化合物eutyscoparins G及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
阅读说明：本技术 化合物eutyscoparins G及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 (Compound eutyscoparin G, preparation method thereof and application thereof in preparation of antibacterial drugs ) 是由 吴杰英 张文歌 谭海波 狄金明 李腾成 霍璐琼 于 2021-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化合物eutyscoparins G及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。如式(I)所示的化合物eutyscoparins G：本发明从内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8中分离制备得到化合物teutyscoparins G,该类化合物teutyscoparins G具有比较显著的抗菌活性,可以用于制备抗菌药物,为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物,为开发利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。(The invention discloses a compound eutyscoparin G, a preparation method thereof and application thereof in preparing antibacterial drugs. A compound, eutyscoparins G, of formula (I): the compound, namely the teutyracopis G, is separated and prepared from endophytic fungus Eutypella scoparia SCBG-8, has relatively obvious antibacterial activity, can be used for preparing antibacterial drugs, provides candidate compounds for researching and developing new antibacterial drugs, and provides a new candidate compound for developing and benefitingThe natural active substances from plant endophytes provide scientific basis.)
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物eutyscoparins G及其制备方法和在制 备抗菌药物中的应用。
背景技术
Eutypella属真菌分布广泛，次级代谢产物丰富多样。主要代谢产物包括萜类、细胞松 弛素类、甾体类、内酯类，其中萜类主要以海松烷型二萜,倍半萜为主。并且，这些次级代 谢产物显示了抗肿瘤、抗菌、抗炎以及抗增殖等多种生物活性。Sesquiterpenes类化合物是 真菌中的一类代谢产物，结构特点为分子中含有15个碳原子组成的三个异戊二烯单元，具 有链状、环状等多种骨架结构。该类型分子已被报道具有多种生物活性。我们在研究内生 真菌SCGB-8中发现了1个具有抗菌活性的新化合物eutyscoparins G。
发明内容
：本发明的第一个目的是提供具有抗菌活性的化合物eutyscoparins G。
本发明的化合物eutyscoparins G，其结构如式(I)中所示：
本发明的第二个目的是提供一种化合物eutyscoparins G的制备方法，该制备方法中所 述的化合物eutyscoparins G从植物内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的发酵培养物中分离 制备得到的，具体包括以下步骤：
(1)制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该 固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比10:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6的组分Fr.3；
将组分Fr.3经反相柱色谱，用甲醇-水体积比80:20,85:15,90:10,95:5,100:0,丙酮梯度洗脱， 得到6个亚组分Fr.3.1-Fr.3.6，其中组分Fr.3.2在Sephadex LH-20柱色谱仪上纯化得到4个 馏分Fr.3.2.1-Fr3.2.4。Fr.3.2.2经过进一步的正相硅胶柱，用正己烷：乙酸乙酯20:1,10:1,5:1, 2:1,1:1梯度洗脱得到5个亚组分Fr.3.2.2.1-Fr.3.2.2.5。Fr.3.2.2.3用半制备HPLC分离纯化， 得到化合物eutyscoparins G。
所述的制备内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵培养物具体步骤为：挑取 SCBG-8的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天， 制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养 30天，制得SCBG-8的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以 下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加 入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000mL，灭菌 制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每300g大米与360mL水混合灭菌制 得。
本发明通过实验发现，化合物eutyscoparins G对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌的IC50值为6.25μg/mL。阳性对照物万古霉素对以上两种革兰氏阳性菌的IC50值为 1.25μg/mL。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparins G具有比较显著的抗菌活性。
因此，本发明的第三个目的是提供化合物eutyscoparins G，或其药用盐在制备抗菌药物 中的应用。所述的抗菌药物优选为抗金黄色葡萄球菌，抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。
本发明的第四个目的是提供一种抗菌药物，该抗菌药物包含化合物teutyscoparins G， 或其药用盐作为活性成分。优选，所述的抗菌药物为抗抗金黄色葡萄球菌，抗耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌药物。
本发明的第五个目的是提供内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8在制备化合物teutyscoparins G中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明从内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8中分离制备得到化合物teutyscoparins G， 该类化合物teutyscoparins G具有比较显著的抗菌活性，可以用于制备抗菌药物，为研究与 开发新的抗菌药物提供了候选化合物，为开发利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了 科学依据。
本发明的真菌Eutypella scoparia SCBG-8已公开于Wenge Zhang,MiaomiaoWang,Sha Zha,Kangping Xu,Guishan Tan,Shengxiang Qiu,Zhenxing Zou,HaiboTan.Eutyscoparols A-G, polyketide derivatives from endophytic fungusEutypella scoparia SCBG-8.Fitoterapia,2020, 146,104681.该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是化合物teutyscoparins G的1H NMR谱；
图2是化合物teutyscoparins G的13C NMR谱；
图3是化合物teutyscoparins G的1H-1H COSY谱；
图4是化合物teutyscoparins G的HSQC谱；
图5是化合物teutyscoparins G的HMBC谱；
图6是化合物teutyscoparins G的NOESY谱；
图7是化合物teutyscoparins G的HRESIMS谱；
图8是化合物teutyscoparins G的UV谱；
图9是化合物teutyscoparins G的CD谱；
图10是化合物teutyscoparins G的IR谱；
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的分离纯化和鉴定
本发明的内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8是2016年9月，从中国科学院华南植物 园(SCBG)澳洲植物园美丽薄子木(Leptospermum brachyandrum)叶片中分离得到的，通过 ITS序列分析进一步鉴定该内生菌株，GenBank登录号为:MN788605，经blast比对，同源 分析，鉴定该菌株属于Eutypella属真菌，命名为Eutypella scoparia SCBG-8。
2、Eutypella scoparia SCBG-8的固体发酵
将活化的内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基 (每升培养基是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水 补足至1000mL，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后 将种子液按0.1mL/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配 制的：将每300g大米与360mL水混合灭菌混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得) 中，28℃条件下培养30天，制得SCBG的固体发酵培养物。
3、化合物teutyscoparins G的制备
(1)往SCBG的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液合并后经浓缩后得浸膏(45g)。
浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为100:1，50:1，20:1，10:1，5:1， 2:1，1:1，0:1作为洗脱剂，梯度洗脱；收集正己烷-乙酸乙酯体积比10:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v展开得Rf＝0.5-0.6的组分Fr.3；
将组分Fr.3经反相柱色谱，用甲醇-水体积比80:20,85:15,90:10,95:5,100:0,丙酮梯度洗脱， 顺序得到6个亚组分Fr.3.1-Fr.3.6，其中组分Fr.3.2在Sephadex LH-20柱色谱仪上纯化得到 4个馏分Fr.3.2.1-Fr3.2.4。Fr.3.2.2(极性：经TLC薄层层析以正己烷：丙酮＝5/1v/v爬板 Rf值为0.2-0.8，有紫外，香草醛显色呈深蓝色)经过进一步的正相硅胶柱，用正己烷：乙 酸乙酯20:1,10:1,5:1,2:1,1:1v/v梯度洗脱顺序得到5个亚组分Fr.3.2.2.1-Fr.3.2.2.5。 Fr.3.2.2.3用半制备HPLC分离纯化，HPLC的柱子参数为YMC-Pack ODS-A，洗脱条件为 体积分数85％甲醇水，流速2ml/min，收集保留时间为34min的馏分，得到化合物 eutyscoparins G。
4、化合物eutyscoparins G的结构鉴定
1H-NMR、13C-NMR、HMBC核磁共振谱图用Bruker Advance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI-MS数据用VG Autospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱 用岛津UV-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
如图1-10所示，图1是化合物eutyscoparins G的1H NMR谱；图2是化合物eutyscoparins G的13C NMR谱；图3是化合物eutyscoparins G的1H-1H COSY谱；图4是化合物 eutyscoparins G的HSQC谱；图5是化合物eutyscoparins G的HMBC谱；图6是化合物eutyscoparins G的NOESY谱；图7是化合物eutyscoparins G的HRESIMS谱；图8是化合 物eutyscoparins G的UV谱；图9是化合物eutyscoparins G的CD谱；图10是化合物eutyscoparins G的IR谱；
化合物1为黄色粉末(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS[M+H]+m/z 223.2054，C15H27O，计算值为223.2056，确定化合物的分子式为C15H26O，不饱和度为3；1H-NMR 谱显示一个烯烃质子信号[δH 5.31(s,H-3)]；3个甲基信号[δH 0.93(d,J＝6.9Hz,H3-13),1.6 (s,H3-14),0.77(s,H3-15)]。13C-NMR谱以及HSQC谱显示化合物1中有15个碳信号，包括 2个季碳(包括1个烯基碳)，4个次甲基，6个亚甲基，以及3个甲基。化合物eutyscoparins G的平面结构结构通过进一步分析其COSY、HSQC以及HMBC等二维谱图得以确定，化 合物I的绝对构型是通过计算ECD法得以确定。
经过上述方法分离的目标化合物eutyscoparins G的结构式如式(I)所示：
表1化合物1的核磁数据(500MHz/125MHz,δin ppm,J in Hz)
实施例2
采用MHB(Microbroth dilution in Mueller-Hinton broth medium)法测试化合物 eutyscoparins G的抗菌活性。
1、试验用试剂：将本发明制备的化合物eutyscoparins G用二甲基亚砜(DMSO)溶解 得浓度为1mg/mL的母液，再用96孔板梯度稀释。阳性对照为万古霉素。
本实验所用菌株为S.aureus(26003)和MRSA(JCSC 3063)。
2、实验方法：按照CLSI指南，采用MHB(Microbroth dilution in Mueller-Hintonbroth medium)法测定MIC值，以刃天青为可见指示剂，评估化合物的抗菌活性。取对数生长期 的S.aureus(26003)和MRSA(JCSC 3063)细菌，新鲜HB培养基稀释以UV-6000分光光 度计调整至OD600＝0.07,将上述细菌悬液与刃天青以体积比6:9混匀接种于96孔板,每孔 加入180μL的细菌悬液以及20μL 1mg/mL化合物eutyscoparins G母液，并设2个空白孔 对照，2个阳性对照，梯度稀释后于37℃、5％CO2培养箱培养，16-20h后观察颜色变化。 每次试验重复3次，并计算其MIC值。
3、实验结果：本发明制备的化合物eutyscoparins G对革兰氏阳性菌S.aureus(26003)和 MRSA(JCSC 3063)的MIC值为6.25μg/mL。阳性对照物万古霉素对S.aureus(26003)和 MRSA(JCSC 3063)的MIC值为1.25μg/mL。此结果表明：本发明的化合物eutyscoparins G 具有比较显著的抗菌活性，因此，本发明为研究与开发新的抗菌药物提供了候选化合物， 为开发利用植物内生菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明公开了化合物eutyscoparins G及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。本发 明所述的化合物eutyscoparins G是从内生真菌Eutypella scoparia SCBG-8的发酵培养物中分 离制备得到的。经试验证明，化合物eutyscoparins G对对革兰氏阳性菌S.aureus(26003)和 MRSA(JCSC 3063)的MIC值为6.25μg/Ml,显示出显著的抗菌活性，可以用于制备抗菌药物。
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