一种电化学生物传感器的制备方法及其在大肠杆菌检测中的应用
阅读说明：本技术 一种电化学生物传感器的制备方法及其在大肠杆菌检测中的应用 (Preparation method of electrochemical biosensor and application of electrochemical biosensor in escherichia coli detection ) 是由 黄启同 林小凤 杨民 曾卫佳 梅艳秋 何晨 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种电化学生物传感器的制备方法及其在大肠杆菌检测中的应用。在玻碳电极表面滴入CDs-Fe-(3)O-(4)纳米复合材料,制备CDs-Fe-(3)O-(4)/GCE工作电极,激活电极后再浸泡在探针DNA中,得到DNA/CDs-Fe-(3)O-(4)/GCE探针电极,将探针电极浸入不同浓度的E.coli O157:H7溶液中,水浴反应得到大肠杆菌O157:H7-DNA/CDs-Fe-(3)O-(4)/GCE。本发明构建了一种基于CDs-Fe-(3)O-(4)复合纳米材料的灵敏电化学生物传感器,该电化学生物传感器对于E.coli O157:H7的测定具有良好的线性和检测限。此外,该生物传感器还成功应用于牛奶中E.coli O157:H7的测定,表明电化学生物传感器具有广阔的应用前景。(The invention discloses a preparation method of an electrochemical biosensor and application of the electrochemical biosensor in escherichia coli detection. Dripping CDs-Fe on the surface of glassy carbon electrode 3 O 4 Nanocomposite, preparation of CDs-Fe 3 O 4 Activating the working electrode of the/GCE electrode, and then soaking the working electrode in the probe DNA to obtain DNA/CDs-Fe 3 O 4 A GCE probe electrode, the probe electrode being immersed in different concentrations E.coli The Escherichia coli O157H 7-DNA/CDs-Fe is obtained by water bath reaction in O157H 7 solution 3 O 4 (ii)/GCE. The invention constructs a method based on CDs-Fe 3 O 4 Sensitive electrochemical biosensor of composite nanomaterial, the electrochemical biosensor is to E.coli The measurement of O157: H7 has good linearity and detection limit. In addition, the biosensor is successfully applied to milk E.coli Measurement of O157H 7, indicating electrochemical biographyThe sensor has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于电化学发光传感器领域，具体涉及一种电化学生物传感器的制备方法及其在大肠杆菌O157:H7检测中的应用。
背景技术
近年来，食源性致病菌引起的食物中毒在世界范围内频繁发生，是世界上最突出的公共卫生问题。作为危害最大的食源性致病菌之一，大肠杆菌(E.coli)O157:H7可引起出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合征等疾病。更重要的是，低剂量的E.coli O157:H7便可让人生病，严重的甚至会导致肾功能衰竭和死亡。目前，全球每年有超过200万种急性食源性疾病归因于E.coli O157:H7。因此，灵敏检测食品中的E.coli O157:H7尤为重要。目前，用于E.coli O157:H7的测定最常用的方法包括细菌培养计数法、酶联免疫吸附法、聚合酶链反应等。尽管如此，上述方法在检测食源性病原体方面仍面临一些局限性，包括灵敏度低、预处理复杂和对环境影响大。因此，有必要开发一种灵敏、快速、简便、特异性强的E.coliO157:H7检测方法。与传统方法相比，电化学生物传感器具有灵敏度高、经济、准确等优点，因此其在E.coli O157:H7中的检测受到广泛关注。
众所周知，由于纳米材料优异的化学、物理和生物特性，它们已广泛应用于生物医学、分析科学、能源催化等领域。迄今为止，一些纳米材料已成功应用在构建用于E.coliO157:H7检测的电化学传感器，如石墨烯/AuNPs、还原氧化石墨烯/聚苯胺/[email protected]/中性红(rGO/PANI/[email protected]/Nr),rGO/[email protected],rGO-聚乙烯醇/金纳米复合材料(AuNPs/rGO-PVA)等。上述材料虽然对E.coli O157:H7检测的电化学传感器做出了一定的贡献，但仍存在制备复杂、经济性和环保性不足、传感器灵敏度低等缺点。因此，制备一种易于获得、性能优异、经济且环保的功能材料用于构建新型电化学传感器实现对E.coli O157:H7的检测具有重要意义。
作为“零维”碳纳米材料的一员，碳点(CDs)具有生物相容性好、合成简单、导电性好等优点，可作为理想的电极材料之一。Fe3O4具有良好的磁功能，可实现对复合材料的磁回收。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学传感器的制备方法及其在大肠杆菌O157:H7检测中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)合成CDs-Fe3O4纳米复合材料
3g的柠檬酸和1g的葡萄糖溶解在5毫升的水中，在微波功率为750-850W的条件下反应5-8分钟，然后用30mL水冷却稀释，11000-13000rpm转速下离心15-20min，之后透析不低于24小时，冷冻干燥即可得到CDs，将上述CDs固体溶于25mL水溶液中，得到CDs溶液；
取15mL CDs溶液，加入1g醋酸钠和1g氯化铁，所得混合溶液超声8-10小时，置于高压反应釜中，在200-220℃下反应24-25小时，溶液冷却后，11000-13000rpm转速下离心10-15min，得到CDs-Fe3O4纳米复合材料；
2)制备DNA/CDs-Fe3O4/GCE探针电极
在清洁玻碳电极(GCE)表面缓慢滴入5.0-5.5μL的CDs-Fe3O4纳米复合材料，室温干燥制备CDs-Fe3O4/GCE工作电极，将CDs-Fe3O4/GCE工作电极浸泡在0.8-1.2mL由0.1mM PBS、8.00mM EDC和8.00mM NHS组成的混合溶液中3-3.5h激活电极，然后用TE缓冲液冲洗，再将上述电极浸泡在0.8-1.2ml 0.1μM探针DNA中反应24-25h，用TE缓冲液冲洗制备DNA/CDs-Fe3O4/GCE探针电极，最后，将制备的电极保存在4℃环境；
3)生物传感器的制备
将制备的DNA/CDs-Fe3O4/GCE探针电极浸入不同浓度的E.coli O157:H7溶液中，在42℃水浴中反应35-40min，反应结束后，用TE缓冲液冲洗掉表面未特异性吸附的E.coliO157:H7，得到大肠杆菌O157:H7-DNA/CDs-Fe3O4/GCE。
本发明构建了一种基于CDs-Fe3O4复合纳米材料的灵敏电化学生物传感器，用于检测E.coli O157:H7。CDs作为碳纳米材料的一种，具有良好的导电性和大的比表面积，可以提高传感器的灵敏度，且CDs表面含有丰富的羧基，可用于固定探针DNA，CDs还可作为还原剂用于合成CDs-Fe3O4纳米材料。Fe3O4纳米材料可以提高电化学生物传感器的性能，由于其具有磁性，还可以实现对CDs-Fe3O4的回收。本发明制备的电化学生物传感器对E.coliO157:H7具有良好的特异性。在最佳条件下，该电化学生物传感器具有良好的DA检测性能，线性范围为10-108CFU/mL，检出限为6.88CFU/mL(3S/N)。此外，该电化学生物传感器成功应用于牛奶中E.coli O157:H7的检测，表明该电化学生物传感器具有良好的应用前景。
附图说明
图1是CDs(A,B)和CDs-Fe3O4纳米材料(C,D)的TEM和HRTEM图。
图2是不同电极在1.0mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl混合溶液中的CVs图，扫速为0.1V/s。
图3是浓度为10CFU/mL(A)和108CFU/mL(B)的E.coli O157:H7与DNA/CDs-Fe3O4/GCE的反应时间。
图4是105CFU/mL的不同细菌与DNA/CDs-Fe3O4/GCE反应的电流响应情况(A)以及105CFU/mL E.coli O157:H7与不同细菌共存时的电流响应情况(B)；其中a:none,b:E.coliO157:H7,c:金黄色葡萄球菌,d:沙门氏菌,e:乳酸葡萄球菌,f:李斯特菌。
图5是DNA/CDs-Fe3O4/GCE与不同浓度的E.coli O157:H7(a到i:0,10,102,103,104,105,106,107,108CFU/mL)作用后的DPVs图(A)，以及电流与浓度对数的线性关系(B)。
图6是DNA/CDs-Fe3O4/GCE测定E.coli O157:H7的重复性(A)和稳定性(B)。
具体实施方式
实施例1合成CDs-Fe3O4纳米复合材料
3g的柠檬酸和1g的葡萄糖溶解在5毫升的水中，在微波功率为800W的条件下反应5分钟。然后用30mL水冷却稀释，12000rpm转速下离心15min。之后透析24小时，冷冻干燥即可得到合成CDs，将上述CDs固体溶于25mL水溶液中。
取15mL CDs溶液，加入1g醋酸钠和1g氯化铁，将混合溶液超声8小时，置于高压反应釜中，在210℃下反应24小时。最后，溶液冷却后，12000rpm转速下离心10min，得到CDs-Fe3O4纳米复合材料。
实施例2电极的制备
1)在清洁玻碳电极(GCE)表面缓慢滴入5.0μL的CDs-Fe3O4纳米复合材料，室温干燥制备CDs-Fe3O4/GCE工作电极。2)将CDs-Fe3O4/GCE电极浸泡在1mL 0.1mM PBS、8.00mM EDC和8.00mM NHS混合溶液中3小时激活电极，然后用TE缓冲液冲洗。3)将上述电极浸泡在1ml0.1μM探针DNA中反应24h，用TE缓冲液冲洗制备DNA/CDs-Fe3O4/GCE探针电极。最后，将制备的电极保存在4℃。
实施例3生物传感器的制备
将制备的DNA/CDs-Fe3O4/GCE浸入不同浓度的E.coli O157:H7溶液中，在42℃水浴中反应40min。反应结束后，用TE缓冲液冲洗掉表面未特异性吸附的E.coli O157:H7，得到大肠杆菌O157:H7-DNA/CDs-Fe3O4/GCE。
实施例4
以[Fe(CN)6]3-/4-溶液为电解液，采用循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)表征了修饰电极的层间组装。
1材料表征
CDs和CDs-Fe3O4纳米材料的形貌通过透射电镜(TEM)表征。图1A显示所制备的CDs的粒径分布相对均匀,主要在3-4nm。图1B是CDs的高倍透射电镜(HRTEM)图像。结果表明，CDs具有良好的晶格，晶格间距为0.210nm，为典型的(002)碳晶面。如图1C所示，CDs-Fe3O4纳米材料的粒径范围为15-40nm。CDs-Fe3O4的HRTEM表征(图1D)显示纳米材料具有两个晶格间距，分别为0.345nm和0.210nm，其分别对应的是是Fe3O4的(220)晶面和碳的(002)晶面。上述形貌表征表明CDs-Fe3O4纳米材料已成功制备。
2电化学性能表征
由于[Fe(CN)6]3-/4-具有非常优良的电化学活性，因此其常常被用于工作电极或者修饰电极材料的电化学性能表征。本实施例主要通过循环伏安法(CV)对电极性能进行表征，在1.0mmol L-1[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl混合水溶液中，分别使用不同的电极通过CV法进行测定，结果如图2所示。在裸GCE上，氧化还原峰电流(I)具有良好的可逆性，氧化峰电位(Ipa)和还原峰电位(Ipc)分别为-6.616A和5.958A。当CDs在GCE表面修饰时，Ipa和Ipc分别提升到-12.29A和12.06A，表明制备的CDs具有良好的导电性。当电极为CDs-Fe3O4/GCE时，Ipa和Ipc进一步增强，说明Fe3O4的引入可以提高电极的导电性。然而，当探针DNA通过羧氨偶联反应在CDs Fe3O4/GCE表面时，I降低，主要原因是DNA分子会阻碍[Fe(CN)6]3-/4在CDs-Fe3O4/GCE表面-的扩散。上述结果也表明探针DNA已成功固定在工作电极表面。
3反应时间
探针电极与目标物质的相互作用时间是影响电化学生物传感器性能的关键因素之一。图3A显示当E.coli O157:H7的浓度为10CFU/mL时，最佳杂交时间确定为40分钟。然而，当E.coli O157:H7的浓度为108CFU/mL时，最佳杂交时间确定为35分钟(图3B)。因此，在该电化学生物传感器中，E.coli O157:H7与DNA/CDs-Fe3O4/GCE之间的最佳反应时间为40分钟。
4特异性实验
电化学生物传感器的特异性是保证生物传感器准确性的必要因素。因此，通过DPV研究了浓度(C)为105CFU/mL的不同细菌对DNA/CDs-Fe3O4/GCE的干扰，如：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、乳酸葡萄球菌和李斯特菌。图4A显示DNA/CDs-Fe3O4/GCE对其他细菌几乎没有影响。然而，DNA/CDs-Fe3O4/GCE对E.coli O157:H7的响应非常强，电流信号下降了53.42％。如图4B所示，其他干扰物质对E.coli O157:H7的测定几乎没有影响。以上结果表明，基于DNA/CDs-Fe3O4/GCE的电化学生物传感器测定E.coli O157:H7具有非常优异的特异性。
5灵敏度测定
本发明通过DPV探索了该电化学生物传感器的灵敏度和检测范围。图5A显示，当E.coli O157:H7与DNA/CDs-Fe3O4/GCE相互作用时，Ipa随着E.coli O157:H7浓度的增加而降低。主要可能的原因是E.coli O157:H7的导电性较差，影响了工作电极界面的导电性，导致电化学信号减弱。当E.coli O157:H7的浓度在10-108CUF/mL范围内时，lgC和Ipa显示出良好的线性关系(图5B)：Ipa＝1.5422lgC–14.387。同时检测限可达6.88CFU/mL，说明其具有非常好的灵敏度。
6.重复性和稳定性实验
为了考察该电化学生物传感器的重复性，制备了6个DNA/CDs-Fe3O4/GCE工作电极，并将其分别用于检测105CUF/mL E.coli O157:H7。如图6A所示，测试的结果相对标准偏差(RSD)为2.6％，说明该电化学生物传感器具有良好的重现性。同时，对电化学生物传感器的稳定性进行了研究，将DNA/CDs-Fe3O4/GCE置于4℃干燥机中，每3天通过DPV检测浓度为105CUF/mL的E.coli O157:H7。由图6B可知，经过30d后Ipa仅下降了2.7％，说明基于DNA/CDs-Fe3O4/GCE的电化学生物传感器具有良好的稳定性。
7.测定牛奶中的E.coli O157:H7
由于牛奶经常受到E.coli O157:H7的污染，因此对牛奶中的E.coli O157:H7进行高效测定是非常必要的。同时，为了验证该电化学生物传感器的实际适用性，利用该电化学生物传感器测定牛奶中的E.coli O157:H7。如表1所示，样品中加入不同浓度的大肠杆菌(103、104、105CUF/mL)，其回收率在95-102％之间，表明该方法对大牛奶中的E.coli O157:H7测定是可行的。
表1加标回收法测定牛奶中的E.coli O157:H7
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