具体实施方式

图1a示出了在本披露内容的示例中使用的样品支架的实施例。图1a示出了适用于本发明的样品支架的截面。样品支架100包括衬底，其上沉积有等离子体层102。图1b和图1c示出了如在PCT/AU2018/050496中例示的两种类型的等离子体层，其亚微米阵列已经被制造并且可以在实施例中使用。这些层都是厚度为150nm的银膜，但是也可以使用其他合适的材料。图1b的亚微米阵列采用圆形纳米孔形式，周期为450nm，以六边形图案排列。图1c在矩形图案上具有十字形纳米孔。十字形纳米孔在一个方向(此处定义为0°方向)上具有450nm的周期，在正交方向(定义为90°方向)上具有400nm的周期。这些阵列在470-550nm范围内(在电磁谱的可见区域内)具有表面等离子体激元(SPP)共振模式。为了保护等离子体层102的表面，在等离子体层102制造之后沉积氢倍半硅氧烷(HSQ)(一种玻璃状材料)层104(10nm±1nm)。用HSQ封盖后，样品支架100的上表面类似于可以在其上支撑样品的常规显微镜载玻片的上表面。在使用中，HSQ层还呈现出有助于组织附着的极性表面。在其他实施例中，可以使用金属氧化物封盖层(例如SiO₂)来代替HSQ。

将待成像的样品制备好并放置在根据以拉筹伯(La Trobe)大学的名义提交的PCT/AU2018/050496或申请人于2018年11月29日提交的名称为“Microscopy method andsystem[显微术方法和系统]”的共同未决澳大利亚专利申请2018904553以及要求与本申请同一天提交的AU 2018904553的优先权的国际专利申请的实施例的样品支架上。将样品106(通常是生物组织的薄片，其在本发明的优选实施例中不需要被染色或标记)放置在样品支架上、邻近等离子体层，如图2a所示。

图3A是系统300的示意图，其中样品支架100用在反射光显微术中。本领域技术人员已知用于使用常规载玻片的反射光显微术的技术和设备，为了避免模糊本发明的细节，将省略对已知技术的描述。

系统300包括光源310，该光源发射入射光311来照射样品106。在此示例中，从样品支架的定位有样品的一侧执行照射。反射光315被反射回成像系统312，用于产生颜色对比度图像。样品支架100是具有等离子体层的纳米载玻片。

当系统300用于反射光显微术中时，形成图像的反射光已经与样品支架的等离子体层和样品相互作用，使得它具有反射光谱，该反射光谱根据样品的局部介电常数而变化。因此反射光图像显示颜色对比度。

图4展示了小鼠视神经的薄切片(70nm)的反射图像。组织以常规方式制备并包埋在环氧树脂中。在Leica UC7超微切片机上切割70nm厚的切片。该图像是用20x放大率捕获的，并且是在反射模式下取得的。在图像中，可见的条是由于纳米载玻片的等离子体层中的亚微米结构包括周期约为450nm的结构，其位于Em光谱的可见区域，因此在图像中产生可见的条纹。使用较小的周期或不同形状的阵列(例如六边形)可以避免这种伪影。

特定反射光谱将与归一化透射光谱(例如，如PCT/AU2018/050496中所示)的倒置有些相似，其中在透射光谱的峰处出现低谷。然而，可能存在不同组的等离子体共振模式。图5展示了在反射模式下使用纳米载玻片时的示例性模拟光接收光谱，三种样品情况如下：

R＝1的样品，即没有样品，或样品为空气

R＝1.33的样品(例如，由水组成的样品)

R＝1.5的样品(例如，比如聚合物的材料)

模拟的光谱基于纳米载玻片，该纳米载玻片具有半径为90nm的等离子体材料的圆形岛，这些圆形岛被布置成以六边形格阵列在第一方向上具有480nm的间距的阵列。

与等离子体层覆盖了纳米载玻片的整个区域且只有由亚微米结构提供的小空隙的PCT/AU2018/050496的说明性示例相比，已经发现，当用在反射显微术中时，提供等离子体层区域可能是有利的，该等离子体层区域由于其亚微米结构的布置而较少地(按面积)填充由等离子体层覆盖的区域。在一些情况下，等离子体层区域可以被填充(按面积)不超过区域的75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％之一。填充因子的减小在反射显微术中是有利的，因为它减少了入射光的反射(即允许更多的透射)，使得反射光中的光谱值更容易从低谷中辨别出来，这增强了接收的图像中的颜色对比效果。

图5b展示了这种样品的模拟图像，示出了从这种样品得到的可见颜色。可以看出：

RI＝1的样品(左)显现为蓝色，与其反射光谱中的峰位置相对应；

RI＝1.33的样品(中间)显现为橙色，与其反射光谱中的峰位置相对应；以及RI＝1.5的样品(右)显现为红色，与其反射光谱中的峰位置相对应；

证明在反射显微术中使用纳米载玻片形成的图像显示基于样品的介电常数的颜色对比度，该介电常数与样品的折射率相关。

重要的是，当使用基本上透明的样品时，纳米载玻片的使用能够获得这种颜色对比度，而无需对样品染色。因此，接收的反射光包括从等离子体层(与样品的上表面相反)反射的光。其也意味着样品本身的吸收相对较低。

所使用的显微镜是具有供用户观察的目镜的常规光学显微镜，然而，它可以替代性地或附加地包括图像捕获系统，以生成用于显示、存储或供其他后续使用的数字图像。在一些形式中，显微镜可以形成自动载玻片扫描仪的一部分。系统300可以包括用于显示捕获的样品数字图像的用户终端和用于存储捕获的图像的数据存储系统。

当使用纳米载玻片执行反射光显微术时，本发明人已经确定，在何处/何时/何原因而使点更好的一些情况下，等离子体层可以被专门化以产生改善的结果。特别地，周期性亚微米结构阵列可以包括分开的等离子体区域的阵列。等离子体区域可以是由间隙分开的等离子体材料的岛。等离子体区域通常以周期性阵列布置，亚微米结构之间的间距在200nm至500nm的范围内。每个等离子体区域可以具有50nm至300nm范围内的最大尺寸。最优选地，亚微米结构是跨约100nm至200nm之间的等离子体材料区域。等离子体区域可以被成形为以下任意一种或多种：圆形、圆环形、椭圆形、十字形、矩形、正方形。

如在PCT/AU2018/050496中所述，等离子体层可以由一种或多种金属形成，比如：Al、Ag、Au、Ni、Pt或Pd。等离子体层可以具有20nm至300nm范围内的厚度。

图1d至图1j展示了这种周期性亚微米结构阵列的示例，其包括分开的等离子体区域的阵列。

图1d展示了包括正方形等离子体区域103的规则矩形阵列的等离子体层102。等离子体区域103在第一方向和第二方向上的间隔相等。

图1e展示了包括正方形等离子体区域103的阵列的等离子体层102，该阵列被布置成在第一方向和第二方向上等离子体区域103的间隔相等，但是每行与其相邻行偏移，以形成等离子体区域103的六边形阵列。第一和第二(x和y)方向上的区域之间的间距可以相同(如所展示的)或不同。

图1f展示了包括正方形等离子体区域103的阵列的等离子体层102，其中等离子体区域103在第一方向和第二方向上的间隔不相等。如在PCT/AU2018/050496中所阐述的，这样的示例能够通过相对于阵列的行和列切换接收的光的相对偏振来使用偏振照射改变接收的光的光谱。

图1g展示了包括圆形等离子体区域103的示例等离子体层102。在此示例中，等离子体区域103在第一方向和第二方向上的间隔相等，但是也可以使用其他阵列布置。

图1h展示了包括十字形等离子体区域103的示例等离子体层102。在此示例中，等离子体区域103在第一方向和第二方向上的间隔不相等相等，但是也可以使用其他阵列布置。

图1i展示了包括矩形等离子体区域103的示例等离子体层102。然而，与其他实施例不同，相邻等离子体区域之间的间隔相对较窄。这产生了等离子体区域占据等离子体层的面积的大于50％部分的等离子体层。

图1j展示了包括被成形为条的等离子体区域103的示例等离子体层102，这些条由非等离子体条分开，从而产生了分开的等离子体区域的1维阵列。

如可以看出的，等离子体区域的阵列可以是在第一方向和/或第二方向上在相邻等离子体区域之间具有相等间隔的规则阵列。优选地，第一方向和第二方向是正交方向。然而，阵列可以在第一方向和第二方向上具有不同的间隔。

本发明还提供了一种荧光显微术的方法，该方法包括：

提供具有上表面和下表面的样品支架，该上表面具有与其相关联的等离子体层，该等离子体层包括周期性亚微米结构阵列；

将该样品施加到该样品支架的上表面；

用光照射该样品，使得所述光与该样品和该样品支架相互作用；

接收从样品通过荧光发射的光并形成其图像。

该方法可以进一步包括接收与所述样品和样品支架相互作用之后的光，并形成其至少一个图像，其中，基于接收到的光的颜色，样品的至少一个局部结构性质在图像中是可见的。在PCT/AU2018/050496中更详细地描述了这种成像。本文以此方式形成的图像被称为颜色对比度图像。有利地，以此方式，除了使用颜色对比度成像之外，安装在样品支架上的样品可以使用荧光显微术成像。

如本领域技术人员所了解的，荧光显微术通常用反射光显微术布置来执行，因为有必要(或期望)从在待成像样品中引起的荧光的同一侧照射样品。因此，图3A的示意性布置也可以用于如图3B所展示的同一样品的荧光成像。在此示例中，光源310发射入射光321来照射样品106。照射使得样品106发荧光。通过荧光从样品发射的光325被成像系统312捕获，使得能够产生样品的荧光图像。

如本领域技术人员所知，荧光显微术可能需要专门的样品制备和标记技术。也可以使用波长选择照射和图像捕获技术。为了不模糊本发明的细节，这里将不描述荧光显微术图像中使用的一般荧光样品制备、照射技术或图像捕获技术的细节。

在一些实施例中，可以对同一样品顺序地或同时执行荧光显微术和颜色对比度显微术。在它们被顺序地执行的情况下，由样品通过荧光发射的光形成的图像可以在第一时间段中形成，而颜色对比度图像可以在第二时间段中形成。

在每种类型的显微术中使用特定的照射性质可能是必要的或有利的，在这种情况下，用于颜色对比度成像的光可以具有与用于荧光成像的光不同的照射光谱。这可能需要可互换地使用两个光源，或者使用在每个时间段中被不同地过滤的共用光源。然而，在一些情况下，可以使用相同的光谱。

图3C示意性地展示了使用图3A和图3B的系统对同一样品执行荧光成像和颜色对比度成像的示例。在此示例中，光源310发射光321/311(其可以具有相同的光谱或不同的光谱)来照射样品106。照射使得样品106发荧光，并且还与样品和样品支架100的等离子体层102相互作用。接收到的光325通过荧光从样品发射，并且接收到的光315被样品支架100反射。接收到的光315/325由成像系统312捕获，以能够产生样品的荧光图像和颜色对比度图像。如上所述，光311和321的发射可以同时或不同时。

图3D示意性地展示了使用图3A和图3B的系统对同一样品执行荧光成像和颜色对比度成像的示例。在此示例中，光源310发射光321/311(其可以具有相同的光谱或不同的光谱)来照射样品106。照射使得样品106发荧光，并且还与样品和样品支架100的等离子体层102相互作用。接收到的光325通过荧光从样品发出，并且接收到的光315被样品支架100反射。接收到的光315由第一成像系统312捕获，以能够产生颜色对比度反射图像。接收到的光325被第二成像系统312’捕获，以能够产生同一样品的荧光图像。如上所述，光311和321的发射可以同时或不同时。对于图3C和图3D，在一些情况下，当不需要时，样品在颜色对比度显微术期间可能会发荧光。这通常可以通过在图像形成时滤除(多个)荧光波长或通过不在导致荧光的波长弯曲中照射样品来处理。荧光在非常特定的波长处发生，因为它是通过荧光标签内特定的光跃迁产生的，因此荧光在接收到的光谱中表现为一条线(或多条线)。这些特征线可以从颜色对比度图像的更平滑的连续背景光谱中分离出来。在荧光线恰好与颜色对比度图像中的接收到的颜色光谱中的强波长峰重合的情况下，这可以通过使用具有不同间距亚微米结构的纳米载玻片来校正，或者在所使用的纳米载玻片在不同方向上在亚微米结构之间具有不同间距的情况下，从而改变颜色对比度图像的照射偏振。如申请人在与本申请同一天提交的发明名称为“Automated method of identifying a structure[鉴定结构的自动化方法]”和“Method of identifying a structure[鉴定结构的方法]”的共同未决澳大利亚专利申请中所阐述的，这将改变颜色对比度图像中的接收到的光谱，但不会改变荧光图像中的接收到的光谱。

通过本方法捕获的图像可以单独使用或一起使用，以得出关于样品的结论。在本发明的一些实施例中，该方法可以包括使由该样品通过荧光发射的光形成的图像和颜色对比度图像在空间上相关。

这可以通过生成显示颜色对比度信息和荧光图像的组合图像来执行。从样品通过荧光发射的光形成的多个图像(例如，每个荧光波长一个图像)和/或多个颜色对比度图像(在不同偏振下捕获)可以组合成单个图像。

该组合可以光学地(例如在光学图像形成期间)或数字地(例如通过组合表示所述图像的数据值)执行。应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有替代性组合。所有这些不同组合构成本发明的多个替代性方面。