一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用 (Biological ceramic microsphere and preparation method and application thereof ) 是由 林开利 万健羽 王旭东 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用。以陶瓷粉末、海藻酸钠和钙源的混合水溶液作为分散相并以第一流动速率向下游流动；以油相作为第二流动相,以第二流动速率与所述分散相在交汇点汇合后形成反应液并向下游流动；以含有引发剂的油相作为外接流动相与反应液在所述交汇点的下游汇合后发生交联反应,得到含有微球的溶液；分离微球,煅烧后去除海藻酸钠得到生物陶瓷微球。得到的生物陶瓷微球孔隙率、粒径大小可控、粒径均一、且具有良好的生物活性,可以用作硬组织缺损修复材料和体外骨组织培养用细胞载体。(The application discloses a biological ceramic microsphere and a preparation method and application thereof. Taking a mixed water solution of ceramic powder, sodium alginate and a calcium source as a dispersion phase and flowing downstream at a first flow rate; taking the oil phase as a second flow phase, converging with the dispersed phase at a second flow rate at a convergence point to form a reaction liquid and flowing downstream; taking an oil phase containing an initiator as an external mobile phase, converging a reaction liquid at the downstream of the convergence point, and then carrying out a crosslinking reaction to obtain a solution containing microspheres; separating the microspheres, and removing sodium alginate after calcining to obtain the biological ceramic microspheres. The obtained biological ceramic microspheres have controllable porosity and particle size, uniform particle size and good biological activity, and can be used as hard tissue defect repair materials and cell carriers for in vitro bone tissue culture.)
技术领域
本申请涉及生物材料技术领域，具体涉及一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用。
背景技术
骨缺损是一种常见的临床表现，目前传统的骨缺损治疗方法包括自体骨移植和异体骨移植，前者供体有限且容易造成二次损伤，后者容易引起宿主免疫排斥反应。在过去的几十年中，研究人员开发了大量的骨生物材料，如钛金属及其复合材料、陶瓷材料、天然高分子材料和人工合成聚合物材料等。其中陶瓷材料主要分为生物惰性材料和生物活性材料。生物活性材料具有良好的骨诱导性和机械性能，降解释放的各种离子能刺激细胞产生新组织，促进新骨形成。
已知人体骨骼是由65％的无机矿物(主要是羟基磷灰石)和35％的有机成分(各种胶原蛋白)组成，因此常选择与人体骨骼成分相近的生物陶瓷材料。羟基磷灰石属于钙-磷基生物陶瓷，该类陶瓷具有良好的生物相容性和机械性能，但生物活性低。近年来钙-硅基生物材料由于其优良的生物活性和生物可降解性越来越受到重视。
生物活性材料通常以颗粒、微球、块状或支架等形式应用于骨修复治疗。颗粒状陶瓷缺乏大孔，只能提供有限的细胞长入，而且颗粒状陶瓷的各种棱边和棱角会对细胞和组织会造成伤害；传统的块状陶瓷太脆，无法切割成特殊形状来适应不规则的骨缺损，而且缺乏相互连接的孔隙结构也限制了大块陶瓷在临界尺寸骨缺损中的应用。微球比表面积高，具有有利于流动的曲面表面，可以通过注射方式填充各种不规则骨缺损，能够满足各种临床需求。Li等人(Mater Sci Eng C.,2017,70:1200-1205)通过溶剂挥发法制备出250-500μm的β-TCP微球，该微球具有良好的生物相容性和细胞粘附性，在模拟体液中浸泡后表面有磷灰石沉积，能促进成骨基因的表达，植入老鼠皮下8周后，微球之间形成了丰富的骨样结构。
传统的生物陶瓷微球制备方法有喷雾干燥法、溶剂挥发法和溶胶凝胶法。但这类方法得到的微球粒径分布范围广，在骨缺损填充位置填充时会出现小尺寸球和大尺寸球紧密堆积的现象，导致微球之间孔隙变小，进而导致细胞、血管和新生骨组织难以长入。微流控法是制备粒径均匀、单分散性好的微球方法之一，在微流控芯片通道上，通过控制溶液浓度、连续相和分散相流速比等参数有效调控微球直径的大小。目前，采用微流控法制备粒径均一的陶瓷微球还未见报道。
发明内容
本申请提供一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用，可以得到具有生物活性和生物可降解性，同时粒径和孔隙率可控、且粒径均一的陶瓷微球，以满足可注射骨修复生物材料发展的需要。
本申请提供一种生物陶瓷微球的制备方法，以陶瓷粉末、海藻酸钠和钙源的混合水溶液作为分散相并以第一流动速率向下游流动；以油相作为第二流动相，以第二流动速率与所述分散相在交汇点汇合后形成反应液并向下游流动；以含有引发剂的油相作为外接流动相与所述反应液在所述交汇点的下游汇合后发生交联反应，得到含有微球的溶液；分离所述微球，煅烧后去除海藻酸钠得到生物陶瓷微球。
可选的，在本申请的一些实施例中，油相为二甲基硅油。
可选的，在本申请的一些实施例中，陶瓷粉末包括羟基磷灰石、β-磷酸三钙、硅酸钙、镁黄长石或其他生物陶瓷粉体中的一种或多种混合物。
可选的，在本申请的一些实施例中，钙源包括乙二胺四乙酸二钠钙盐(Ca-EDTA)；引发剂包括乙酸。
可选的，在本申请的一些实施例中，陶瓷粉末的粒度可以为0.1～50μm，也可以为1～40μm，还可以为10～30μm。
可选的，在本申请的一些实施例中，以分散相的总体积计，陶瓷粉末的重量体积百分浓度可以为3～20％，也可以为5～18％，还可以为10～15％。
可选的，在本申请的一些实施例中，以分散相的总体积计，海藻酸钠的重量体积百分浓度可以为1～3％，也可以为1.3～2.7％，还可以为1.5～2.5％。
可选的，在本申请的一些实施例中，以分散相的总体积计，钙源的重量体积百分浓度可以为1～3％，也可以为1～2.5％，还可以为2％。
可选的，在本申请的一些实施例中，以外接流动相的总体积计，引发剂的体积百分比含量可以为0.5～5％，也可以为1～4％，还可以为1.5～3％。
可选的，在本申请的一些实施例中，第一流动速率可以为0.04～0.2mL/min，也可以为0.05～0.15mL/min，还可以为0.07～0.1mL/min。
可选的，在本申请的一些实施例中，第二流动速率可以为0.1～2mL/min，也可以为0.2～1.5mL/min，还可以为0.5～1mL/min。
可选的，在本申请的一些实施例中，外接流动相的流动速率和第二流动速率相同。
可选的，在本申请的一些实施例中，煅烧的温度可以为800～1300℃，也可以为900～1200℃，还可以为1000～1100℃。
可选的，在本申请的一些实施例中，煅烧的时间可以为2～4小时，也可以为2.3～3.7小时，还可以为2.5～3.5小时。
相应的，本申请还提供一种生物陶瓷微球，生物陶瓷微球采用上述的制备方法制得。
可选的，在本申请的一些实施例中，生物陶瓷微球的直径可以为100～1000μm，也可以为200～900μm，还可以为300～800μm。
可选的，在本申请的一些实施例中，生物陶瓷微球的孔隙大小可以为0.1～0.6μm，也可以为0.2～0.5μm，还可以为0.3～0.4μm。
此外，本申请还提供一种上述的生物陶瓷微球在硬组织缺损修复材料和体外细胞培养载体中的应用。
本申请采用微流控法来制备生物陶瓷微球，具有如下有益效果：
(1)通过本申请的制备方法制备出粒径均一的生物陶瓷微球。通过调节陶瓷粉末的浓度、第一流动速率与第二流动速率和同轴针头型号等制备工艺参数可以调控陶瓷微球的直径大小(100～1000μm)。采用本发明提供的方法，可以根据不同的组织损伤修复对材料的不同要求制备出具有不同特性的多孔材料以满足临床应用的需要；
(2)通过体外细胞实验表明，生物陶瓷微球能促进成骨细胞增殖和粘附。体内动物实验表明，采用本发明方法制备得到的生物陶瓷微球之间形成了丰富的骨样，良好地促进新骨形成，具有优良的骨再生能力；
(3)本申请工艺简单易行且易于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是生物陶瓷微球制备方法的示意图；
图2是实施例一中不同陶瓷粉末浓度条件下制备得到的生物陶瓷微球体视镜图(A)5％，(B)10％，(C)15％；
图3是实施例一中不同第二流动速率条件下制备得到的生物陶瓷微球体视镜图(A)0.45mL/min，(B)0.6mL/min，(C)0.75mL/min；
图4是实施例一中不同同轴针头型号条件下制备得到的生物陶瓷微球体视镜图(A)17G、22G和(B)14G、18G；
图5是实施例一中制备得到的生物陶瓷微球与大鼠骨髓间充质干细胞培养后的CCK-8图；
图6是实施例一中制备得到的生物陶瓷微球与大鼠骨髓间充质干细胞共培养后细胞粘附情况；
图7是实施例一中制备得到的生物陶瓷微球填充到大鼠股骨破损中的Micro-CT图；
图8是实施例一中制备得到的生物陶瓷微球填充到大鼠股骨破损中的骨体积分数图；
图9是实施例二和实施例三中制备得到的生物陶瓷微球体视镜图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
本申请实施例提供一种生物陶瓷微球的制备方法，如图1所示，所采用的微流控装置包括注射泵1、聚四氟乙烯管2和同轴针头3，制备方法包括：
(1)配制1～3％(w/v)海藻酸钠水溶液，并加入3～20％(w/v)陶瓷粉末和1～3％(w/v)Ca-EDTA，搅拌过夜，使用前超声分散2h；
(2)将不同浓度的陶瓷粉末/Ca-EDTA/海藻酸钠水溶液作为分散相，以第一流动速率0.04～0.2mL/min向下游流动，二甲基硅油作为第二流动相，以第二流动速率0.1～2mL/min与分散相汇合后在同轴针头3出口处形成粒径均一的微球液滴；
(3)在微球液滴的通道上再外接一个含0.5～5％(v/v)乙酸的二甲基硅油的外接流动相，当微球液滴中的Ca-EDTA遇到乙酸后会释放钙离子，钙离子能使海藻酸钠立刻交联，形成微球；
(4)用石油醚洗去微球表面的二甲基硅油，放入60℃烘箱烘干。最后将微球以2℃/min的升温速率至800～1300℃煅烧2～4h，去除微球的海藻酸钠，得到本申请的生物陶瓷微球。
在本申请的一些实施例中，陶瓷粉末包括羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]、β-磷酸三钙(β-TCP)、硅酸钙(CaSiO3,CS)或镁黄长石(AKT)中的至少一种；该类陶瓷粉末具有良好的生物活性和生物可降解性。
在本申请的一些实施例中，同轴针头的型号可以为17G、22G或14G、18G，其中17G内径为1.11mm、22G内径为0.42mm；14G内径为1.64mm、18G外径为0.92mm。
下面结合具体实施例说明。
以下实施例中，陶瓷粉末可以采用化学沉淀法、溶胶凝胶法、高温固相法制备所得、或采用商业购买的粉末原料。
海藻酸钠、乙酸、二甲基硅油、乙二胺四乙酸二钠钙盐等均为分析纯级别；水为去离子水。
注射泵型号为LSP01-3A，LongerPump。
实施例一、
本实施例的制备生物陶瓷微球的方法包括如下步骤：
(1)取0.4g的海藻酸钠和0.4g的Ca-EDTA溶于20mL去离子水中，过夜搅拌，再将3g的β-磷酸三钙(β-TCP)粉末加入到上述海藻酸钠溶液中并搅拌2h以上；
(2)采用17G、22G的同轴针头，内径1.2mm、外径1.6mm的聚四氟乙烯管以及LSP01-3A注射泵组成的微流控系统，以β-TCP/Ca-EDTA/海藻酸钠复合溶液为分散相(水相)，二甲基硅油为油相，采用油包水法制备微球，分散相的流速为0.06mL/min，油相的流速为0.3mL/min，在同轴针头出口处形成粒径均一的微球液滴；
(3)为使微球能够固化，在聚四氟乙烯管道上添加一个新的通道，加入二甲基硅油+1％(v/v)乙酸，流速为0.3mL/min，乙酸能使Ca-EDTA释放Ca离子，进而使海藻酸钠交联，形成微球；
(4)将得到的微球用石油醚反复清洗并烘干，以2℃/min的升温速率升至1100℃煅烧，保温2h，随炉冷却，得到生物陶瓷微球。
制得的β-TCP生物陶瓷微球直径在455±23μm。
如图2所示，改变陶瓷粉末的重量体积百分浓度，陶瓷粉末的重量体积百分浓度分别为(A)5％，(B)10％，(C)15％；对上述不同条件下制得的β-TCP生物陶瓷微球，在日本OLYMPΜS公司的SZ2-ILST体视镜下观察微球直径分布，可见，当陶瓷粉末的重量体积百分浓度从5％增加15％时，生物陶瓷微球的直径从320±21μm增加至455±23μm。
如图3所示，改变第二流动速率，第二流动速率分别为(A)0.45mL/min，(B)0.6mL/min，(C)0.75mL/min；对上述不同条件下制得的β-TCP生物陶瓷微球，在日本OLYMPΜS公司的SZ2-ILST体视镜下观察微球直径分布，可见，当第二流动速率从0.45mL/min增加0.75mL/min时，生物陶瓷微球的直径从378±23μm减小至301±19μm。
如图4所示，改变同轴针头型号，同轴针头的型号分别为(A)17G、22G和(B)14G、18G，其中17G内径为1.11mm、22G内径为0.42mm；14G内径为1.64mm、18G外径为0.92mm；对上述不同条件下制得的β-TCP生物陶瓷微球，在日本OLYMPΜS公司的SZ2-ILST体视镜下观察微球直径分布，可见，当同轴针头改变从17G、22G换成14G、18G时，即同轴针头内径增加时，生物陶瓷微球的直径从455±23μm增加至725±15μm。
由以上结果可知，当陶瓷粉末的重量体积百分浓度从5％增加15％时，生物陶瓷微球的直径从320±21μm增加至455±23μm；当第二流动速率从0.45mL/min增加0.75mL/min时，生物陶瓷微球的直径从378±23μm减小至301±19μm；当同轴针头改变从17G、22G换成14G、18G时，生物陶瓷微球的直径从455±23μm增加至725±15μm。且本实施例得到的生物陶瓷微球直径可控制在100-1000μm范围内，生物陶瓷微球的粒径均一。
将本实施例得到的不同直径β-TCP生物陶瓷微球与大鼠骨髓间充质干细胞进行共培养，在37℃、5％CO2的条件下培养1、4、7天，然后进行CCK-8细胞增殖检测，如图5所示，300μm、500μm和700μm的β-TCP生物陶瓷微球在与大鼠骨髓间充质干细胞共培养后，在第7天时相比于第1天和第4天均有细胞增殖；相对于不添加β-TCP生物陶瓷微球的空白对照，300μm和500μm的β-TCP生物陶瓷微球在与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天后，其细胞增殖有显著的增加，其中300μm的β-TCP生物陶瓷微球共培养后，细胞增殖最为显著，以上结果说明了本实施例制备的生物陶瓷微球能较好地促进细胞增殖。
通过显微镜观察本实施例得到的不同直径的生物陶瓷微球与大鼠骨髓间充质干细胞共培养24小时后的细胞粘附情况，如图6所示，300μm、500μm和700μm的β-TCP生物陶瓷微球在与大鼠骨髓间充质干细胞共培养后，细胞均有较好粘附，可见本实施例制备的生物陶瓷微球能够促进细胞粘附。以上结果说明，本申请的陶瓷微球具有很好的生物相容性、生物活性和细胞粘附性。
将本实施例得到的不同直径的β-TCP生物陶瓷微球填充到大鼠股骨缺损中，经过8周后用Micro-CT分析发现，如图7所示，300μm和500μm的β-TCP生物陶瓷微球填充到大鼠股骨缺损中后，相对于未填充β-TCP生物陶瓷微球的对照组，其在微球之间形成丰富的新骨，并且计算骨体积分数，如图8所示，填充了β-TCP生物陶瓷微球后，新骨形成骨体积分数(BV/TV，骨体积/组织体积)高于未填充β-TCP生物陶瓷微球，其中500μm的β-TCP生物陶瓷微球填充后新骨形成体积分数更高。说明本实施例的生物陶瓷微球具有较好的成骨效果。
由上述体外细胞实验和体内动物实验表明，β-TCP生物陶瓷微球是一种具有良好生物活性、能促进成骨细胞增殖和加速骨愈合的生物材料。
实施例二、
本实施例的制备生物陶瓷微球的方法包括如下步骤：
(1)取0.4g的海藻酸钠和0.4g的Ca-EDTA溶于20mL去离子水中，过夜搅拌，再将3g的羟基磷灰石(HA)粉末加入到上述海藻酸钠溶液中并搅拌2h以上；
(2)采用17G、22G的同轴针头，内径1.2mm、外径1.6mm的聚四氟乙烯管以及LSP01-3A注射泵组成的微流控系统，以β-TCP/Ca-EDTA/海藻酸钠复合溶液为分散相(水相)，二甲基硅油为连续相(油相)，采用油包水法制备微球，分散相的流速为0.06mL/min，连续相的流速为0.3mL/min，在同轴针头出口处形成粒径均一的微球液滴；
(3)为使微球能够固化，在聚四氟乙烯管道上添加一个新的通道，加入二甲基硅油+1％(v/v)乙酸，流速为0.3mL/min，乙酸能使Ca-EDTA释放Ca离子，进而使海藻酸钠交联，形成微球；
(4)将得到的微球用石油醚反复清洗并烘干，以2℃/min的升温速率升至1100℃煅烧，保温2h，随炉冷却，得到生物陶瓷微球。
将制得的HA生物陶瓷微球，在日本OLYMPΜS公司的SZ2-ILST体视镜下进行观察，得到结果如图9A所示，得到的生物陶瓷微球直径为450±30μm。
实施例三、
本实施例的制备生物陶瓷微球的方法包括如下步骤：
(1)取0.4g的海藻酸钠和0.4g的Ca-EDTA溶于20mL去离子水中，过夜搅拌，再将3g的硅酸钙(CS)粉末加入到上述海藻酸钠溶液中并搅拌2h以上；
(2)采用17G、22G的同轴针头，内径1.2mm、外径1.6mm的聚四氟乙烯管以及LSP01-3A注射泵组成的微流控系统，以β-TCP/Ca-EDTA/海藻酸钠复合溶液为分散相(水相)，二甲基硅油为连续相(油相)，采用油包水法制备微球，分散相的流速为0.06mL/min，连续相的流速为0.3mL/min，在同轴针头出口处形成粒径均一的微球液滴；
(3)为使微球能够固化，在聚四氟乙烯管道上添加一个新的通道，加入二甲基硅油+1％(v/v)乙酸，流速为0.3mL/min，乙酸能使Ca-EDTA释放Ca离子，进而使海藻酸钠交联，形成微球；
(4)将得到的微球用石油醚反复清洗并烘干，以2℃/min的升温速率升至1100℃煅烧，保温2h，随炉冷却，得到生物陶瓷微球。
将制得的CS生物陶瓷微球，在日本OLYMPΜS公司的SZ2-ILST体视镜下进行观察，得到结果如图9B所示，得到的生物陶瓷微球直径为480±31μm。
本申请制备得到具有生物活性和降解性、直径和孔隙率可控、且粒径匀一的生物陶瓷微球，作为硬组织缺损修复材料和体外骨组织培养用细胞支架材料具有独特优势。
以上对本申请实施例所提供的一种生物陶瓷微球及其制备方法和应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
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