发明内容

这里提供了一种改变顽固植物的细胞型以使顽固植物可转化的方法。这是通过从顽固植物收集花粉并用其对具有可转化细胞型的受体植物进行授粉来实现的。从该授粉事件中，获得具有(从母本亲本遗传的)可转化细胞型同时在其核基因组中还具有从顽固父本遗传的一组染色体的子代胚胎。这种子代胚胎，无论是直接转化还是诱导以形成愈伤组织或生长为植物，都具有比其顽固亲本更高的转化效率。在一些情况下，顽固亲本具有NB细胞型或者细胞质雄性不育细胞型CMS-C、CMS-S或CMS-T。

当受体植物接受来自顽固植物(充当父本)的花粉时，受体植物充当母本。受体植物可以是单倍体诱导物植物，也就是说，受体植物的任何子代可以仅具有正常数目的一半的染色体。例如，受体植物可以是雄性单倍体诱导物植物，其导致一些子代失去母本染色体(并且从而仅保留父本染色体)。父本单倍体诱导物植物可以包含ig1基因或CENH3基因中的突变。参见2005年1月7日提交的美国专利号7,439,416(披露了IG1基因)和2010年10月5日提交的美国专利号8,618,354(披露了CENH3突变)，两者均通过援引以其全文并入本文。当受体植物是父本单倍体诱导物时，由所要求保护的方法产生的子代将包含顽固植物的核基因组(即，作为单倍体)，但是包含受体植物的细胞型。

当受体植物不是单倍体诱导物植物时，由所要求保护的方法产生的子代将包含顽固植物的核基因组和受体植物的核基因组(即，作为正常二倍体)并具有受体植物的细胞型。在这种情况下，可能需要与顽固植物进行回交，以便提高顽固植物的核基因组相对于子代中的受体植物的核基因组的存在的百分比和表观遗传状态，同时仍然保留所需的可转化细胞型。通过所要求保护的方法产生的第一子代(F1代)将包含NA细胞质和核基因组，该核基因组包含半受体亲本基因组和半顽固亲本基因组。在与顽固亲本花粉进行一次回交(“BC”)之后，第二代(即，BC2代子代)将包含NA细胞质和核基因组，该核基因组75％来自顽固亲本、25％来自受体亲本。第二代之后的子代世代(例如，BC3、BC4等)将具有越来越小的受体核基因组与顽固核基因组的比率。通过使用分子标记来选择所需的亲本，可以加速所需的核基因型的选择。在没有标记的情况下的选择过程如下表中所示：

表1.使用顽固植物作为花粉提供者而不进行选择，在回交子代世代中逐渐减少母本基因组的存在。

通过实施所要求保护的方法，可以提高顽固植物株系中的转化效率，使得当转化源自子代植物或胚胎的组织时，其将具有比其顽固株系亲本更高的成功率。

因此，本发明的一个实施例是通过细胞型转移来提高将所需的DNA插入到玉米植物细胞的染色体中的成功率(即，提高顽固玉米系中的转化效率)的方法。这通过以下来完成：(a)收集来自顽固玉米植物的花粉；(b)用来自顽固玉米植物的花粉对具有正常A(“NA”)细胞质的另一玉米植物的穗丝进行授粉；以及(c)允许子代胚胎形成。在成功的细胞型转移中，子代胚胎具有NA细胞质和至少顽固玉米植物的核基因组(如果是单倍体，则子代将仅具有顽固玉米植物的染色体；如果是二倍体，则该子代将具有来自两种亲本植物的染色体)。该子代胚胎具有比顽固玉米植物更高的转化效率。

另一实施例是一种对顽固玉米系赋予可转化性的方法。这通过以下来完成：(a)收集来自顽固玉米植物的花粉；(b)用来自顽固玉米植物的花粉对具有正常A(“NA”)细胞质的另一玉米植物的穗丝进行授粉；以及(c)允许子代胚胎形成。在成功的杂交中，子代植物是可转化的。顽固玉米植物可以具有非NA细胞质，例如，所述非NA细胞质是正常B(“NB”)细胞质、细胞质雄性不育C(“C”或“CMS-C”)细胞质、细胞质雄性不育S(“S”或“CMS-S”)细胞质或细胞质雄性不育T(“T”或“CMS-T”)细胞质。受体玉米植物可以是单倍体诱导物植物(或者更具体地，父本单倍体诱导物植物)，或者父本单倍体诱导物植物包含突变的ig1基因或CENH3突变。

一旦产生，子代胚胎就生长为子代植物。子代植物可以与顽固玉米植物回交至少一代。可替代地，该子代植物是回交中的雌性亲本。子代植物可以保留NA细胞质和/或保留顽固玉米植物的核基因组。

在转化源自子代胚的组织之前，本发明的从业者可以使用来自顽固植物的花粉进行至少一次杂交，以与子代植物进行回交。这将提高顽固植物核DNA的比例(参见表1)，但是保留新的细胞型，使得源自BC1代或更远世代的任何植物组织具有比原始顽固植物更高的转化效率。

本发明的另一实施例是转化植物的方法，该方法通过测试玉米植物株系的指示NA细胞质的标记并选择这些株系中的至少一种用于转化。在一方面，该测试检测到在对应于线粒体DNA序列SEQ ID NO:7的位置11的位置处的G核苷酸；或者该测试检测到对应于SEQID NO:7的序列的存在情况。任选地，指示NA细胞质的标记的测试还包含正向引物SEQ IDNO:5和反向引物SEQ ID NO:6。可替代地，指示NA细胞质的标记的测试包含探针SEQ ID NO:7和/或探针SEQ ID NO:8，其中探针用荧光团差异标记。

序列表中的序列简述

SEQ ID NO:1-4是用于区分CMS与正常细胞质的标记组。正向引物和反向引物(分别为SEQ ID NO:1和2)扩增初始靶标，并且用指示检测到哪个等位基因的不同荧光团标记CMS和正常细胞质探针(分别为SEQ ID NO:3和4)。

SEQ ID NO:5-8是用于区分正常A与正常B细胞型的标记组。正向引物和反向引物(分别为SEQ ID NO:5和6)扩增初始靶标，并且用指示检测到哪个等位基因的不同荧光团标记正常A和正常B探针(分别为SEQ ID NO:7和8)。

定义

除非下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化和/或等效技术的替换。虽然认为以下术语可以被本领域普通技术人员很好地理解，还是阐述了以下定义以促进对当前披露的主题的解释。

术语“细胞型”指与植物株系相关的细胞质的分类。目前已知的细胞型包括正常A(“NA”)和正常B(“NB”)细胞质，但是也包括细胞质雄性不育细胞型：细胞质雄性不育C(“C”或“CMS-C”)细胞质、细胞质雄性不育S(“S”或“CMS-S”)细胞质和细胞质雄性不育T(“T”或“CMS-T”)细胞质。术语细胞型和细胞质可互换地使用。

如本文所使用的，“顽固”指不可转化或基本上不可转化的植物株系。换句话说，其转化效率为0％或基本上为0％。术语顽固与“不可转化”同义，并且这些术语可互换使用。

“可转化的”、“可转化性”等指更容易接受外源DNA并可以将外源DNA稳定地整合到其基因组中的植物、植物株系或植物细胞(诸如愈伤组织或原生质体)。

“转化效率”或“转化率”意指成功转化的植物的数量与总尝试的数量的比的量度。该量度可以定量地表示，例如表示为百分比或原始数字，或者定性地表示，例如“低”或“高”。

术语“一个或多个等位基因”是指基因的一各或多个替代形式中的任何一个，所有等位基因均涉及至少一个性状或特征。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占有同源染色体对上相应的基因座。在某些情况下(例如，对于QTL)，用“单倍型”(即染色体片段的等位基因)代替“等位基因”更为准确，但是，在这些情况下，术语“等位基因”应理解为包含术语“单倍型”。如果两个个体在特定基因座处拥有相同的等位基因，则如果等位基因是从一个共同祖先遗传的(即，等位基因是同一亲本等位基因的拷贝)，则所述等位基因被称为“由于继承而相同”。可替代的是等位基因“按状态相同”(即，等位基因看起来是相同的，但源自等位基因的两个不同拷贝)。世代信息鉴定对连锁研究很有用；世代鉴定和状态信息鉴定都可以用于关联研究，尽管血统信息鉴定可能特别有用。

术语“回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。

术语“有条件的雄性不育”是指雄性不育的表型(即，不能产生可育的花粉)，其可以被某些条件诱导和/或抑制。因此，可以通过应用所述某些条件将植物从雄性不育表型“转换”为雄性可育表型。雄性不育可能由多种因素引起，并且可以例如表现为完全缺乏雄性器官(花药)、花粉退化、不育花粉等。基于条件的强度，从雄性不育到雄性可育的“转换”可以是完全的或不完全的。最优选地，在本发明的上下文中，术语“有条件的雄性不育”意指温度依赖性的雄性不育，并且因此意指细胞核雄性不育表型，其中该不育是温度依赖性的，可以在超过35℃(优选在35℃至43℃之间，更优选在37℃至40℃之间，最优选在约39℃下；优选暴露一段优选的热处理时间，然后在室温下生长)的温度下恢复为可育。

在核酸序列上下文中，术语“对应于”意指当某些序列的核酸序列与彼此比对时，“对应于”在本发明中某些枚举的位置的核酸是与参考序列中的这些位置比对的那些，但相对于发明的特定核酸序列而言并不一定位于这些精确的数字位置中。例如，在以下比对中，SEQ ID NO:8的位置13处的T对应于SEQ ID NO:7的位置11处的G。

术语“差异标记”表示两种或更多种探针均具有彼此不同的荧光团，使得可以单独检测每种探针的存在或不存在，而不管两种或更多种探针是否包含在同一反应中。

术语“种质”是指一个群体或另外的个体组(例如，物种)的基因型的总体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，一组植物，其充当各种等位基因的储存库。短语“适应的种质”是指已证实具有遗传优势的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域，短语“未适应的种质”、“原始种质”和“外来种质”是指遗传价值未知或未经证实的植物材料；例如，对于给定的环境或地理区域；这样，短语“未适应的种质”在一些实施例中是指不属于已建立的育种群体并且与已建立的育种群体的成员没有已知关系的植物材料。

术语“单倍型”可以指从一个亲本那里继承的个体的等位基因集。因此，二倍体个体具有两个单倍型。术语“单倍型”可以在更有限的意义上使用，以指代与表型性状相关的物理连锁的和/或不连锁的遗传标记(例如，序列多态性)。短语“单倍型区块”(有时在文献中也简称为单倍型)是指在单个染色体(或其一部分)上物理连锁的一组两个或更多个遗传标记。通常，每个区块具有若干个常见的单倍型，并且可以选择遗传标记的子集(即“单倍型标签”)来唯一地鉴定这些单倍型中的每一个。

术语“杂种优势群”和“杂种优势库”可互换地使用，并且指玉米总体的育种库之间的关系。概括地说，杂种优势库的主要名称是：硬茎(Stiff Stalk)(“SS”，也称为Iowa硬茎合成或“BSSS”)、非硬茎(Non Stiff Stalk)(“NSS”)和Iodent(“IDT”)。参见J.v.Hweerwaarden等人的Historical genomics of North American maize[北美玉米的历史基因组学]，Proc.Nat’l Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]，109(31):12420-25(2012)。然而，这些不是排他性的，并且其它名称是已知的，例如，Lancaster Sure Crop(“LSC”)。参见，例如，C.Livini等人的Genetic diversity of maize inbred lines withand among heterotic groups revealed by RFLPs[通过RFLP揭示的具有杂种优势群和杂优势群之间的玉米自交系的遗传多样性]，Theor.Appl.Genet[理论与应用遗传学]，84:17-25(1992)。

在植物育种的上下文中，术语“杂种”、“杂种植物”和“杂种子代”是指植物，该植物是通过杂交不同系或品种或物种的植物(包括但不限于两个近交系(例如，基因杂合的或大部分杂合的个体)之间的杂交)而产生的基因上不同的亲本的后代。短语“单次杂交F1杂种”是指由两个近交系之间的杂交产生的F1杂种。

短语“近交系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交系可以通过若干循环的兄弟/姐妹育种或自体受精来获得。在一些实施例中，近交系针对一个或多个感兴趣的表型性状进行纯育。“近交”、“近交个体”或“近交子代”是来自一个近交系的单独的样品。术语“近交”是指基本上纯合的个体或系。

术语“渐渗(introgression)”，“渐渗的(introgressed)”和“进行渐渗(introgressing)”是指自然过程和人工过程，其中通过将一个物种、品种或栽培品种与另一个物种、品种或栽培品种杂交来将基因组区域从所述一个物种、品种或栽培品种移至该另一个物种、品种或栽培品种。该过程可以任选地通过回交到回交亲本来完成。

术语“基于标记的选择”在本发明的范围内被理解为是指使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状相关联，以鉴别出携带令人希望的(或不希望的)性状的基因的植物，使得在例如转化程序或选择性育种程序中可以使用(或避免)那些植物。如本文所使用的，指示正常A细胞质的标记将区分具有正常B细胞质的非CMS植物与不具有正常B细胞质(即，具有正常A细胞质)的那些植物。标记可以是基因组的基因座内的突变(例如，单核苷酸多态性(“SNP”))或一个等位基因内的突变。

短语“表型性状”是指个体中由个体的基因组与环境的相互作用产生的外观或其他可检测的特征。

术语“多个”是指多于一个实体。因而，“多数个体”是指至少两个个体。在一些实施例中，术语多数是指多于整体的一半。例如，在一些实施例中，“群体中的多数”是指多于那个群体的成员的一半。

术语“子代”是指具体杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。这一个或多个后裔可以是例如F1、F2或任何继代。

短语“质量性状”是指受一个或几个展现大多数表型作用的基因控制的表型性状。因此，质量性状通常被简单地遗传。植物中的实例包括但不限于花色、穗轴色和疾病抗性，例如北方玉米叶枯萎病抗性。

“表型”在本发明的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的一个或多个可区分的特征。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或培养细胞的形式，或作为高等组织化单位(例如像，植物组织、植物器官或整株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花朵、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。

术语“群体”意指共享一个常见遗传衍生的植物的遗传上异质的集合。

术语“主要是雄性不育的”是指在至少100株植物中，所有这些植物上不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％的花具有产生可育花粉的功能雄性器官。必须理解，单个植物可以同时具有可育和不育的花。在优选的实施例中，单个植物上不超过10％，优选不超过5％，更优选不超过1％的花具有产生可育花粉的功能雄性器官。

术语“后代”植物是指作为一种或多种亲本植物或其后裔的营养或有性繁殖的子代的任何植物。例如，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交或者通过两个亲本植物的杂交而获得，并且包括自交体以及F1或F2或甚至更远的世代。F1是由亲本产生的第一代后代，该亲本中的至少一个第一次用作性状的供体，而第二代(F2)或后续世代(F3、F4等)的后代是由F1、F2等的自交产生的样本。因此，F1可以是由两个真正育种亲本(真正育种是性状纯合的)之间的杂交产生的杂种，而F2可以是由该F1杂种的自花授粉产生的后代。

“重组”是减数分裂过程中两个同源染色体之间的信息交换。双重重组的频率是单个重组体的频率的乘积。例如，在10cM区域中发现的重组子的频率为10％，并且双重重组子的频率发现为10％x 10％＝1％(1厘摩被定义为测试杂交中1％的重组子代)。

术语“RHS”或“恢复的杂种系统”是指基于细胞核雄性不育的杂种系统。

如短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。在一些实施例中，“有性杂交”或“异体受精”是一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。在一些实施例中，术语“自交”是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即花粉和胚珠来自同一株植物。

“选择性育种”在本发明的范围内应理解为是指使用具有或显示令人希望的性状的植物作为亲本的育种程序。

“测试”植物在本发明的范围内应理解为是指用于在基因上表征将被测试的植物中的性状的植物。典型地，使待测试的植物与“测试”植物杂交，并且对杂交子代中的性状的分离比率进行评分。

术语“测试对象”是指具有标准基因型，已知特征和已建立的性能的系或个体。“测试对象亲本”是指来自测试对象系的个体，其在有性杂交中被用作亲本。通常，测试对象亲本与其所杂交的个体无关并且在基因上不同。当与个体或近交系杂交以进行表型评估时，通常使用测试对象来产生F1子代。

短语“顶交组合”是指将单个测试对象系与多个系杂交过程。产生此类杂交的目的是确定杂种子代的表型表现；也就是说，通过测试对象杂交来评估多个系中的每一个系在源自所述系的杂种子代中产生期望表型的能力。

术语“品种”和“栽培品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。