阅读说明：本技术 一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用 (Molecular breeding method of reproductive heterozygous female sterile restorer line and application thereof ) 是由 倪金龙 周海 倪大虎 宋丰顺 张德文 杨剑波 钱征 林翠香 于 2019-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于遗传作物分子生物学技术领域,尤其涉及一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用。本发明以广亲和基因S5n架桥,选育携带S5i的粳稻或携带S5j的籼稻近等恢复株系；将温敏不育基因或反光敏核不育基因导入到S5i或S5j位点近等基因恢复系中,育成携带S5i+温敏不育基因或反光敏不育基因,或者S5j+温敏不育基因或反光敏不育基因的近等基因恢复系；通过高温或短日照条件下制种方式,实现杂合雌性不育杂交水稻恢复系的繁殖。由于本发明选育的恢复系雌性不育但雄性可育,因此制种授粉后无需去除父本,实现制种机械化收割,提高杂交水稻制种效率,为杂交水稻机械化制种提供技术保障。(The invention belongs to the technical field of genetic crop molecular biology, and particularly relates to a molecular breeding method of a reproductive heterozygous female sterile restorer line and application thereof. The invention relates to a method for breeding japonica rice carrying S5i or indica rice carrying S5j near-isogenic recovery strains by bridging a wide-affinity gene S5 n; introducing the temperature-sensitive sterile gene or the light-sensitive sterile gene into an S5i or S5j locus near isogenic restoring line to breed a near isogenic restoring line carrying the S5i + temperature-sensitive sterile gene or the light-sensitive sterile gene or the S5j + temperature-sensitive sterile gene or the light-sensitive sterile gene; the hybrid female sterile hybrid rice restorer line is bred in a seed production mode under the condition of high temperature or short sunlight. Because the restorer line bred by the invention is female sterile but male fertile, the male parent does not need to be removed after the pollination of the hybrid seeds, the mechanized harvesting of the hybrid seeds is realized, the seed production efficiency of the hybrid rice is improved, and the technical guarantee is provided for the mechanized seed production of the hybrid rice.)

一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用

技术领域

本发明属于遗传作物分子生物学技术领域，尤其涉及一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用。

背景技术

杂交水稻的发明与推广应用已为我国乃至全球粮食安全做出重大贡献。但杂交水稻制种环节多、工序繁杂，依赖于密集的劳动力，成本高，效率低。随着我国城镇化建设规模的不断扩大，致使农村劳动力人口锐减。因此，研究和建立全程机械化作业的杂交水稻制种技术尤为迫切。

目前，在杂交水稻制种过程中，授粉后恢复系的去除是影响制种全程机械化作业的一个重要因素。现有的报道和专利申请中，关于去除制种父本的技术构想主要集中在以下几个方面：一、利用父母本粒型的差异，通过机械分选技术实现杂交种和父本的分离。该方法只能针对父母本粒型差异较大的杂交组合，很多杂交组合父母本粒型差异较小，特别是对仅为粒长差异的组合，混杂难以有效剔出，利用粒型特异基因(如特大粒、特小粒)改造双亲的技术难度大，因而该方法局限性大。二、利用父母本颖壳颜色差异，通过色选机将杂交种与父本分开。大量实践表明，色选机去杂能力的有限，特别是杂粒比例较大时，往往需要反复多次色选才能凑效，成本高，效率难以提升，因而该方法应用也受到限制。三、将除草剂敏感基因导入到恢复系中，花期授粉后喷施除草剂杀死父本，实现机械化混收(CN1318287，CN102342243A)。实践表明：仅靠授粉后喷施除草剂往往难以杀死所有的恢复系，即便是杀死了的恢复系，其穗上也可能会有少量具有发芽能力的非饱满种子，加之父母本混植状态下的相互支撑和捧举，致使收获的杂交种中，不可避免地存在少量父本种子的掺杂。四、通过壳色和除草剂敏感性状双重剔除恢复系种子，即将除草剂敏感基因和壳色基因导入到恢复系中；或将除草剂敏感基因导入父本，将壳色基因导入母本，在喷施除草剂和色选的双重作用下，达到剔除父本的目的。这种方法在一定程度上达到了较为理想的效果，但除草剂的喷施对生态环境可能会造成影响。另外，这种方法对色选机的灵敏度有较高的要求。五、利用雌性不育系做恢复系进行杂交水稻制种(高荣村等，2012)。但目前报道的雌性不育系均自我有性繁殖，因而该方法难以推广应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法，包括：以广亲和基因S5n架桥，选育携带S5i的粳稻或携带S5j的籼稻近等恢复株系；将温敏不育基因或反光敏核不育基因导入到S5i或S5j位点近等基因恢复系中，育成携带S5i+温敏不育基因或反光敏不育基因，或者S5j+温敏不育基因或反光敏不育基因的近等基因恢复系；通过高温或短日照条件下制种方式，实现杂合雌性不育杂交水稻恢复系的繁殖。

进一步，所述温敏不育基因为tms5基因，所述反光敏核不育基因为csa基因。

进一步，在育种选育过程中利用分子标记辅助选择跟踪目标基因的聚合体，其中针对tms5基因、csa基因及S5的分子标记引物见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。

进一步，携带S5n基因的水稻资源为02428、轮回422、培矮64中的任一种。

进一步，携带S5i基因的水稻资源为华占、粤禾丝苗、明恢63、明恢86、9311、蜀恢527、9308、绵恢725、特青、R288、浙恢7954中的任一种。

进一步，携带S5j基因的水稻资源为C57、C418、R18、皖恢9号、C堡、金恢58、R190、C4115、宁粳1号、武运粳14号中的任一种。

进一步，携带温敏不育基因tms5的温敏不育系为Y58S或其同型系及衍生温敏核不育系；携带反光敏核不育基因csa基因的反光敏不育系为csa或其同型系及衍生光敏核不育系。

如上述的一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法在水稻育种中的应用。

进一步，将选育的可繁殖杂合雌性不育恢复系与携带广亲和基因S5n的三系，或与不携带温敏不育基因或反光敏核不育基因两系不育系杂交配组，选育杂交水稻新组。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明是一种方法上的创新，是将现代分子生物学的分子标记技术与传统的作物遗传育种中的杂交、回交、测交等多种选择技术有机结合，为作物新品种选育、新材料创制提供快捷、准确、可预见的实用方法。

本发明以广亲和基因S5n架桥，利用籼粳杂种不育基因S5和光温敏核不育基因tms5或csa，培育出可繁殖杂合雌性不育杂交水稻恢复系，即以广亲和基因S5n架桥，将恢复系中的杂种不育基因S5由籼型等位型S5i(或S5j)替换成粳型等位型S5j(或S5i)，育成携带S5j(或S5i)位点的近等基因恢复系；将温敏不育基因tms5(或反光敏核不育基因csa)导入到S5i或S5j位点近等基因恢复系中，即育成携带S5i+tms5(或csa)或S5j+tms5(或csa)的近等基因恢复系；通过高温或短日照条件下制种方式，实现杂合雌性不育杂交水稻恢复系的繁殖。获得的杂合雌性不育恢复系(S5iS5j+TMS5tms5或S5iS5j+CSAcsa)再与携带广亲和基因S5n的三系或不携带tms5或csa两系不育系杂交配组，选育杂交水稻新组合。由于选育的恢复系雌性不育但雄性可育，因此制种授粉后无需去除父本，实现制种机械化收割，因而提高杂交水稻制种效率，为杂交水稻机械化制种提供技术保障。

本发明选用温敏不育系分别与光敏不育系和含有广亲和基因材料进行聚合杂交，并对其分离世代进行分子标记辅助选择及与籼粳恢复系测配。本发明中涉及的水稻温敏核不育系包括但不限于Y58S或其同型系及衍生温敏核不育系。水稻反光敏核不育系包括但不限于csa或其同型系及衍生光敏核不育系。水稻广亲和材料包括但不限于02428、轮回422、培矮64等或携带广亲和基因S5n的材料。水稻籼型恢复系包括但不限于华占、粤禾丝苗、明恢63、明恢86、9311、蜀恢527、9308、绵恢725、特青、R288、浙恢7954等材料。水稻粳型恢复系包括但不限于C57、C418、R18、皖恢9号、C堡、金恢58、R190、C4115、宁粳1号、武运粳14号等材料。

附图说明

图1是杂合雌性不育恢复系分子选育技术路线图；

图2是S5n连锁标记对选育的部分S5n近等基因恢复株系的扩增结果；

图3是csa连锁分子标记对选育的聚合S5i和csa的部分株系扩增分析结果；

图4是tms5连锁分子标记对选育的聚合S5i和tms5的部分株系扩增分析结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

籼粳杂种不育是水稻生殖隔离的重要形式。目前，已报导的籼粳杂种不育的位点较多，S5是其中的一个主效位点。该位点有3个功能等位型，S5i是籼稻等位型，S5j是粳稻等位型，S5n是中间型即广亲和等位型。S5i等位型与S5j等位型杂交F1雌性不育(胚囊不育)，而花粉发育正常，S5i和S5j等位型与S5n，均能正常结实。本发明根据上述S5位点不同等位型的功能特性，并利用已克隆的温敏核不育基因tms5(Zhou等，2012)或反光敏核不育基因csa(Zhang等，2013)，通过杂交回交及分子标记选择手段，创制可繁殖的杂合雌性不育恢复系，为培育适合机械化制种的杂交水稻新品种提高材料基础和技术支撑，技术路线如图1所示。

具体实验过程如下：

1、携带S5n近等基因恢复株系选育

鉴于华占、粤禾丝苗等籼稻(携带S5i)或C418(携带S5j)等粳稻恢复系的综合农艺性状表现突出，且在农业生产上应用推广地域范围较宽泛，因而选用粤禾丝苗作为轮回亲本，分别与携带广亲和基因S5n的材料如02428进行杂交、回交，结合分子标记筛选(PCR反应体系：50ng DNA；5ul TAKARA rTaq buffer；浓度为10mM上下游引物各2ul；浓度为2.5mM的dNTPs 5ul；TAKARA rTaq 5U；加ddH₂O配至50ul。PCR程序：95℃ 3min；95℃ 30sec，55℃30sec，72℃ 30sec，32个循环；72℃5min)，在回交4～5代的分离群体中选育广亲和基因S5n位点纯合的粤禾丝苗株系。

2、携带tms5(或csa)+S5i籼型近等基因聚合株系选育

以粤禾丝苗(携带S5i)为轮回亲本，分别与Y58S、csa等杂交，回交，结合分子标记筛选(PCR反应体系：50ng DNA；5ul TAKARA rTaq buffer；浓度为10mM上下游引物各2ul；浓度为2.5mM的dNTPs 5ul；TAKARA rTaq 5U；加ddH₂O配至50ul。PCR程序：95℃ 3min；95℃30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，32个循环；72℃5min)，在回交4～5代的分离群体中选育携带tms5(或csa)+S5i的聚合株系。

3、携带S5j的籼稻近等恢复株系的选育

已携带S5n基因的粤禾丝苗为轮回亲本，与携带S5j资源C418杂交，回交，并结合分子标记筛选(PCR反应体系：50ng DNA；5ul TAKARA rTaq buffer；浓度为10mM上下游引物各2ul；浓度为2.5mM的dNTPs 5ul；TAKARA rTaq 5U；加ddH₂O配至50ul。PCR程序：95℃ 3min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 30sec，32个循环；72℃ 5min)，在回交4～5代的分离群体中选育携带S5j的粤禾丝苗。

4、可繁殖杂合雌性不育恢复系选育

在高温或短日照条件下，以粤禾丝苗tms5tms5为母本，与恢复系粤禾丝苗S5jS5j杂交制种，繁殖粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5。分别在合肥和海南陵水种植粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5，并考察花粉育性和结实率，结果见表1，表明粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5雌性不育。

表1粤禾丝苗杂合雌性恢复系在合肥与陵水花粉可染率及结实率情况

5、可繁殖杂合雌性不育恢复系的制种应用

以携带S5n的两系不育系培矮64S与粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5杂交制种，杂交种成熟后父母本机械混收，混收的杂交种进行纯度种植鉴定。2019年5月合肥种植杂交组合培矮64S/(粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5)500株，3个重复，2019年8月进行田间纯度鉴定，结果见表2，纯度均>96％(杂交稻纯度基准线)，表明杂合雌性不育系粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5可作恢复系用于杂交水稻机械化制种。

表2杂交组合培矮64S/(粤禾丝苗S5iS5j+TMS5tms5)纯度田间鉴定结果

本发明中分子标记辅助选择是以分离世代优良单株的基因组DNA为模版，用一定的核苷酸序列(5’—3’)的双引物进行PCR分析，以跟踪选择目标基因的聚合体。引物序列如下：

部分分子标记选育的图谱见图2-图4，其中图2是S5n连锁标记对选育的部分S5n近等基因恢复株系的扩增结果；M:DNA Marker；1:02428；2:粤禾丝苗；3:02428/粤禾丝苗F₁单株；4-11:S5n近等基因恢复株系；图3是csa连锁分子标记对选育的聚合S5i和csa的部分株系扩增分析结果；M:DNA Marker；CSA:csa短日不育系；Y:粤禾丝苗；H:csa/粤禾丝苗F₁单株；1-5:csa和S5i聚合株系；图4是tms5连锁分子标记对选育的聚合S5i和tms5的部分株系扩增分析结果；M:DNA Marker；1-7:S5i和tms5聚合株系；8:粤禾丝苗；9:Y58S/粤禾丝苗F₁单株；10:Y58S。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

安徽华安种业有限责任公司

<120> 一种可繁殖杂合雌性不育恢复系分子选育方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(csa-F)

<400> 1

ggggggtgaa taggctttc 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(csa-R)

<400> 2

gtgtctgcta gggttacagg ttt 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(tms5-F)

<400> 3

atatttggcg ctctattctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(tms5-R)

<400> 4

ggccaagtgt tatgatcact 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(S5i/S5j/S5n-F)

<400> 5

tgagcaagca agaaagaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(S5i/S5j/S5n-R)

<400> 6

gtagcgaaga caaagggagt 20