Yh66-rs11190基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用

文档序号：1856603 发布日期：2021-11-19 浏览：29次 >En<

阅读说明：本技术 Yh66-rs11190基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 (YH66-RS11190 gene mutant and application thereof in preparation of L-valine ) 是由孟刚魏爱英贾慧萍赵春光毕国栋于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了YH66-RS11190基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。具体地公开了SEQ ID No.1所示的YH66-RS11190基因在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用。本发明通过对YH66-RS11190基因进行过表达或敲除、或定点突变(SEQ ID No.3)可以调控L-缬氨酸的产量。对YH66-RS11190基因编码区进行点突变及过表达,有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高,而对基因进行敲除或弱化,不利于L-缬氨酸的积累。可利用YH66-RS11190基因来构建符合工业化生产的L-缬氨酸高产菌种,对L-缬氨酸的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。(The invention discloses a YH66-RS11190 gene mutant and application thereof in preparation of L-valine. Specifically discloses the application of YH66-RS11190 gene shown in SEQ ID No.1 in regulating and controlling the yield of L-valine of microorganisms. The invention can regulate the yield of L-valine by carrying out overexpression or knockout or site-directed mutagenesis (SEQ ID No.3) on YH66-RS11190 gene. The YH66-RS11190 gene coding region is subjected to point mutation and overexpression, which is beneficial to the improvement of L-valine yield and transformation rate, and the gene is knocked out or weakened, which is not beneficial to the accumulation of L-valine. The YH66-RS11190 gene can be used for constructing an L-valine high-yield strain which accords with industrial production, and the strain has wide application value and important economic significance for the industrial production of the L-valine.)

YH66-RS11190基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及YH66-RS11190基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)又称2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，是人体八种必需氨基酸之一，具有促进身体正常生长，调节血糖，增强机体的免疫防护作用，抗中枢疲劳，抗外周疲劳，加快运动后机体的修复等作用，因此在食品、医药、化妆品行业具有广泛的应用及商业价值。而且L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，可以制备形成水凝胶，在组织工程、光化学、电化学等领域也已被广泛运用。由于L-缬氨酸含有特殊的生理功能，人自身不能合成，市场需求量大，使得L-缬氨酸的生产备受关注。目前，L-缬氨酸大都采用直接发酵法生产，发酵法生产的缬氨酸皆为L-型，无需旋光拆分，且具有原料成本低、反应条件温和、可大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法。工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。

目前随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用YH66-RS11190基因构建重组质粒、重组菌和/或提高L-缬氨酸的产量。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了核酸分子(名称为YH66-RS11190)的应用，所述应用可为下述任一种：

A1)所述核酸分子YH66-RS11190在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；

A2)所述核酸分子YH66-RS11190在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；

A3)所述核酸分子YH66-RS11190在制备L-缬氨酸中的应用；

所述核酸分子YH66-RS11190可为如下B1)或B2)：

B1)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

B2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

SEQ ID No.1所示的DNA分子即为本发明所述YH66-RS11190基因。

SEQ ID No.1所示的DNA分子(YH66-RS11190基因)编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明还提供了与所述核酸分子YH66-RS11190相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

C1)与所述核酸分子YH66-RS11190相关的生物材料在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；

C2)与所述核酸分子YH66-RS11190相关的生物材料在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；

C3)与所述核酸分子YH66-RS11190相关的生物材料在制备L-缬氨酸中的应用；

所述生物材料可为下述D1)至D3)中的任一种：

D1)含有所述核酸分子YH66-RS11190的表达盒；

D2)含有所述核酸分子YH66-RS11190的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；

D3)含有所述核酸分子YH66-RS11190的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物。

进一步地，所述应用可为通过对所述核酸分子YH66-RS11190进行改造，目的是提高微生物的L-缬氨酸的产量。

进一步地，所述应用还可为通过提高目的微生物中的所述核酸分子YH66-RS11190的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物，目的是提高微生物的L-缬氨酸的产量。

所述改造包括但不限于：碱基置换、碱基插入、碱基缺失或碱基修饰。

进一步地，所述改造可为点突变。

进一步地，所述点突变可为将YH66-RS11190基因(SEQ ID No.1)的第301位鸟嘌呤(G)进行突变(改造)。

进一步地，所述点突变可为将YH66-RS11190基因(SEQ ID No.1)的第301位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子。

本文中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastn作为程序进行检索，并对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

本文所述调控微生物的L-缬氨酸的产量可为提高或降低微生物的L-缬氨酸的产量(可为促进或抑制L-缬氨酸的生物合成)。

本发明还提供了一种提高微生物中L-缬氨酸的产量的方法，所述方法包括提高目的微生物中的所述核酸分子YH66-RS11190的表达量或含量，和/或，对所述目的微生物中的所述核酸分子YH66-RS11190进行突变(碱基置换、碱基插入或碱基缺失)，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。

所述突变是指通过定点突变改变基因中的某个或某几个碱基，导致对应的蛋白质氨基酸组成发生改变，产生新的蛋白质或使原蛋白质产生新的功能，即基因定点突变。基因的定点突变技术如寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变或盒式突变等是本领域技术人员所熟知的。

上述方法中，所述突变可为点突变(point mutation)，即单个核苷酸的突变。

本文所述点突变可为单碱基置换、单碱基插入或单碱基缺失，具体地可为单碱基置换。所述单碱基置换可为等位基因置换。

具体地，所述点突变可为将YH66-RS11190基因(SEQ ID No.1)的第301位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子。

上述方法中，所述点突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第101位的丙氨酸突变为苏氨酸，得到氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

E1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

E2)编码E1)所述蛋白质的核酸分子；

E3)SEQ ID No.3所示的编码E1)所述蛋白质的DNA分子；

E4)含有E2)或E3)所述DNA分子的表达盒；

E5)含有E2)或E3)所述DNA分子的重组载体、或含有E4)所述表达盒的重组载体；

E6)含有E2)或E3)所述DNA分子的重组微生物、或含有E4)所述表达盒的重组微生物、或含有E5)所述重组载体的重组微生物。

本文中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽胞杆菌属(Bacillus)等。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)但不限于此。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21260，或黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 15168。

本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的重组微生物生产L-缬氨酸。

上述方法中，所述方法可为发酵法制备L-缬氨酸，所述重组微生物可为棒杆菌属(Corynebacterium)，具体可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

在本发明的一个实施方案中，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260。

本发明还提供了一种构建本文中任一所述重组微生物的方法，所述方法包括至少下述任一种：

F1)将所述核酸分子YH66-RS11190导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F2)将SEQ ID No.3所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3)利用基因编辑手段(如单碱基基因编辑)对所述核酸分子YH66-RS11190进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

本发明还提供了所述生物材料在制备L-缬氨酸中的应用。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现YH66-RS11190基因参与了L-缬氨酸的生物合成，通过对YH66-RS11190基因进行过表达或敲除、或定点突变(如点突变)可以调控微生物的L-缬氨酸的产量。实验表明对YH66-RS11190基因编码区进行点突变及过表达，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。可利用YH66-RS11190基因来构建生产L-缬氨酸的基因工程菌种，以促进L-缬氨酸产量提高，培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，对L-缬氨酸的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。

保藏说明

菌种名称：谷氨酸棒杆菌

拉丁名：Corynebacterium glutamicum

菌株编号：YPFV1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得，并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。

实施例1构建包含点突变的YH66-RS11190基因编码区片段的重组载体

依据NCBI公布的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC15168基因组序列，设计并合成两对扩增YH66-RS11190基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的YH66-RS11190基因)的YH66-RS11190基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将YH66-RS11190基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第301位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的YH66-RS11190基因，名称为YH66-RS11190^G301A)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质YH66-RS11190)。

SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为YH66-RS11190^A101T)。所述突变蛋白质YH66-RS11190^A101T氨基酸序列(SEQID No.4)中的第101位苏氨酸(T)由丙氨酸(A)突变而来。

采用重叠PCR(Overlap PCR)技术进行基因定点突变，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGACAACCGTGACTTTGCGG 3'，

P2:5'AGCCCGAATAAAGCGTATTATCGACGCCAACCGC 3'，

P3:5'GCGGTTGGCGTCGATAATACGCTTTATTCGGGCT 3'，

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATCAGCGCGAAAACAGTGGC 3'。

构建方法：以黄色短杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为651bp和658bp的YH66-RS11190基因编码区的DNA片段(YH66-RS11190 Up和YH66-RS11190 Down)。

PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

将上述两条DNA片段(YH66-RS11190 Up和YH66-RS11190 Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增，得到大小为1274bp的DNA片段(名称为YH66-RS11190Up-Down，序列如SEQID No.5所示)。SEQ ID No.5所示的DNA片段中，第335-1236位(902bp)为含有突变位点的YH66-RS11190^G301A基因片段(即SEQ ID No.3的1-902位)。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

此DNA片段(YH66-RS11190 Up-Down，SEQ ID No.5)含有突变位点，导致菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中YH66-RS11190基因编码区的第301位鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白的第101位丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。将此DNA片段(YH66-RS11190Up-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化，与经过酶切(Xbal I/BamHI)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，用Xbal I/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-YH66-RS11190^G301A，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。将酶切正确的重组载体pK18-YH66-RS11190^G301A送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(G-A)的重组载体pK18-YH66-RS11190^G301A保存备用。

所述重组载体pK18-YH66-RS11190^G301A是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamHI识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1236位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pK18-YH66-RS11190^G301A含有SEQ ID No.3所示的突变的基因YH66-RS11190^G301A的第1-902位所示的DNA分子。

实施例2构建包含基因YH66-RS11190^G301A的工程菌株

构建方法：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-YH66-RS11190^G301A)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1244bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P5:5'TATCGCGGTG GTGTTGTCGG 3'，

P6:5'GCAACGCTGG CGTGAGCCAC 3'。

将得到的PCR扩增产物(278bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-YH66-RS111 90^G301A扩增片段为阳性对照，黄色短杆菌ATCC15168扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株YH66-RS11190基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(G-A)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPV-025。

重组菌YPV-025含有SEQ ID No.3所示的突变的基因YH66-RS11190^G301A。

表1培养基的组成和培养条件

表2SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

实施例3构建基因组上过表达YH66-RS11190基因或YH66-RS11190^G301A基因的工程菌株

依据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及YH66-RS11190或YH66-RS11190^G301A基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入YH66-RS11190或YH66-RS11190^G301A基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG CATGACGGCT GACTGGACTC3'，

P8:5'ACAGACTTTT TACTCATTAT AATCGGACTC CTTAAATGGG 3'，

P9:5'CCCATTTAAG GAGTCCGATT ATAATGAGTA AAAAGTCTGT 3'，

P10:5'CTATGTGAGT AGTCGATTTA TTAGACGGAA ATGGATTCCT 3'，

P11:5'AGGAATCCAT TTCCGTCTAA TAAATCGACT ACTCACATAG 3'，

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC TGCATAAGAA ACAACCACTT3'。

构建方法：分别以黄色短杆菌ATCC15168或YPV-025为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段806bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260YH66_RS03355基因及其启动子区或者是与上一个基因的间隔区，序列如SEQ IDNo.6所示)，YH66-RS11190基因及其启动子片段1324bp(序列如SEQ ID No.7所示)或YH66-RS11190^G301A基因及其启动子片段1324bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段783bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260YH66_RS03360基因及其与YH66_RS03355基因的部分间隔区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-YH66-RS11190OE、pK18-YH66-RS11190^G301AOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的整合质粒(pK18-YH66-RS11190OE、pK18-YH66-RS11190^G301AOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1488bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1536bp的菌为YH66-RS11190或YH66-RS11190^G301A基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂YH66_RS03355和下同源臂YH66_RS03360的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-026(不含突变点)和YPV-027(含突变点)。

重组菌YPV-026含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的YH66-RS11190基因；具体地，重组菌YPV-026是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂YH66_RS03355和下同源臂YH66_RS03360的间隔区替换为YH66-RS11190基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝YH66-RS11190基因的重组菌可以显著和稳定地提高YH66-RS11190基因的表达量。

重组菌YPV-027含有SEQ ID No.3所示的突变的YH66-RS11190^G301A基因；具体地，重组菌YPV-027是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂YH66_RS03355和下同源臂YH66_RS03360的间隔区替换为YH66-RS11190^G301A基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。

PCR鉴定引物如下所示：

P13:5'GTCCGCTCTG TTGGTGTTCA 3'(对应上同源臂YH66_RS03355的外侧)，

P14:5'CAGTTGCCGT GCGGACCTTG 3'(对应YH66-RS11190基因内部)，

P15:5'CGGGGGCGGG TTTGCTTGAG 3'(对应YH66-RS11190基因内部)，

P16:5'TGGAGGAATA TTCGGCCCAG3'(对应下同源臂YH66_RS03360的外侧)。

实施例4构建质粒上过表达YH66-RS11190基因或YH66-RS11190^G301A基因的工程菌株

依据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168基因组序列，设计并合成一对扩增YH66-RS11190或YH66-RS11190^G301A基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC ATAATGAGTA AAAAGTCTGT 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC TTAGACGGAA ATGGATTCCT 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。

构建方法：分别以YPV-025和YPV-026为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得YH66-RS11190基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.10所示)和YH66-RS11190^G301A基因及其启动子片段1354bp(序列如SEQ ID No.11所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-YH66-RS11190(含有YH66-RS11190基因)和pXMJ19-YH66-RS11190^G301A(含有YH66-RS11190^G301A基因)，将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的pXMJ19-YH66-RS11190和pXMJ19-YH66-RS11190^G301A质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1394bp片段的为阳性菌株，其被命名为YPV-028(不含突变点)和YPV-029(含突变点)。

重组菌YPV-028含有SEQ ID No.1所示的YH66-RS11190基因；

重组菌YPV-029含有SEQ ID No.3所示的突变的YH66-RS11190^G301A基因。

实施例5构建基因组上缺失YH66-RS11190基因的工程菌株

根据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168的基因组序列，合成两对扩增YH66-RS11190基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GCTCACCGAT ATTGCGGCGA 3'，

P20:5'AGACTCCTCG CAATTAGCGA CAAAGAAGTA ATCAGGACAG 3'，

P21:5'CTGTCCTGAT TACTTCTTTG TCGCTAATTG CGAGGAGTCT 3'，

P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCTCAGGATG CTGCTCTGAA3'。

构建方法：以黄色短杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得YH66-RS11190的上游同源臂片段684bp及YH66-RS11190的下游同源臂片段722bp。再用引物P19/P22进行Overlap PCR得到整个同源臂片段1366bp(序列如SEQ IDNo.12所示)。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔYH66-RS11190，将该质粒送测序。该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的敲除质粒pK18-ΔYH66-RS11190电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P23:5'GCTCACCGAT ATTGCGGCGA 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260YH66-RS11185基因内部)，

P24:5'GCTCAGGATG CTGCTCTGAA 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260YH66_RS11195基因内部)。

上述PCR同时扩增出大小1292bp及2540bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2540bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1292bp条带的菌株为YH66-RS11190基因编码区被敲除的阳性菌株YH66-RS11190。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株YH66-RS11190片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-030(谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的YH66-RS11190基因被敲除)。

实施例6L-缬氨酸发酵实验

将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验，采用高效液相色谱法测定缬氨酸含量。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对YH66-RS11190基因编码区进行点突变YH66-RS11190^G301A及过表达，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。

表3发酵培养基配方(其余为水)

成分	配方
		硫酸铵	14g/L
磷酸二氢钾	1g/L
		磷酸氢二钾	1g/L
硫酸镁	0.5g/L
		酵母粉	2g/L
硫酸亚铁	18mg/L
		硫酸锰	4.2mg/L
生物素	0.02mg/L
		维生素B1	2mg/L
antifoam(CB-442)消泡剂)	0.5mL/L
		70％葡萄糖(底糖)	40g/L

表4发酵控制工艺

表5L-缬氨酸发酵实验结果

菌株	OD<sub>610</sub>	L-缬氨酸产量(g/L)
			谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260	98.3	83.8
YPV-025	98.2	85.7
			YPV-026	97.4	84.9
YPV-027	97.2	85.6
			YPV-028	98.9	85.4
YPV-029	99.2	85.8
			YPV-030	97.7	82.3

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> YH66-RS11190基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1248

<212> DNA

<213> 黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）

<400> 1

atgctgtttt ccatgttctt cggagctgga aacctcatct tcccgccgat gcttggattg 60

tcggcaggaa ccaactatct accagctatc ttaggatttc tagcaacgag tgttctgctc 120

ccggtgctgg cgattatcgc ggtggtgttg tcgggagaaa atgtcaagga catggcttct 180

cgtggcggta agatctttgg cctggtgttt cctattgctg cctatttgtc catcggtgcg 240

ttttacgcgc tgccgaggac tggggcggtg agctattcga cggcggttgg cgtcgataat 300

gcgctttatt cgggcttgtt taactttgtg ttttttgcgg tggcactggc gttgtcgtgg 360

aatccgaatg gcattgcaga caagttgggt aagtggctca cgccagcgtt gctcacgttg 420

attgtggtgc tggtggtgtt gtcggtagcc aagttggatg gcacgccagg tgagccaagt 480

agtgcgtatg cgcagcagcc tgcgggggcg ggtttgcttg agggctacat gacgatggat 540

gcgattgctg cgttggcgtt tggcatcgtg gtgatttctg cgttcaagta ccaaaaggtt 600

aacaaggtcc gcacggcaac tgtcgtgtcg gcgttcattg ccggaatttt gttggcgctg 660

gtttatcttg gtttgggctc aatcggtcaa gtagtaaacg gtgagttcgc tgatggcacc 720

gcaattttga actacgctgc actgtccacg atgggtcagg ctggtcgcat catgttcgtg 780

gccattttga tccttgcatg tatgaccacc gcagttggtc tgatcagtgc gacgtctgag 840

tttttcaatt cgctgctgcc aggtgtcaag taccacgtct gggccactgt tttcgcgctg 900

atttcctttg gcgttgccac gatgggattg gatacggtgt tggccgttgc ggctccagtg 960

attagtttca tttacccatc ggccatcacc ttggtgttct tgtcgctcat cgagcccctg 1020

ctgttccgtc tcaagtggac ctacctattc ggcatttgga ctgcagttgt gtgggcgctg 1080

ttcatgtcta tccctgcgct gaatccattc atcgaatggg cgccgctgca cagcatgtct 1140

ttgggttggg ttgtcccagt tctcgtggcc tctgccatcg gtttggctat tgattggaac 1200

aagaaaggtg cccagtctgt tgcagagaag gaatccattt ccgtctaa 1248

<210> 2

<211> 415

<212> PRT

<213> 黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）

<400> 2

Met Leu Phe Ser Met Phe Phe Gly Ala Gly Asn Leu Ile Phe Pro Pro

1 5 10 15

Met Leu Gly Leu Ser Ala Gly Thr Asn Tyr Leu Pro Ala Ile Leu Gly

20 25 30

Phe Leu Ala Thr Ser Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Ile Ile Ala Val

35 40 45

Val Leu Ser Gly Glu Asn Val Lys Asp Met Ala Ser Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Ile Phe Gly Leu Val Phe Pro Ile Ala Ala Tyr Leu Ser Ile Gly Ala

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Leu Pro Arg Thr Gly Ala Val Ser Tyr Ser Thr Ala Val

85 90 95

Gly Val Asp Asn Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Asn Phe Val Phe Phe

100 105 110

Ala Val Ala Leu Ala Leu Ser Trp Asn Pro Asn Gly Ile Ala Asp Lys

115 120 125

Leu Gly Lys Trp Leu Thr Pro Ala Leu Leu Thr Leu Ile Val Val Leu

130 135 140

Val Val Leu Ser Val Ala Lys Leu Asp Gly Thr Pro Gly Glu Pro Ser

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Ala Gln Gln Pro Ala Gly Ala Gly Leu Leu Glu Gly Tyr

165 170 175

Met Thr Met Asp Ala Ile Ala Ala Leu Ala Phe Gly Ile Val Val Ile

180 185 190

Ser Ala Phe Lys Tyr Gln Lys Val Asn Lys Val Arg Thr Ala Thr Val

195 200 205

Val Ser Ala Phe Ile Ala Gly Ile Leu Leu Ala Leu Val Tyr Leu Gly

210 215 220

Leu Gly Ser Ile Gly Gln Val Val Asn Gly Glu Phe Ala Asp Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Tyr Ala Ala Leu Ser Thr Met Gly Gln Ala Gly Arg

245 250 255

Ile Met Phe Val Ala Ile Leu Ile Leu Ala Cys Met Thr Thr Ala Val

260 265 270

Gly Leu Ile Ser Ala Thr Ser Glu Phe Phe Asn Ser Leu Leu Pro Gly

275 280 285

Val Lys Tyr His Val Trp Ala Thr Val Phe Ala Leu Ile Ser Phe Gly

290 295 300

Val Ala Thr Met Gly Leu Asp Thr Val Leu Ala Val Ala Ala Pro Val

305 310 315 320

Ile Ser Phe Ile Tyr Pro Ser Ala Ile Thr Leu Val Phe Leu Ser Leu

325 330 335

Ile Glu Pro Leu Leu Phe Arg Leu Lys Trp Thr Tyr Leu Phe Gly Ile

340 345 350

Trp Thr Ala Val Val Trp Ala Leu Phe Met Ser Ile Pro Ala Leu Asn

355 360 365

Pro Phe Ile Glu Trp Ala Pro Leu His Ser Met Ser Leu Gly Trp Val

370 375 380

Val Pro Val Leu Val Ala Ser Ala Ile Gly Leu Ala Ile Asp Trp Asn

385 390 395 400

Lys Lys Gly Ala Gln Ser Val Ala Glu Lys Glu Ser Ile Ser Val

405 410 415

<210> 3