阅读说明：本技术 辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶及其制备方法和应用 (Octenylsuccinic anhydride modified gelatin and preparation method and application thereof ) 是由 钟建 张婷 丁梦真 陶丽娜 王锡昌 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药食品添加剂领域,公开了一种辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶。制备方法包括以下步骤：(1)明胶溶液pH调至8～9,搅拌条件下加入辛烯基琥珀酸酐反应2～6h；辛烯基琥珀酸酐与明胶的质量比为0.02～0.25：1；(2)将溶液pH调至6～7；通过透析去除MW8000-14000Da的部分。将辛烯基琥珀酸酐与明胶溶液混合。修饰的明胶可应用于制备乳化剂,将这种乳化剂应用于制备乳液,可以显著降低乳析指数和用于提高液滴稳定性,在食品、医药等领域有着广阔的应用前景。(The invention relates to the field of medical food additives, and discloses octenyl succinic anhydride modified gelatin. The preparation method comprises the following steps: (1) adjusting the pH value of the gelatin solution to 8-9, adding octenyl succinic anhydride under the stirring condition, and reacting for 2-6 h; the mass ratio of the octenyl succinic anhydride to the gelatin is 0.02-0.25: 1; (2) adjusting the pH value of the solution to 6-7; fractions of MW8000-14000Da were removed by dialysis. Octenyl succinic anhydride is mixed with a gelatin solution. The modified gelatin can be applied to the preparation of an emulsifier, and the emulsifier is applied to the preparation of emulsion, can obviously reduce the elutriation index and improve the stability of liquid drops, and has wide application prospect in the fields of food, medicine and the like.)

辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药食品添加剂领域，具体为乳化剂，尤其是辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶作为乳化剂。

背景技术

鱼油对人体有许多重要的生理和健康功能，并且鱼油是脂溶性物质的良好载体。但是鱼油具有鱼腥味、水溶性差并且易受到环境因素(pH、光照、加热、等)的影响而被氧化。载鱼油乳液对于降低鱼油在应用上的限制有极大潜力，在近20年以来引起了极大的关注。

哺乳动物和水生明胶因其具有优良的可食性、生物相容性和可降解性，已被用作o/w型乳液的乳化剂。牛皮明胶和鱼明胶作为乳化剂，已被用于稳定葵花籽油和玉米油。由于哺乳动物类疾病和宗教因素，限制了哺乳动物明胶的广泛应用。鱼明胶被认为是哺乳动物明胶的替代品。然而，与哺乳动物明胶相比鱼明胶具有较低的凝胶性和流变学特性，限制了其广泛应用。因此，有必要探索适合食品行业发展需求的鱼明胶的修饰方法。

物理共混和化学修饰是提高明胶特性的两种主要修饰方法。牛骨明胶与表面活性剂共混作为乳化剂的用于稳定鱼油已有研究。此外，在Pickering乳液的制备中，明胶也被制备成交联明胶颗粒、明胶/壳聚糖复合物或明胶/葡甘聚糖/鞣酸纳米复合物用于包封葵花油、鱼油、玉米油或中链三酰甘油油。漆酶在制备鱼皮明胶-果胶的多层乳液时用于交联果胶分子，提高了乳液的pH稳定性。多种化学修饰方法已被用于修饰鱼皮明胶，如酶法修饰、磷酸化修饰、醛类修饰和酚类修饰。其中，磷酸化修饰可以提高鱼皮明胶乳液的稳定性。因此，探究其他化学修饰方法在乳液领域中的应用是十分有必要的。

琥珀酸酐修饰已被应用于修饰蛋白质，如大豆分离蛋白、婴儿浓缩蛋白、扁豆浓缩蛋白和巴西坚果仁球蛋白。这些结果表明琥珀酰化蛋白的乳化特性取决于蛋白质浓度、pH和琥珀酰化程度。但琥珀酸酐在2017年被世界卫生组织国际癌症研究所列为3类致癌物，限制了琥珀酸酐在食品中的应用。辛烯基琥珀酸酐(OSA)修饰被用于修饰淀粉，OSA上的羧基与淀粉上的羟基发生酯化反应，淀粉是多形态颗粒，OSA-淀粉也是颗粒状。与琥珀酸酐相比，OSA由于存在辛烯基，羧基与明胶上反应活性较强的氨基酸上的氨基发生酰化反应，对修饰后的蛋白产生不同的结构效应。因此，还没有通过OSA修饰蛋白质作为乳化剂用于稳定乳液。

发明内容

本发明旨在提供一种辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶。

本发明还提供了上述辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶的制备方法及应用。

本发明提供了含有上述辛烯基琥珀酸酐修饰明胶的乳液。

技术方案为：一种辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶，其特征在于，琥珀酰化度为29％～100％。优选的，琥珀酰化度为65％～99％。

所述的明胶为哺乳动物明胶或水产明胶。

优选的，哺乳动物明胶主要来源于猪、牛、鸡、兔等等，提取部位为骨、软骨、皮肤、腱、韧等等***；水产明胶主要来源于鱼、海参、刺参、海星、海蜇等等，鱼明胶可分为温水鱼明胶(如罗非鱼、草鱼、鮰鱼、鲢鱼、鲶鱼、金枪鱼、鱿鱼等等)和冷水鱼明胶(如黑线鳕鱼、绿鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼、鲟鱼、鲑鱼等等)，提取部位为鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼鳍、鱼鳔、鱼头等等，海参、刺参、海蜇和海星等提取部位主要为体壁。

优选的，哺乳动物明胶为牛骨明胶(BBG)，水产明胶为冷水鱼皮明胶(CFG)，提取自黑线鳕鱼、绿鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼、鲟鱼或鲑鱼的鱼皮。

所述辛烯基琥珀酰(OSA)修饰的明胶制备方法包括以下步骤：

(1)明胶溶液pH调至8～9，搅拌条件下加入辛烯基琥珀酸酐反应2～6h；

辛烯基琥珀酸酐与明胶的质量比为0.02～0.25：1；

(2)将溶液pH调至6～7；通过透析去除MW 8000-14000Da的部分。

优选的，将步骤(2)产物冷冻干燥。

优选的，步骤(1)，明胶溶液的pH＝8.5。

优选的，步骤(2)中，将溶液pH调至6.5。

步骤(1)明胶溶液的浓度为10～30g/L，优选为15～25g/L，更优选为15～20g/L。

步骤(1)的反应在0～40℃下进行，优选为20～35℃。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(1)明胶溶液的浓度为18g/L。

所述辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶应用于制备乳化剂，以及应用于制备乳液，尤其是Pickering乳液。

作为乳化剂用于降低乳析指数时，辛烯基琥珀酸酐修饰的牛骨明胶(OSA-BBG)的琥珀酰化度为29％～76％；用于提高液滴稳定性时，辛烯基琥珀酸酐修饰的牛骨明胶的琥珀酰化度为90％～99％。用于提高液滴稳定性时，优选的，辛烯基琥珀酸酐修饰的冷水鱼皮明胶(OSA-CFG)的琥珀酰化度为70％～99％，更优选为88％～95％。

制备琥珀酰化度为29％～76％的OSA-BBG时，辛烯基琥珀酸酐与牛骨明胶质量比为0.02～0.1；制备琥珀酰化度为90％～100％的OSA-BBG时，辛烯基琥珀酸酐与牛骨明胶质量比为0.16～0.25。

辛烯基琥珀酸酐修饰的冷水鱼皮明胶的琥珀酰化度为70％～99％，制备时，辛烯基琥珀酸酐与冷水鱼皮明胶的质量比为0.1～0.25。

一种载油乳液，其特征在于，以上述辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶作为乳化剂，以水相和油相的总体积计，辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶含量为3～9g/L，优选为6～8g/L，更优选为6～7g/L。

所述的油为动物油脂或植物油。所述的动物油脂为鱼油。

所述的载油乳液中还含有脂溶性药物或脂溶性营养物质。

上述载油乳液的制备方法，将辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液pH调至8.5～10，按照1：1.5～3的体积比将油或者含有脂溶性药物或营养物质的油与辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液混合，并均质。辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液浓度为5～12g/L。

优选的，辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液浓度为10g/L。

优选的，将辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液pH调至9，按照1：2的体积比将油或者含有脂溶性药物或营养物质的油与辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶溶液混合，并均质。

均质条件为8000～15000rpm，优选为10000～12000rpm。

本发明制备和表征了OSA修饰的BBGs(OSA-BBGs)和OSA修饰的CFGs(OSA-CFGs)，并将其用于稳定的载油乳液，结果表明OSA修饰的明胶可以影响载油乳液的稳定性。

OSA可以成功地用于修饰明胶并改变明胶的等电点。同时，在化学修饰过程中琥珀酰化程度和OSA与明胶质量比成对数增加关系。此外，OSA修饰对对载鱼油乳液的初始液滴粒径无显著性影响，这暗示了OSA修饰没有改变明胶的特性。

乳液储藏实验表明OSA修饰的牛骨明胶所制备的乳液随着琥珀酰化度的增加，液滴稳定性增加、相转变时间增加、乳析指数降低，但OSA修饰的鱼皮明胶所制备乳液随着琥珀酰化度的增加仅有液滴稳定性增加，相转变时间和乳析指数均无明显变化。琥珀酰化度增加可能提高了乳液的液滴稳定性。进一步，随着琥珀酰化度增加OSA-BBGs稳定乳液的相转变时间和乳析指数增加，但OSA-CFGs稳定乳液的这两种性质没有受到明显影响。

因此，用辛烯基琥珀酸酐修饰的明胶可以明显提高乳液的稳定性。其中，辛烯基琥珀酸酐修饰的牛骨明胶OSA-BBG乳析稳定性更好，可用作饮料、乳制品等食品乳化剂，辛烯基琥珀酸酐修饰的冷水鱼皮明胶OSA-CFG的液滴稳定性更好，可作为包封功能性成分乳液的乳化剂。

本发明提供了一种有效蛋白质的分子修饰方法，所获得的修饰明胶乳化剂能够有效提高乳液稳定性，可优化载油乳液尤其是载鱼油乳液，在食品、医药等领域有着广阔的应用前景；同时，对理解蛋白质分子修饰、蛋白质分子结构和蛋白质功能之间的关系提供了有用的信息。这也将为优化载鱼油乳液的制备和其在食品和医药领域的应用提供一条潜在的途径。

附图说明

图1为实施例1不同OSA：明胶质量比下制备得到的OSA修饰明胶的表征；A-F分别为新制备的OSA-BBGs溶液、冻干的OSA-BBGs、冻干的OSA-BBGs复溶溶液、新制备的OSA-CFGs溶液、冻干的OSA-CFGs、冻干的OSA-CFGs复溶溶液，玻璃瓶从左至右：0.02、0.05、0.10、016和0.21；G为不同OSA：明胶质量比下制备得到的OSA修饰明胶的琥珀酰化度；H-K为OSA修饰明胶在不同pH条件下的浊度测量数码相机图(每张图中的玻璃瓶从左至右pH为：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5)，H-I为OSA：明胶质量比0.05和0.16的OSA-BBGs；J-K为OSA：明胶质量比0.05和0.16的OSA-CFG。

图2为未修饰明胶(即0.00)和不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰明胶稳定的乳液在制备初期的数码相机图和光学显微镜图；标尺为50μm。

图3为未修饰明胶(即0.00)和不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰明胶稳定乳液在制备初期的CLSM图。鱼油用尼罗红染色；标尺为25μm。

图4为OSA-BBGs稳定的乳液(A)和OSA-CFGs稳定的(B)乳液最有可能的粒径分布，0.00表示乳液由未修饰明胶稳定。

图5为OSA-BBGs稳定的载鱼油乳液在制备初期时具有代表性的液滴粒径分布。A：未修饰BBG稳定的乳液。B-F：不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备的OSA修饰BBGs稳定的载鱼油乳液；峰值1、峰值2、峰值3为高斯拟合线。

图6为OSA-CFGs稳定的载鱼油乳液在制备初期时具有代表性的液滴粒径分布。A：未修饰BBG稳定的乳液。B-F：不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备的OSA修饰BBGs稳定的载鱼油乳液；峰值1、峰值2、峰值3为高斯拟合线。

图7为未修饰明胶(即0.00)和不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰BBG稳定的乳液在4℃储藏过程中的数码相机图和光学显微镜图。黑色箭头表示乳液乳析值>7.0％时的乳析层，黑星表示乳液凝胶；标尺为50μm。

图8为未修饰明胶(即0.00)和不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰CFG稳定乳液在4℃储藏过程中的数码相机图和光学显微镜图。黑色箭头表示乳液乳析值>7.0％时的乳析层，白星表示糖浆状乳液；标尺为50μm。

图9为未修饰明胶(即0.00)和不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰BBG稳定的乳液在4℃下储藏3天和14天的数码相机图和光学显微镜图。黑色箭头表示乳液乳析值>7.0％时的乳析层，黑星表示乳液凝胶；标尺为50μm。

图10为未修饰明胶(即0.00)和OSA不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA修饰CFG稳定乳液在4℃下储藏3天和14天的数码相机图和光学显微镜图。黑色箭头表示乳液乳析值>7.0％时的乳析层；标尺为50μm。

图11为不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、016和0.21)下制备得到的OSA-BBGs(A)和OSA-CFGs(B)稳定的载鱼油乳液在4℃储藏过程中的乳析指数；0.00表示未修饰明胶稳定的乳液。

图12为OSA修饰明胶及其在载鱼油乳液应用的机理示意图，(A)：OSA和明胶的琥珀酰化反应；(B)：未修饰和OSA修饰明胶的分子结构，显示琥珀酰化度随着OSA：明胶质量比增加呈对数级增加，随着琥珀酰化度增加明胶分子体积增加，OSA-CFGs比OSA-BBGs在分子表面-核上有更高的OSA基团比；(C)：未修饰和OSA修饰明胶稳定的乳液液滴，OSA-CFGs稳定的乳液液滴比OSA-BBGs稳定的乳液液滴有更高的负电荷量和更大的抗液滴聚结能力，琥珀酰化度对初始乳液液滴粒径没有明显的影响。

具体实施方式

材料：BBG(type B,～240g bloom)和CFG分别购买于阿拉丁生化科技有限公司(上海，中国)，sigma-Aldrich(上海，中国)；深海鱼油(食品级，DHA+EPA≥70％)购于西安千叶草生物科技有限公司(陕西，中国)并储藏于-18℃；OSA购买于上海源叶生物科技有限公司(上海，中国)；所有化学试剂均购买于国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)。

实施例1OSA-BBG和OSA-CFG的制备

(一)氨基酸含量测定

测定牛骨明胶(BBG)和冷水鱼皮明胶(CFG)的氨基酸含量，称取1.0g明胶粉末(BBG和CFG)放于30mL水解管中，立即加入10mL HCl(6mol/L)和0.15mL苯酚。样品放于4℃条件下冷藏5min。然后，将样品抽真空10min并于110℃的温度下水解22h。水解液用滤纸过滤，收集于50mL的容量瓶中并用超纯水定容至50mL。将真空干燥后的样品溶解于20mL柠檬酸钠缓冲液(66.6mM，pH 2.2)和超纯水的混合物中，体积比为1:19。样品和商业混合氨基酸标品(sigma-Aldrich，美国)使用L-8800型全自动氨基酸分析仪进行分析。每组样品平行测量3次，结果如表1。

表1.明胶的氨基酸质量百分数

结果显示，BBG和CFG的甲硫氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸含量有差异。

(二)辛烯基琥珀酸酐修饰

牛骨明胶(BBG)和冷水鱼皮明胶(CFG)在45℃，180rpm的条件下水浴溶解60min得到BBG和CFG溶液(1.8％,w/v)。用1M HCl和1M NaOH利用pH计将明胶溶液pH值调节为8.50。明胶溶液在35℃、300rpm的条件下进行磁力搅拌。OSA缓慢加入明胶溶液中，并使得OSA与明胶的质量比为0.02、0.05、0.10、0.16和0.21。然后，将溶液pH维持在8.50-9.00范围内。反应3h后将溶液pH调节为6.50以终止反应。反应的得到溶液用超纯水透析24小时(MW:8000-14000Da，国药集团化学试剂有限公司)，去除MW 8000-14000Da的部分，新制备的OSA-BBGs溶液和新制备的OSA-CFGs溶液分别如图1A和图1D所示。最后，将溶液进行真空冷冻干燥得到纯化的OSA-BBGs和OSA-CFGs，冻干的OSA-BBGs和冻干的OSA-CFGs结果分别如图1B和图1E所示。将冻干粉末用超纯水复溶得到1.0％(w/v)的溶液(1g/100mL)，结果分别如图1D和图1F所示，说明冻干粉在纯水中的溶解性好。

OSA修饰明胶溶液和固体样品在高OSA：明胶质量比条件下为粉红色，而在低OSA：明胶质量比条件下制备的溶液为透明，固体为白色。茚三酮比色法测定琥珀酰化程度结果显示，OSA修饰明胶的琥珀酰化程度随OSA：明胶质量比的增加呈对数增加趋势(图1G)。通过茚三酮比色法进行紫外测量，未修饰的BBG(1.21±0.01)的紫外吸收值高于未修饰的CFG(1.08±0.01)，这是由于BBG比CFG有着更高的赖氨酸质量分数(表1)。

OSA修饰明胶在OSA：明胶质量比为0.02、0.05、0.10、0.16和0.21的反应条件下制备得到(图1)。OSA修饰明胶得到的溶液(图1A、1D)经冷冻干燥得到固体样品(图1B、1E)，这些固体样品可用超纯水复溶得到1.0％(w/v)的溶液(图1C、1F)。明胶和OSA的琥珀酰化反应如图12A所示。

(三)琥珀酰化度测定

琥珀酰化度的测定方法参考现有的方法并稍加修改。简而言之，茚三酮溶液由0.5g水合茚三酮、10.0g十二水合磷酸氢二钠、6.0g磷酸二氢钾和0.3g D-果糖(上海麦克林生化科技有限公司)溶解于50mL超纯水中，并用超纯水定容至100mL得到。2mL茚三酮溶液加入到2mL 1mg/mL的OSA修饰明胶溶液中。混合溶液煮沸15min，然后立即放于4℃水中冷却。冷却后加入6mL乙醇溶液(50％，v/v)。用紫外分光光度计(新世纪T 6，北京普析通用仪器有限公司，中国)在570nm处测定溶液的吸光度，并用未修饰的明胶作为对照。每组样品平行测量3次。并按下式进行琥珀酰化度(DS)计算：

其中，A₀和A₁分别为未修饰明胶的吸光度和OSA修饰的明胶吸光度值。

不同OSA：明胶质量比下制备得到的OSA修饰明胶的琥珀酰化度结果如图1G和表2所示。数据采用对数方程进行拟合，OAS-BBG的拟合方程：y＝143.79+30.73*ln(x+0.01)；OAS-CFG的拟合方程：y＝143.29+32.01*ln(x+0.01)。

表2

同样的OSA-明胶质量比时，OSA-CFG琥珀酰化度略低于OSA-BBG。

(四)OSA修饰明胶浊度测定

参考已有的方法进行OSA修饰明胶的浊度分析。简而言之，将5％(w/v)的明胶溶液的pH调节为不同的pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)，然后立即用数码相机观察和捕获溶液。结果如图1H-K所示，每张图中的玻璃瓶从左至右pH为：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5。H和I分别为OSA：明胶质量比0.05和0.16的OSA-BBGs浊度测量结果，J和K分别为OSA：明胶质量比0.05和0.16的OSA-CFGs浊度测量结果。

为了分析琥珀酰化程度对OSA修饰明胶等电点的影响测量了两种OSA修饰明胶的浊度。结果表明，当OSA：明胶质量比为0.05时，OSA-BBG在pH 3.5-4.5变浑浊(图1H)，OSA-CFG在pH 4.0-4.5变浑浊(图1J)。当OSA：明胶质量比为0.16时，在pH 3.0-5.0变浑浊并且pH3.0-4.5时的浊度显著性地高于pH 5.0(图1I、1K)。同时，OSA-BBGs与OSA-CFGs相比浑浊更为明显。

结论：OSA修饰对明胶结构的影响

琥珀酰化是一种分子修饰方法。OSA主要与赖氨酸的ε-氨基反应，其次与蛋白质中的N-末端氨基酸反应，通过N-酰化将其从带正电荷的残基转化为带负电荷的残基。本实验中，BBG和CFG都经不同OSA：明胶质量比(0.02、0.05、0.10、0.16和0.21)和OSA发生琥珀酰化反应(图1A-1F)。明胶和OSA的琥珀酰化反应如图12A所示。

结果显示，明胶的琥珀酰化程度随着OSA：明胶质量比增加呈对数增长(图1G)。BBG比CFG的赖氨酸质量百分比更高(表1)，琥珀酰化使分子内的静电斥力显著增强，可能引起构象改变和分解如分子体积增大。随着OSA：明胶质量比增加，琥珀酰化程度增加(图1G)，因此，明胶分子体积可能增大。考虑到BBG在pH 5.0时变浑浊以及CFG在任何pH范围内均为明显浑浊，OSA修饰明显地改变了BBG和CFG的等电点(图1H-1K)，这可能是因为赖氨酸的正电荷转变为OSA的负电荷。最后，考虑到BBG的分子量明显比CFG分子量高，OSA修饰明胶的分子结构如图12B所示。

实施例2制备OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液

溶解得到未修饰和实施例1制备的不同琥珀酰化度OSA修饰的明胶溶液(1.0％，w/v)，并将溶液的pH调节为9.0。按照1：2的体积比将鱼油加入到明胶溶液中。然后用

均质机进行均质，均质速度和时间分别为11500rpm和1min。所得乳液储藏于4℃。乳液用数码相机、光学显微镜和激光共聚焦光学显微镜扫描显微镜(CLSM)观察。

(一)检测方法

1.光学显微镜观察

取3μL液体乳液样品滴加于载玻片上，用盖玻片盖住，并用倒置光学显微镜(MS600F，上海明兹精密仪器有限公司，中国)观察。切约3mg乳液凝胶样品放于载玻片上，用盖玻片盖住，并用立式光学显微镜(ML8000，上海明兹精密仪器有限公司，中国)观察。倒置光学显微镜和立式光学显微镜的物镜分别为50×和60×。液滴粒径采用高斯拟合进行统计学分析。

2.乳析指数测定

在指定时间点(0h,3h,3d,7d,14d,21d,and 28d)测量储藏于4℃乳液的乳析层高度(H_s)和乳液总高度(H_t)。乳析指数按下式进行计算：

3.CLSM观察

制备初期的液体样品参考本实验室之前工作进行激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察。简而言之，取40μL尼罗红的1,2-丙二醇溶液(0.1％，生工生物工程(上海)有限公司，中国)加入到1mL液体乳液中。5min后取3μL混合样品滴加到载玻片上，盖上盖玻片，并用激光共聚焦扫描显微镜(TCS SP8型；徕卡，韦茨拉尔，德国)观察。在552nm波长下激发尼罗红(鱼油)，使用63×油镜进行观察。扫描频率为100Hz，扫描密度为1024×1024。

4.液滴的高斯拟合

参考本实验室以前的工作进行液滴粒径的高斯拟合，用MeizsMcs 6.0软件(上海明兹精密仪器有限公司，中国)测量三个不同的批次图像中大约400-750个液滴的尺寸。液滴粒径通过频率分布进行统计学分析。柱数为25-30个。最后，采用多峰高斯拟合分析了液滴尺寸可能的多峰分布。结果如图所示。

数据分析：以上数据以三次平行实验的平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行统计学比较。p值<0.05被认为是有显著差异。

(二)结果

1.OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液在制备初期时的表征

当乳液pH接近明胶的等电点时明胶倾向于聚结。一般来说，强碱性食物并不常见，世界上只存在一些弱碱性食物，如pH值为9.5的水。根据OSA修饰明胶的等电点(图1H-1K)和本实验室以前的工作，在pH 9.0时采用均质法制备OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液。制备初期的乳液呈现乳白色并且主要由微米级的液滴组成(图2)。CLSM实验结果显示鱼油存在于液滴中(图3)。有代表性液滴粒径分布显示液滴粒径呈三峰粒径分布并且三个峰值的频率没有显著性差异(图4-6)，这表明OSA：明胶质量比和琥珀酰化程度对初始液滴粒径没有显著性影响。OSA-BBGs稳定乳液的峰值3(最大峰值)比OSA-CFGs稳定乳液的峰值3(最大峰值)更低，而峰值1和峰值2数值相似(图4)。

2.OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液的储藏稳定性

观察储藏在4℃下OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液的乳析稳定性和液滴稳定性用以分析液体—凝胶相转变行为，液滴聚结行为和乳析指数值变化(图7-11)。对于OSA-BBGs稳定的乳液，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化程度增加液体—凝胶相转移时间增加(图7：数码相机图；质量比0.00-0.05时为3天；质量比0.10时为7天；质量比0.16和0.21时为21天)，液滴聚结减缓(图7：光学显微镜图像)，乳析指数值增加(图11A)。所有OSA-CFG稳定的乳液储藏至28天时均变为糖浆状(图8：数码相机图像)且有相似的乳析指数值变化(图11B)。因此，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化程度增加对于OSA-CFG稳定乳液的这些性质没有显著性影响。然而，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化程度增加OSA-CFG稳定乳液的液滴聚结变慢(图8：光学显微镜图)。

(三)分析和讨论

1.OSA修饰对初始液滴粒径的影响

所有未修饰和OSA修饰明胶制备的乳液液滴均呈现三峰粒径分布(相似的频率)并且OSA：明胶质量比对于初始液滴粒径无明显的影响(图2，4，5，6)。均质法制备的乳液的初始粒径取决于乳化剂的性质、输入的能量、分散相浓度、温度和乳液的黏度。对于这些制备初期的载鱼油乳液只有乳化剂(明胶和OSA修饰明胶)不同。因此，对于乳液液滴形成而言OSA修饰没有改变明胶的特性，这个可能是因为明胶的赖氨酸质量百分比低(BBG为4.36％±0.02％，CFG为4.02％±0.01％)，如表1所示。

2.OSA修饰对液滴聚结的影响

当液滴间的引力大于斥力时液滴发生聚结。在典型的液滴聚结过程中，两个或多个液滴靠近，油滴周围的界面层发生破裂，液滴融合在一起形成一个更大的液滴。本实验中，随着OSA：明胶质量比的增加，琥珀酰化程度增加(图1G)，明胶壳层的负电荷量增加。因此，液滴间的斥力增加。这样一来，液滴聚结情况降低(图7-10)。这就意味着，随着OSA：明胶质量比增加液滴稳定性增加。CFG的分子量更低，所以OSA-CFGs比OSA-BBGs有更高的表面积-体积比。因此，虽然OSA-CFGs的琥珀酰化度比OSA-BBGs更低，但OSA-CFGs比OSA-BBGs在分子表面-核上有更高的OSA基团比。正因如此，OSA-CFGs比OSA-BBGs表现出更高的抗液滴聚结能力(图7-10)，这与本实验中未改性BBG稳定的乳液和未改性CFG稳定的乳液(图7-8)以及本实验室之前的工作中的比较一致。根据以上分析，OSA-CFGs比OSA-BBGs具有更好的液滴稳定性且液滴稳定性随明胶的琥珀酰化程度增加而增加。

3.OSA修饰对乳液液体—凝胶转变的影响

根据乳液的状态，乳液可以分为液体状和凝胶状。乳液凝胶同时存有乳液和凝胶。乳液凝胶可以分为乳液填充的但比之凝胶(连续相是凝固的)和蛋白质稳定的乳液凝胶(乳液液滴是聚集的)。本实验室前期的CLSM结果表明BBG和CFG主要存在于液滴的壳层中并且几乎没有游离的明胶存在于连续水相中。因此，本实验中由明胶和OSA修饰明胶稳定的乳液凝胶可能是蛋白质稳定的乳液凝胶，这可能是乳液液滴聚集产生的。

对于在pH 9.0条件下制备的OSA-BBG稳定的乳液，随着OSA：明胶质量比增加，琥珀酰化度增加(图1G)，壳层的负电荷量增加且液滴间的斥力增加。因此，随着OSA：明胶质量比增加，OSA-BBG稳定的乳液液滴聚集行为降低且液体—凝胶转变时间增加(图7，10)。对于在pH 9.0条件下制备的OSA-BBG稳定的乳液，液体—凝胶转变几乎没有发生仅转变成了糖浆状的乳液(图8)，这进一步确证了OSA-CFGs比OSA-BBGs在分子表面-核上有更高的带负电荷的OSA基团比。基于这些推测，OSA修饰明胶的分子结构如图12B所示。

5.OSA修饰明胶对乳析稳定性的影响

乳液中单个独立液滴的移动速度可以用Stokes方程表述：

其中，负号表示液滴的移动方向，g为重力加速度,r为液滴半径,ρ为密度,η为剪切粘度，下标1和2分别指的是连续相和分散相(液滴)。

分散相密度(ρ₂)可用以下方程表述：

其中，r为初始液滴半径,ρ_core为核层油密度，ρ_shell为界面壳层密度，δ为界面壳层厚度。

对于微米级液滴，界面壳层厚度(δ，纳米级)明显地低于初始液滴半径(r，微米级)。等式(5)可以近似的表述为下述方程：

本发明中，OSA修饰明胶稳定的乳液的乳析指数值随在4℃下储藏时间增加而增加(图11)。此外，OSA-BBG稳定的乳液比OSA-CFG稳定的乳液的乳析指数值更低(图11)，这与本实验室以前工作中对未修饰BBG稳定乳液和未修饰CFG稳定乳液的比较结果一致。

BBG和OSA-BBGs稳定的乳液有相似的初始液滴半径(r，图2、4、5)，壳层鱼油密度(ρ_core,901kg/m³)，连续相的剪切粘度(η₁)和连续水相密度(ρ₁)。BBG界面层密度通常为1350kg/m³。OSA-BBGs稳定的乳液随着分子构象变化和解离的增加界面壳层密度(ρ_shell)降低和界面壳层厚度(δ)增加(图12B)。根据等式(5)，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化度增加，OSA-BBG稳定的乳液分散相密度(ρ₂)降低。此外，相比较于BBG界面层密度，分散相密度(ρ₂)在低OSA：明胶质量比(0.02，0.05，0.10)时有轻微增加，在高OSA：明胶质量比(0.16，0.21)时有所降低。根据等式(3)，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化度增加，最终的乳析速度值增加，并且BBG稳定的乳液在低OSA：明胶质量比(0.02，0.05，0.10)和高OSA：明胶质量比(0.16，0.21)之间有中等速率乳析速度值。因此，随着OSA：明胶质量比增加，BBG稳定乳液的最终乳析指数增加，并且BBG稳定的乳液在低OSA：明胶质量比(0.02，0.05，0.10)和高OSA：明胶质量比(0.16，0.21)之间有中等最终乳析指数，如表3和图11A所示。

类似于OSA-BBGs，根据等式(3-5)，随着OSA：明胶质量比和琥珀酰化度增加OSA-CFGs稳定乳液的最终乳析速率值增加。考虑到OSA-CFGs比OSA-BBGs在分子表面-核上有更高的OS基团比(图12B)，OSA-CFGs稳定的乳液有更高的负电荷量和液滴抗聚结能力(图12C)，这可能消除了乳析速率对OSA-CFGs稳定乳液的乳析的影响。因此，所有CFG和OSA-CFGs稳定的乳液均有相似的乳析指数变化，如图11B所示。

表3.OSA-BBG和OSA-CFG在4℃下储藏不同天数时的乳析指数(％)

5.结论

OSA修饰的表征表明，在化学反应过程中明胶的琥珀酰化度和OSA：明胶质量比增加呈对数增加。对OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液的表征表明琥珀酰化程度对初始乳液液滴没有明显的影响，这暗示了OSA修饰没有改变明胶的特性。琥珀酰化度增加可能提高了乳液的液滴稳定性。进一步，随着琥珀酰化度增加OSA-BBGs稳定乳液的相转变时间和乳析指数增加，但OSA-CFGs稳定乳液的这两种性质没有受到明显影响。本研究提供了一种有效的分子修饰方法用于修饰明胶并为了解分子修饰对OSA修饰蛋白功能特性的影响提供了有用的信息。OSA修饰明胶稳定的载鱼油乳液在食品、医药等领域有着广阔的应用前景。