓郁，滋味鲜美，自古就列为“草八珍”之一。
竹荪幼担子果菌蕾呈圆球形，具三层包被，外包被薄，光滑，灰白色或淡褐红色；中层胶质；内包被坚韧肉质。成熟时包被裂开，菌柄将菌盖顶出，柄中空，高15～20cm，白色，外表由海绵状小孔组成；包被遣留于柄下部形成菌托；菌盖生于柄顶端呈钟形，盖表凹凸不平呈网格，凹部分密布担孢子；盖下有白色网状菌幕，下垂如裙，长达8厘米以上；孢子光滑，透明，椭圆形，3～3.5×1.5～2微米。
目前竹荪菌种的获取方法主要是采集未成熟的菌蛋用琼脂培养基进行组织分离，但是成功率不是很高，且在培养的过程中，还会出现膨大等不良现象。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于公开野生竹荪组织分离制备母种方法，能够有效的利用采集的竹荪野生资源，解决菌蕾成熟或已开伞的竹荪难以有效分离的难题，为竹荪的优质种源收集和良种选育奠定了技术基础。
具体的，本发明的野生竹荪组织分离制备母种方法，所述方法是以自然野外生长的竹荪菌蕾或开伞竹荪为原材料，经过组织分离得到菌柄包被，最后培养并纯化后得到母种。
进一步，对于未开伞的竹荪菌蕾，所述组织分离得到菌柄包被的具体操作为：在无菌超净台上，用75％酒精浸泡表面消毒后，用无菌吸水纸吸干表面水分，再用灼烧烫的解剖刀纵向切开菌蕾，用无菌镊子夹掉菌柄，使菌柄包被露出，夹取菌柄包被大小为5mm见方的组织转入母种培养基中进行培养。
进一步，对于开伞竹荪，所述组织分离得到菌柄包被的具体操作为：先齐菌托处切掉菌柄，将子实体倒立用75％酒精冲洗干净，再用无菌水冲洗，最后用无菌纸擦拭，用无菌镊子分开菌托，去掉菌柄，再用无菌镊子夹取菌柄包被大小为5mm见方的组织转入母种培养基中培养。
进一步，所述方法具体包括以下步骤：
S1：采集自然野外生长的竹荪菌蕾和开伞竹荪，获得分离原材料；
S2：通过无菌处理，获得无菌分离材料菌柄包被，将菌柄包被转入母种培养基中进行培养；
S3：培养至菌丝萌发转移至木屑培养基中获得木屑培养基母种；
S4：通过菌丝尖端提纯复壮得到纯化母种，转接原种、栽培种，最后通过仿野生种植进行栽培得到子实体；
S5：通过子实体组织分离进行系统选育，经过3-5年的系统培育，人工驯化，得到性状稳定、可用于繁殖生产的竹荪母种。
进一步，每升所述母种培养基包括以下原料：青杠木屑40g，箭竹叶10g，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂粉10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g。
进一步，所述木屑培养基包括以下重量份原料：青杠木屑78重量份，麦麸20重量份，磷酸二氢钾1重量份，硫酸镁0.5重量份，石膏0.5重量份。
进一步，所述S3步骤中，当菌丝萌发至1-2cm转移至木屑培养基中。
进一步，所述母种培养基的原料还包括营养缓释颗粒，所述营养缓释颗粒是以营养缓释胶囊为内核，内核外包裹了复合膜层，所述内核和复合膜层之间填充有香樟木提取液。
进一步，所述营养缓释胶囊是以营养液为囊芯，海藻酸钠/胶原蛋白复合材料为囊皮。
进一步，所述营养缓释颗粒的制备方法具体包括以下步骤：
A1：将海藻酸钠溶于水中得到海藻酸钠溶液，向海藻酸钠溶液中加入胶原蛋白溶液，调节pH至6-7，加入乙醇，搅拌混匀后，加热回流30min，冷却至室温，加入营养液，搅拌混匀后，采用高压静电喷雾法，喷雾至不断搅拌的氯化钙溶液中，将微胶囊捞出用去离子水清洗干净得到营养缓释胶囊；
A2：称取甲基纤维素搅拌溶解于去离子水中，得到甲基纤维素溶液，搅拌混匀后加入壳聚糖溶液，搅拌混匀，在10000r/min条件下进行均质10min，均质过程中滴加加入香樟木提取液，再加入营养缓释微胶囊，超声分散后，加入交联剂，于25℃温度下，搅拌反应15min，反应完成后过滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥得到营养缓释颗粒。
本发明在母种培养基内添加了营养缓释颗粒，该营养缓释颗粒外表设置了复合膜层，一方面复合膜层对内部的营养颗粒进行保护，便于保存，另一方面，复合膜层是以甲基纤维素和壳聚糖作为原材料，壳聚糖作为天然的抗菌物质，能够在一定程度上防止母种培养基被杂菌感染，降低组织的感染率，且甲基纤维素还能够作为后续分离组织菌丝生长所需的营养物质。其次，在复合膜层和营养缓释胶囊之间还填充了香樟木提取液，香樟木提取液具有防虫、抗菌的功效，在营养缓释颗粒保存的时候，可以起到对营养缓释颗粒保护作用，而在用于制备母种培养基的过程中，外部的复合膜层吸水溶胀变得松散，将内部的香樟木提取液释放出来，从而进一步提高了母种培养基的抗菌性能，能够在一定程度上进一步减少培养基被杂菌感染的几率。且本发明在母种培养基内添加了营养缓释颗粒，在一定程度上保证了培养过程中营养的长效、持续供应，从而能够将培养基内的营养物质浓度一直维持在适合的浓度，从而达到促进菌丝快速生长，缩短生长周期的目的。
进一步，所述香樟木提取液是将香樟木屑用水进行煎煮后，再经过净化处理后所得，具体为：取香樟木屑，加入去离子水，煎煮2h后，过滤得到一次滤液，滤渣再加入去离子水进行二次煎煮1h，过滤得到二次滤液，合并滤液，减压浓缩至2/3体积，然后加入壳聚糖溶液，搅拌混匀进行电泳处理，过滤，得到香樟木提取液。
香樟木提取液中包含了生物碱类、类黄酮类、蛋白质类、有机酸类等的化合物，通过加入的壳聚糖结合电泳处理，能够降低香樟木提取液中生物碱类化合物含量，将有益于菌丝生长的类黄酮类、蛋白质类、有机酸类等化合物尽可能保留。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种野生竹荪组织分离制备母种方法，发明人通过对不同成熟度的竹荪菌蕾的不同部位进行组织分离研究，发现竹荪的菌柄包被的分离效果非常好，比用菌柄分离成功率要高，且无膨大等不良的现象。而菌柄包被作为分离菌种材料的发现，解决了菌蕾成熟或已开伞的竹荪难以组织分离获取菌种的难题，也对竹荪菌种的资源收集和保藏具有重要的意义。
附图说明
图1是本发明的实施例一竹荪菌蕾里面的菌柄包被的位置及形态结构示意图；
图2是本发明的实施例一中的竹荪菌蕾解剖示意图；
其中，菌柄1、孢子层2、菌裙3、菌盖4、菌柄包被5、菌托6。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例一
S1：晴天时候采集三种不同成熟(冒顶、微冒顶、未冒顶)的竹荪菌蕾，以及竹荪开伞子实体，未经雨水冲刷，菌柄底部未遭到污染的竹荪子实体各若干，获得分离原材料；
制备母种培养基和木屑培养基，具体为：
每升母种琼脂培养基按照青杠木屑40g，箭竹叶10g，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂粉10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，余量为水的配方，以常用的现有的一般食用菌培养基配制方法进行配制，其中青杠木屑、马铃薯、箭竹叶煮沸30min取滤液，配好培养基进行分装试管并于121℃灭菌三十分钟后冷却至70℃摆放斜面，用于母种的分离，pH自然。
每100kg干料木屑培养基按照青杠木屑78kg，麦麸20kg，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，石膏0.5kg进行配制，具体为将青杠木屑提前一天浸泡，第二天取出沥水后按配方进行拌料，发酵24h后进行装瓶123℃灭菌2小时，灭菌完成后冷却至室温即可，用于琼脂母种的转接，pH自然。
S2：通过无菌处理，获得无菌分离材料菌柄包被，具体为：
对于未开伞的竹荪菌蕾，先将菌蛋表面洗净，然后用75％酒精浸泡1min后放在超净台上，同时将所需的试管斜面、分离工具等放在操作台上，开紫外灯杀菌30min，然后打开工作台进行组织分离。每个菌蛋取孢子、菌盖、菌柄的上中下三个部位以及菌柄包被等6个组织，均取黄豆大小的组织块放入斜面中，不同成熟度的菌蛋操作分离方法一样。做好标记，放入恒温培养箱中23℃下黑暗培养，每天定时观察，记录不同部位组织块在培养基中的污染和萌发情况；
对于开伞竹荪，将开伞竹荪的菌托洗净，清洗时勿将水滴在菌柄上以及菌蛋里面，然后75％酒精擦拭菌托后放入超净台上，同时将所需的试管斜面、分离工具等放在操作台上，开紫外灯杀菌30分钟，然后打开工作台进行组织分离。先用烧灼后冷却的接种针蘸取菌盖上内层的孢子在培养基上进行划线，再去掉菌托，取未与空气接触过的菌柄包被、菌柄底部接种在培养基上。
S3：母种分离后，于23℃温度下，避光培养，培养至菌丝萌发1-2cm，萌发情况如表1、表2所示，转移至木屑培养基中获得木屑培养基母种；
表1竹荪菌蛋分离的萌发情况
通过对组织的分离，由表1可以看出，2-7天后，分离组织陆续开始萌发，长出白色菌丝。各组织中，孢子的萌发率为零，且全部污染；菌柄的萌发率不同部位差异不大，不同成熟度的菌柄的萌发率差异较大，越成熟的菌蛋菌柄分离萌发率越低，且长到一定时间后有次级代谢产物产生，部分菌柄会极度膨大到原来体积的2-3倍；菌盖能长出白色绒毛，但是无法继续扩大生长。菌柄包被的萌发率最高，萌发时间最短，并且污染率也较低。因此孢子和菌盖不适合作为组织分离的对象，菌柄的各个部位萌发率差异不大，也能长出一定的白色菌丝。而菌柄包被萌发率最高、污染率最低，较适合作为母种分离的组织对象。
表2子实体分离的萌发情况
部位
污染率
萌发率
萌发时间d
菌柄下
75％
0
0
菌柄包被
15％
80％
3
孢子
100％
0
0
由表2可以看出，开伞竹荪的子实体分离的菌种污染率较大，主要是开伞后大部分组织和空气接触，感染杂菌严重，尽管取的是底部组织，依然难免有一定的污染。三个部位中，孢子和菌柄都没有萌发，孢子分离的全部污染，菌柄部位3天后组织开始膨大；而菌柄包被位于菌柄底部，其污染几率只有10％，萌发率为80％。菌柄萌发后的菌丝白色，萌发时间为3天，且菌丝浓密，是比较好的分离材料。因此菌柄包被依旧为开伞后的竹荪的组织分离的最佳材料。
S4：通过菌丝尖端提纯复壮得到纯化母种，转接原种、栽培种，最后通过仿野生种植进行栽培得到子实体；
S5：通过子实体组织分离进行系统选育，经过3-5年的系统培育，人工驯化，得到性状稳定、可用于繁殖生产的竹荪母种。
实施例二
本实施例和实施例一相比，其不同之处在于，所使用的母种培养基中原料还包括了营养缓释颗粒，该营养缓释颗粒是以营养缓释胶囊为内核，内核外包裹了复合膜层，且在内核和复合膜层之间填充有香樟木提取液，营养缓释胶囊是以营养液为囊芯，海藻酸钠/胶原蛋白复合材料为囊皮，其中营养液为现有的竹荪培养过程中所使用的营养液。
香樟木提取液是将香樟木屑用水进行煎煮后，再经过净化处理后所得，具体为：取香樟木屑，加入8倍香樟木屑体积去离子水，煎煮2h后，过滤得到一次滤液，滤渣再加入5倍滤渣体积去离子水进行二次煎煮1h，过滤得到二次滤液，合并滤液，减压浓缩至2/3体积，然后加入0.1倍滤液质量的2wt％壳聚糖溶液，搅拌混匀进行电泳处理，过滤，得到香樟木提取液。
营养缓释颗粒的制备具体为：
A1：将海藻酸钠溶于水中得到浓度为60g/L的海藻酸钠溶液，向海藻酸钠溶液中加入饱和胶原蛋白溶液，海藻酸钠和胶原蛋白的质量比为2:1，调节pH至6-7，加入0.01倍海藻酸钠溶液体积的无水乙醇，搅拌混匀后，于30℃加热回流30min，冷却至室温，加入等海藻酸钠溶液体积的营养液，搅拌混匀后，采用高压静电喷雾法，喷雾至不断搅拌的氯化钙溶液中，将微胶囊捞出用去离子水清洗干净得到营养缓释胶囊；
A2：称取甲基纤维素搅拌溶解于去离子水中，得到浓度为4g/L的甲基纤维素溶液，搅拌混匀后加入等体积的6g/L的壳聚糖溶液，搅拌混匀，在10000r/min条件下进行均质10min，均质过程中滴加加入1/2壳聚糖溶液体积的香樟木提取液，再以5g/L的固液比加入营养缓释微胶囊，超声分散后，加入交联剂，于25℃温度下，以300r/min的速度搅拌反应15min，反应完成后过滤，滤饼用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥得到营养缓释颗粒。
本实施例的每升所述母种培养基包括：青杠木屑40g，箭竹叶10g，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，琼脂粉10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g、营养缓释颗粒10g，余量为水，配制方法采用常规的方法进行配制即可。
对比例一
本对比例和实施例二相比，其不同之处在于，本对比例将香樟木提取液直接用于营养缓释颗粒的制备，不经过电泳处理。
对比例二
本对比例和实施例二相比，其不同之处在于，本对比例在母种培养基中直接添加了营养缓释胶囊。
按照本发明的方法，进行组织分离，得到开伞竹荪的菌柄包被组织，然后按照实施例一～对比例二的方法，于23℃温度下，避光培养，萌发情况如表3、表4所示。
表3竹荪菌蛋分离的萌发情况
污染率
萌发率
萌发时间d
实施例一
10％
80％
3
实施例二
1％
95％
2
对比例一
5％
87％
2
对比例二
10％
85％
3
通过表3的数据，结合表1、表2的数据可以看出，采用本实施例制备得到的母种培养基，分离组织的感染率下降，且菌丝萌发的时间缩短；而通过香樟木提取液的加入，能够有效降低分离组织的感染率，提高萌发率。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
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