一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法
阅读说明：本技术 一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法 (Preparation method of graft modified fish protein-sugar coupling compound ) 是由 陈跃文 刘飞建 董秀萍 沈诗珂 胡豪犇 丁致文 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法,包括,将蛋白溶解于高离子强度缓冲液,经高速剪切后获得均一的肌原纤维蛋白溶液；将肌原纤维蛋白溶液经高压均质预处理使蛋白展开后,其α-螺旋含量提高,糖基化位点增加,然后与氨基葡萄糖在水相中进行湿法糖基化反应,利用大分子拥挤理论稳定天然蛋白质结构,提高糖基化程度；将糖基化反应后的产物进行透析脱糖,并进行真空冷冻干燥,得到本发明的接枝改性蛋白-糖耦联复合物。相比于传统糖基化方式,本发明所阐述的制备方法可显著提高肌原纤维蛋白与糖基供体的接枝度以及在低离子溶剂中的溶解度,其抗氧化能力也得到提升。(The invention discloses a preparation method of a graft modified fish protein-sugar coupled compound, which comprises the steps of dissolving protein in a buffer solution with high ionic strength, and obtaining a uniform myofibrillar protein solution after high-speed shearing; after the myofibrillar protein solution is subjected to high-pressure homogenization pretreatment to expand protein, the alpha-helix content is increased, glycosylation sites are increased, then the myofibrillar protein solution and glucosamine are subjected to wet glycosylation reaction in a water phase, a natural protein structure is stabilized by utilizing a macromolecule crowding theory, and the glycosylation degree is improved; and (3) dialyzing and desugarizing the product after the glycosylation reaction, and carrying out vacuum freeze drying to obtain the graft modified protein-sugar coupled compound. Compared with the traditional glycosylation mode, the preparation method provided by the invention can obviously improve the grafting degree of the myofibrillar protein and the glycosyl donor and the solubility in a low-ion solvent, and the oxidation resistance of the preparation method is also improved.)
技术领域
本发明涉及盐溶性动物蛋白的改性研究领域，具体涉及一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法。
背景技术
俄罗斯鲟鱼肉味道鲜美，肉质肥厚，鲟鱼肉中粗蛋白质含量约占肌肉的15.20～17.25％，主要是肌原纤维蛋白，含有18种氨基酸，含量最高的氨基酸为谷氨酸，其次为赖氨酸、亮氨酸和天门冬氨酸，8种人体必需氨基酸占总氨基酸含量的39.87～43.09％，高于FAO/WHO标准(35.38％)，呈味氨基酸有4种，具有较好的生物学价值。我国鲟鱼养殖量占全球养殖量的85％，鲟鱼肉资源丰富，但是多以初级加工产品为主，如何充分利用鲟鱼肉，实现鲟鱼肌原纤维蛋白的精深加工成为提升其应用价值的研究热点。然而肌原纤维蛋白在低离子强度介质中溶解性较差，因此限制了其在水相体系中的运用及作为营养补充剂的发展，从而无法实现广泛的加工利用。
氨基葡萄糖是一种天然的氨基单糖，主要参与构建人体组织及细胞膜，是人体关节软骨基质中蛋白聚糖的重要成分。氨基葡萄糖还具有抗炎、缓解骨性关节炎疼痛等生理活性，因此氨基葡萄糖常被作为食品补充剂，市场前景广阔，研究上也深受重视。
糖基化技术是一种基于蛋白质的游离氨基酸和还原性糖之间的美拉德反应的蛋白质改性方法，有助于改善食品蛋白质的功能特性、抗氧化能力。目前糖基化改性蛋白的方式主要为干法和湿法，虽然干热方法可以有效地改善食品蛋白质的功能特性，但是其制备工艺复杂、反应条件严格难以控制、存在产品褐变而影响产品的感官特性。湿法糖基化反应条件温和，时间短，能显著改善蛋白质的功能特性，减少高温条件下干法反应有害副产物的产生，工业化应用前景好。但单一的糖基化改性对提升蛋白质功能性质的效果非常有限，因此，非热加工技术与糖基化复合改性在食品加工领域越来越受到重视，如超声波、脉冲电场、动态高压微射流等辅助改性。高压均质技术是一种利用高压改变大分子物理、化学及结构性能的加工方法，能够诱导肌原纤维蛋白去折叠展开，并且暴露出内部氨基酸基团，增加糖基化位点，提高蛋白改性程度，从而改善肌原纤维蛋白的功能特性，因此高压均质结合糖基化复合改性具有良好的应用前景。
发明内容
本发明旨在提供一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法，该方法首先对肌原纤维蛋白进行高压均质预处理，并对其进行湿法糖基化改性。湿法糖基化具有成本低、操作简单高效、反应时间短、反应条件温和、合成的偶联物易于分离等突出优点，能够克服传统工艺缺陷，显著提升肌原纤维蛋白的功能特性，具有广阔的发展前景。
一种接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物的制备方法，所述方法包括以下过程：
1)将蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为20～40mg/mL；
2)将1)所得蛋白溶液经过高速剪切预处理后，再进行二次高压均质处理；
3)向2)所得的蛋白溶液中加入糖基供体，在35～40℃环境下反应7～9小时；
4)将3)所得溶液进行透析，透析时间为20～24小时，去除多余糖基供体；
5)将4)所得去除糖基供体的溶液进行真空冷冻干燥，得到目标接枝改性蛋白-糖耦联复合物(即接枝改性鱼肉蛋白-糖耦联复合物)。
本发明中，将肌原纤维蛋白溶液经高压均质预处理使蛋白展开后，其α-螺旋含量提高，糖基化位点增加，然后与氨基葡萄糖在水相中进行湿法糖基化反应，利用大分子拥挤理论稳定天然蛋白质结构，提高糖基化程度；将糖基化反应后的产物进行透析脱糖，并进行真空冷冻干燥，得到本发明的接枝改性蛋白-糖耦联复合物。相比于传统糖基化方式，本发明所阐述的制备方法可显著提高肌原纤维蛋白与糖基供体的接枝度以及在低离子溶剂中的溶解度，其抗氧化能力也得到提升。
进一步地，步骤1)中，所述的磷酸盐缓冲液为0.4～0.8mol/L，最优选为0.6mol/L。所述蛋白为鲟鱼肌原纤维蛋白。
进一步地，步骤2)中，所述的高速剪切的条件为：剪切速率为8000～10000rpm，时间为1～2分钟，均质压力为400～600bar。
进一步地，步骤3)中，所述的糖基供体为氨基葡萄糖，蛋白与糖基供体的摩尔比为1:1～1:3。
进一步地，步骤4)中，透析采用的透析液为磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L，最优选为0.1mol/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本方法克服了现有方法对肌原纤维蛋白改性不充分的问题，通过高压均质暴露出更多糖基化位点，大大提升了氨基葡萄糖与肌原纤维蛋白的接枝度；
(2)本发明显著增加了改性产物在低离子强度介质中的溶解度，同时改性产物的抗氧化能力也得到了提升；
(3)整个改性过程操作简单、产品性能稳定、副产物形成较少，因此具有良好的工业化、规模化应用前景。
附图说明
图1为不同均质压力下肌原纤维蛋白与氨基葡萄糖的接枝度；
图2为实施例1与对比例1-3抗亚油酸氧化能力的对比数据；
图3为实施例1与对比例1-3ABTS自由基清除能力的对比数据。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附表及附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1)将鲟鱼肌原纤维蛋白溶于0.6mol/L磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为30mg/mL；
2)将1)所得蛋白溶液经过高速剪切预处理后，剪切速率为8000rpm，时间为1分钟，再进行二次高压均质处理，均质压力为500bar；
3)向2)所得的蛋白溶液中加入氨基葡萄糖，蛋白与糖基供体的摩尔比为1:2，在37℃环境下反应8小时；
4)将3)所得溶液进行透析，透析液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，透析时间为24小时，去除多余氨基葡萄糖；
5)将4)所得去除氨基葡萄糖的溶液进行真空冷冻干燥，得到目标接枝改性蛋白-糖耦联复合物。
对比例1
1)将鲟鱼肌原纤维蛋白溶于0.6mol/L磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为30mg/mL；
2)将1)所得的蛋白溶液在37℃环境下反应8小时；
3)将2)所得溶液进行透析，透析液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，透析时间为24小时；
4)将3)所得溶液进行真空冷冻干燥，得到对比例1产物。
对比例2
1)将鲟鱼肌原纤维蛋白溶于0.6mol/L磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为30mg/mL；
2)将1)所得蛋白溶液经过高速剪切预处理后，剪切速率为8000rpm，时间为1分钟，再进行二次高压均质处理，均质压力为500bar；
3)将2)所得的蛋白溶液在37℃环境下反应8小时；
4)将3)所得溶液进行透析，透析液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，透析时间为24小时；
5)将4)所得溶液进行真空冷冻干燥，得到对比例2产品。
对比例3
1)将鲟鱼肌原纤维蛋白溶于0.6mol/L磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为30mg/mL；
2)向1)所得的蛋白溶液中加入氨基葡萄糖，在37℃环境下反应8小时；
3)将2)所得溶液进行透析，透析液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，透析时间为24小时，去除多余氨基葡萄糖；
4)将3)所得去除氨基葡萄糖的溶液进行真空冷冻干燥，得到对比例3产物。
对比例1与实施例1的方法相比，不同之处在于没有高压均质及糖基化处理。
对比例2与实施例1的方法相比，不同之处在于没有糖基化处理。
对比例3与实施例1的方法相比，不同之处在于没有高压均质处理。
表1为不同改性方式对肌原纤维蛋白二级结构含量的影响。实施例1与对比例1-3二级结构的对比数据见表1。
表1
通过表1中的数据对比可以发现，本发明使用高压均质和糖基化复合改性肌原纤维蛋白，可显著提高改性蛋白的α-螺旋的含量占比，降低β-折叠含量占比，表明蛋白主链被打开，有更多的氨基酸基团暴露，从而增加了糖基化位点，提高了蛋白糖基化程度。
表2为不同改性方式对肌原纤维蛋白在低离子强度介质中溶解度的影响。实施例1与对比例1-3在低离子强度介质中的溶解度对比数据见表2。
表2
通过表2中的数据对比可以发现，本发明使用的高压均质和糖基化复合改性技术可显著提高肌原纤维蛋白在低离子强度介质中的溶解度，较单一使用高压均质或者糖基化技术效果更为明显，表明复合改性对于提升盐溶性动物蛋白在低离子强度溶剂中的溶解度有较好的结果。
表3为不同改性方式对肌原纤维蛋白与氨基葡萄糖接枝度的影响。实施例1与对比例1-3接枝度的对比数据见表3。
表3
通过表3中的数据对比可以发现，本发明使用的高压均质和糖基化复合改性技术可显著提高肌原纤维蛋白与氨基葡萄糖的接枝度，较单一使用糖基化技术效果更为明显，表明复合改性对于提高肌原纤维蛋白改性程度有较好的影响。
不同均质压力下肌原纤维蛋白与氨基葡萄糖的接枝度见图1。从图1中可以看出，肌原纤维蛋白与氨基葡萄糖的接枝度随均质压力的增大呈现先增大后减小的趋势，并在500bar时处于最大值，表明并非均质压力越大，接枝度越高，其可能的原因是，在均质压力为300～500bar时，均质压力增大有助于蛋白展开，暴露出更多糖基化位点，因此接枝度上升；当均质压力超过500bar时，高压均质会使蛋白破裂，糖基化位点遭到破坏，因此接枝度下降。经反复实验证明，均质压力为500bar时能够最大程度提升肌原纤维蛋白和氨基葡萄糖的接枝度，对改性效果有明显的增益性。
实施例1与对比例1-3抗亚油酸氧化能力的对比数据见图2。通过图2对比数据可以发现，本发明使用的高压均质和糖基化复合改性技术可显著提升实施例1产物的抗亚油酸氧化能力。对比例2及对比例3的抗亚油酸氧化能力要低于对比例1，可能是因为加工过程中蛋白质已经发生了部分氧化，因此降低了抗氧化活性。
实施例1与对比例1-3ABTS自由基清除能力的对比数据见图3。通过图3对比数据可以发现，对比例2的ABTS自由基清除能力要低于对比例1，因此高压均质会降低肌原纤维蛋白的自由基清除能力；但是对比例3对于ABTS自由基的清除能力要强于对比例1，因此糖基化可提高肌原纤维蛋白的自由基清除能力；实施例1对于ABTS自由基的清除能力是最强的，因此本发明使用的高压均质和糖基化复合改性技术可显著提升肌原纤维蛋白对ABTS自由基的清除能力，这是单一改性方法实现不了的，因此本方法具有实质性的增益效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方法，但其仅作为范例，本发明并不限于以上描述的具体实施例。任何未违背本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。