一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用
阅读说明：本技术 一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用 (Zinc-cadmium-resistant gene TmZRC1S derived from tuber melanosporum and application thereof ) 是由 王丽娟 姚泉洪 彭日荷 韩红娟 田永生 高建杰 许晶 付晓燕 王波 李振军 张福 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用,将来源于黑孢块菌的一个预测的锌转运蛋白基因序列GSTUMT00007113001按照植物密码子偏爱性进行改造,用基因合成法进行基因人工合成,获得核苷酸序列如SEQ ID No1所示的TmZRC1S基因,构建重组表达载体并转入拟南芥中,得到了具有较强锌镉抗性和锌镉富集能力的转基因拟南芥植株。经锌、镉溶液处理后,转基因株系的生长较野生型株系好,且转基因株系中的锌镉含量显著高于野生型株系,特别是地上部锌含量是野生型株系的3.74倍、镉含量是野生型株系的3.36倍,表明本发明改造合成的TmZRC1S基因具有提高植物抗和富集锌镉的能力,可用于培育富集锌镉的植物。(The invention discloses a zinc-cadmium resistant gene Tm ZRC1S derived from truffle and application. A predicted zinc transporter gene sequence GSTMTT 00007113001 derived from the truffle is transformed according to plant codon preference, gene artificial synthesis is performed by a gene synthesis method to obtain the Tm ZRC1S gene with a nucleotide sequence shown as SEQ ID No1, a recombinant expression vector is constructed and transferred into arabidopsis thaliana, and a transgenic arabidopsis thaliana plant with high zinc-cadmium resistance and zinc-cadmium enrichment capacity is obtained. After treatment with zinc and cadmium solutions, the transgenic plant grows better than a wild plant, the zinc-cadmium content in the transgenic plant is remarkably higher than that of the wild plant, particularly, the zinc content of the overground part is 3.74 times that of the wild plant, and the cadmium content is 3.36 times that of the wild plant. The transformed and synthesized Tm ZRC1S gene has the capacity of improving the zinc-cadmium resistance and enrichment capacity of the plant and can be used for cultivating the plant with enriched zinc and cadmium.)
技术领域
本发明属于培育富集锌镉植物技术领域，具体涉及一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用。
背景技术
长期以来，我国由于经济发展方式粗放、产业结构和布局不合理等原因，污染物排放总量居高不下，有近1/6的耕地遭受重金属污染，而且重金属污染问题正逐渐世界化，全球共有2亿多公顷耕地受到重金属污染影响，这对农产品质量安全和人体健康构成了严重威胁。根据美国国家地质局2013年1月发布的全球矿产统计数据，2012年中国镉产量为7000吨，占全球总产量的30.43%。2014年环境保护部和国土资源部发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，锌镉的点位超标率分别为0.9%和7%，其中土壤镉污染点位超标率居所有污染物之首，是所有土地利用类型（耕地、林地、草地、未利用地）主要污染物，锌则是金属冶炼类工业园区及其周边土壤的主要污染物（北方）。
土壤中的重金属污染治理成为研究的热点。常规的重金属污染土壤修复方法有物理修复和化学修复，是建立在土壤的理化性质与重金属各存差异的相关特征的基础上，采用化学或物理方法实现土壤中重金属的固定或分离，降低其污染影响。这些方法往往步骤复杂、所需成本高，且容易造成二次污染。而一些超累积植物对重金属的富集作用也引起了广泛关注，利用植物修复重金属污染土壤具有成本低、易操作、不破坏土壤结构等优点。
转运蛋白在植物对重金属的耐性及超积累作用机制中扮演重要角色，无论是重金属的高效吸收、转运，还是重金属的区隔解毒都离不开转运蛋白的参与。在已鉴定的金属离子转运蛋白中，研究得最多的关于锌离子吸收和转运的转运体是ZIP(Zn-regulated，Iron-regulated transporter-like Protein)蛋白家族和CDF(Cation Diffusion Factor)蛋白家族。总的说来，ZIP家族的主要功能是摄取锌，而CDF家族成员主要参与锌的外排及锌在细胞内的区室化以达到解毒或贮存的目的。锌可在转录水平和翻译水平调控两类转运体的活性以维持锌在细胞和生物体水平的内稳态。
TmZRC1S基因属于CDF家族，目前尚未见到将该基因用于植物耐锌镉方面的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于黑孢块菌（Tuber melanosporum）的耐锌镉基因TmZRC1S及应用，将该基因转入拟南芥中，提高转基因植株抗重金属锌、镉的能力，并提高转基因植株锌、镉的累积量，可用于培育提高锌镉抗性和富集能力的植物品种。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，它是根据植物偏爱密码子通过人工合成方法得到的，即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS）（Nucleic Acids Research，2004，32：e98）。
含有所述耐锌镉基因TmZRC1S的重组表达载体，还包括双35S启动子、GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。
本发明提供所述来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S在培育耐锌镉植物中的应用。优选地，所述耐锌镉植物为拟南芥。
一种将该耐锌镉基因TmZRC1S转入拟南芥中的方法，包括如下步骤：
1）重组表达载体BH440的构建
利用BamHI和SacI对PCR产物进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将本发明合成的TmZRC1S基因与含有双35S启动子的植物表达载体pCAMBIA-1301连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因TmZRC1S的重组表达载体BH440。
2）电击法转化农杆菌
利用电击法将构建好的重组表达载体BH440导入根癌农杆菌中，所述根癌农杆菌菌株为LBA4404。
3）农杆菌蘸花法转化拟南芥
利用农杆菌蘸花法将导入TmZRC1S基因的根癌农杆菌转化到拟南芥中（Clough etal., The plant journal，1998，16(6):735-743），利用50μg/ml潮霉素进行转化植株筛选，将在潮霉素板上正常生长的小苗进行移苗，收种，进行阳性苗鉴定。
本发明的来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S属于CDF家族，首次将来源于黑孢块菌的CDF家族基因进行改造，在拟南芥中转化后进行植物锌镉抗性研究，并验证了其锌镉富集能力。
构建重组表达载体并转入拟南芥中，得到了具有较强锌镉抗性和锌镉富集能力的转基因拟南芥植株。经锌、镉溶液处理后，转基因株系的生长较野生型株系好，且表明本发明改造合成的TmZRC1S基因具有提高植物抗和富集锌镉的能力，可用于培育富集锌镉的植物。
将本发明的TmZRC1S基因转入拟南芥，自交纯合2代，获得纯合转化株，收取种子播种，对幼苗进行锌、镉溶液浇灌，处理10天后对照野生型拟南芥生长受到很大影响，而含本发明TmZRC1S基因的拟南芥转基因植株生长良好，叶片多呈绿色，说明本发明的TmZRC1S基因可提高拟南芥的锌镉抗性。
将收获的纯合2代种子和野生拟南芥种子灭菌后播种于MS固体培养基上，10~14天后移出水培，用1/2 Hoagland营养液培养(每3天更换一次营养液)，对幼苗进行锌、镉溶液处理后测定野生型和转基因植株地上部和根部锌、镉含量，转基因株系中的锌镉含量显著高于野生型株系，特别是地上部锌含量是野生型株系的3.74倍、镉含量是野生型株系的3.36倍，表明本发明的TmZRC1S基因可提高拟南芥富集锌镉的能力。
本发明至少具有如下有益效果：
本发明根据植物偏爱密码子通过人工合成方法合成了一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S，并成功转化到拟南芥中高效表达，得到转基因拟南芥；转入TmZRC1S基因的拟南芥株系与野生型株系在锌镉抗性上有明显的差异，转基因株系可耐受25mM ZnSO4溶液或者5mM CdCl2溶液连续三次浇灌；在250μM ZnSO4或50μM CdCl2处理三天后，转基因株系中的锌镉含量显著高于野生型株系，特别是地上部锌含量是野生型株系的3.74倍、镉含量是野生型株系的3.36倍。
附图说明
图1为本发明含有TmZRC1S基因的重组表达载体BH440构建示意图
图2为本发明实施例4转基因拟南芥苗期的PCR电泳图，其中，WT为野生型植株，Tm3、Tm11、Tm12为转基因拟南芥的不同株系；
图3为转TmZRC1S基因拟南芥植株用锌、镉溶液处理10天后观察到的图片，其中，WT为野生型植株，Tm3、Tm11、Tm12为转基因拟南芥的不同株系。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 基因合成法合成来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S
根据来源于黑孢块菌（Tuber melanosporum）的一个预测的锌转运蛋白基因序列（GSTUMT00007113001，NCBI Sequence ID: XM_002839168.1），在保持其氨基酸序列不变的基础上，采取连续延伸PCR（Nucleic Acids Research, 2004, 32, e98）按照植物偏爱密码子人工合成获得耐锌镉基因TmZRC1S。设计44对引物用于TmZRC1S基因的人工合成，所设计的引物如下：
TmZRC1S-p1
GGATCCATGGCATTCTCTCGTTCTGCACGTATCATCACTCTGCTGGTCATTGACTCTCTG
TmZRC1S-p2
AGTGGACAGAGTAACCAACGATGATCTCCAACAGGAAGAACAGAGAGTCAATGACCAGCA
TmZRC1S-p3
TTCTTCCTGTTGGAGATCATCGTTGGTTACTCTGTCCACTCTCTTGCACTTGTTGCTGAC
TmZRC1S-p4
CAACCAGCAGGGAGAAGACGTCGTTCAGCATGTGGAAGGAGTCAGCAACAAGTGCAAGAG
TmZRC1S-p5
CGTTGGTTACTCTGTCCACTCTCTTGCACTTGTTGCTGACTCCTTCCACATGCTGAACGA
TmZRC1S-p6
CAGCTTGATTGCCCACAATGCAACCAGCAGGGAGAAGACGTCGTTCAGCATGTGGAAGGA
TmZRC1S-p7
CGTCTTCTCCCTGCTGGTTGCATTGTGGGCAATCAAGCTGGCACGTCAGAAGTCCACCTC
TmZRC1S-p8
GCACGTCAGAAGTCCACCTCCTCCTACACCTACGGTTGGCAACGTGCTGAAGTCCTTGGT
TmZRC1S-p9
CTCCTACACCTACGGTTGGCAACGTGCTGAAGTCCTTGGTGCACTGATCAACGGTGTCTT
TmZRC1S-p10
GATTGCTTCCAGGAAGATGGACAGACACAGTGCAAGCAAGAAGACACCGTTGATCAGTGC
TmZRC1S-p11
CTTGCTTGCACTGTGTCTGTCCATCTTCCTGGAAGCAATCCAGCGTTTCTTCGAACCACA
TmZRC1S-p12
AGAACCAACACCAAGGACCAACCAAGGAGTAGAGATTTCCTGTGGTTCGAAGAAACGCTG
TmZRC1S-p13
GGAAATCTCTACTCCTTGGTTGGTCCTTGGTGTTGGTTCTGCTGGTCTTGCATCCAACAT
TmZRC1S-p14
ATGAGAGTGACCATGATCATGGAACAAGAACAAACCCAGGATGTTGGATGCAAGACCAGC
TmZRC1S-p15
CCTGGGTTTGTTCTTGTTCCATGATCATGGTCACTCTCATGGTGGTAACTCCCATGAACA
TmZRC1S-p16
AGCAGCAGACTCCTCACCAACAAGAGAGGACTCAAGATCGTGTTCATGGGAGTTACCACC
TmZRC1S-p17
CGATCTTGAGTCCTCTCTTGTTGGTGAGGAGTCTGCTGCTGCTGGTCATGAGCACCACAA
TmZRC1S-p18
AGCAGGATCATGGATGTGACCACGCAGACCACGAGTGTGTTTGTGGTGCTCATGACCAGC
TmZRC1S-p19
ACACACTCGTGGTCTGCGTGGTCACATCCATGATCCTGCTGAAGATGATCGTGGTGACAT
TmZRC1S-p20
TGCACGTTTACGACCAACGATGTCAGGCAGGATGTCGTCGATGTCACCACGATCATCTTC
TmZRC1-p21
CGACGACATCCTGCCTGACATCGTTGGTCGTAAACGTGCATACTCTCGTTCCTGCCATCA
TmZRC1S-p22
AGAGGACTTGTTCTCCTTTGGCTTTGCATGGTTGTGGTTCTGATGGCAGGAACGAGAGTA
TmZRC1S-p23
GAACCACAACCATGCAAAGCCAAAGGAGAACAAGTCCTCTCACTCCCATCAGAACCTGAA
TmZRC1S-p24
CAGTGCATCACCAAGAACATGCAGGAAGACACCACGCATGTTCAGGTTCTGATGGGAGTG
TmZRC1S-p25
CATGCGTGGTGTCTTCCTGCATGTTCTTGGTGATGCACTGGGTAACGTTGGTGTCATGTC
TmZRC1S-p26
CCAGATGGTCTCAGGCAGAAGAAGCAGAGCACCAGCAACGGACATGACACCAACGTTACC
TmZRC1S-p27
CGTTGCTGGTGCTCTGCTTCTTCTGCCTGAGACCATCTGGTGGCGTCATCTGCTGGACCC
TmZRC1S-p28
AGAGGAGAAGATGATCATGGTGATCAGCAGAGAGATGGATGGGTCCAGCAGATGACGCCA
TmZRC1S-p29
ATCCATCTCTCTGCTGATCACCATGATCATCTTCTCCTCTGCACTGCCACTGTGCAAGTC
TmZRC1S-p30
GATACCCTTAGGAACACCTTGAAGCAAGATTTTGGATGCAGACTTGCACAGTGGCAGTGC
TmZRC1S-p31
TGCATCCAAAATCTTGCTTCAAGGTGTTCCTAAGGGTATCTCTCTGGAGGAAGTCAAAGA
TmZRC1S-p32
TTCGTGGACGGATTCGACACCTTGGATGGATGCGATGTCTTCTTTGACTTCCTCCAGAGA
TmZRC1S-p33
AGACATCGCATCCATCCAAGGTGTCGAATCCGTCCACGAACTGCACATCTGGCAACTGTC
TmZRC1S-p34
TGCGATCTGGATGTGCAGAGATGCGATCATCTTGACGTCGGACAGTTGCCAGATGTGCAG
TmZRC1S-p35
CGACGTCAAGATGATCGCATCTCTGCACATCCAGATCGCATTCGATCCTGAGTGCGAAGG
TmZRC1S-p36
GGTACGGACTGCGTTTGCAAGTTGCATGTAACGACCACCACCTTCGCACTCAGGATCGAA
TmZRC1S-p37
TGGTGGTCGTTACATGCAACTTGCAAACGCAGTCCGTACCTGCCTTCATGCATACGGTAT
TmZRC1S-p38
CTCTTCTTTGGTGTACTCAGGCTGAATGGTGGAGGAGTGGATACCGTATGCATGAAGGCA
TmZRC1S-p39
CCACTCCTCCACCATTCAGCCTGAGTACACCAAAGAAGAGGAAGCTGCTGCATCTCGTAC
TmZRC1S-p40
ACATGCAGCCTCTTCTTCAGTGCCACCACGAGTAGAGCCAGTACGAGATGCAGCAGCTTC
TmZRC1S-p41
TGGCTCTACTCGTGGTGGCACTGAAGAAGAGGCTGCATGTCTGTTGGAATGTGGTGATGG
TmZRC1S-p42
AGCACCAGAACCAGGTGCACAGCACTTACCGTCAACGCAACCATCACCACATTCCAACAG
TmZRC1S-p43
TTGCGTTGACGGTAAGTGCTGTGCACCTGGTTCTGGTGCTCCTGGTGATGAAGTCATCGG
TmZRC1S-p44
GAGCTCTTAACCGATGACTTCATCACCAGGAGCACCAGAACCAGGTGCACAGCACTTACC
利用PCR进行锌转运蛋白基因扩增，在100µl反应体系中，TmZRC1S-p2至TmZRC1S-p43共44个内侧引物的添加量为2ng，外侧引物TmZRC1S-p1和TmZRC1S-p44添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。
PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10µl直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，经序列测定和BLAST比对，基因合成法合成的基因与黑孢块菌中GSTUMT00007113001基因所编码的氨基酸序列完全一致，即为本发明的来源于黑孢块菌的TmZRC1S基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
实施例2 含TmZRC1S基因植物表达载体构建
分别用BamHI和SacI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将TmZRC1酶基因与含有双35S启动子的pCAMBIA-1301载体连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有TmZRC1S基因的重组质粒BH440，如图1所示。该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。
实施例3 农杆菌培养和电转化
农杆菌菌株为根癌农杆菌LBA4404菌株。将实施例2获得的的重组表达载体BH440经电击法导入农杆菌LBA4404中。挑取单菌到25ml YEB培养基（50mg/l利福平）培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基（50mg/l利福平），培养至OD600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10%甘油悬浮菌体，转到50ml 离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl10%甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管，得到农杆菌感受态细胞。取70μl感受态细胞，加入1μl重组表达载体BH440，用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取200μl涂抗性板28℃培养过夜，以筛选出成功导入重组表达载体BH440的菌株。
实施例4 拟南芥蘸花法转化
将筛选出的农杆菌菌株单菌落接种于5ml含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5ml菌液转到500ml的液体LB培养基中28℃培养16-24小时（OD=1.5-2.0），室温下离心收集菌体，5000rpm离心10分钟。用等体积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02%的 Silwet-77混匀后转移到烧杯中，得到转化菌液。每个菌株用300ml转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。将拟南芥（哥伦比亚型，ecotype columbia）种子倒置后浸入转化菌液中10秒钟，莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液控干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子。利用50μg/ml潮霉素进行转化植株筛选，将在潮霉素板上正常生长的小苗进行移苗，收种，进行阳性苗鉴定。
取生长至3周的拟南芥叶片提取总RNA，反转录为cDNA，以R45425-（TCCGACGTCAAGATGATCGCA）和R45426-（ACCGATGACTTCATCACCAGG）为引物对转化植株进行PCR检测（参见《分子克隆实验指南》，Sambrook and Russell，2001），扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，4min。共25个循环，以拟南芥Actin基因为内参，结果如图2所示。从图中可以看到野生型植株中都没有检测到目的条带，而转基因植物中都有目的条带，证明这些株系都是阳性苗，说明目的基因已成功导入拟南芥并在转录水平表达。
实施例5 转TmZRC1S基因拟南芥的锌镉抗性实验
将上述已成功转入目的基因的拟南芥转基因植株自交纯合2代，获得纯合转化株，收取种子，播种到土壤中，同时培养野生型植株作为对照实验。将22℃生长大约3周的幼苗每隔三天灌入50ml 25mM ZnSO4溶液或者5mM CdCl2溶液，处理10天后观察拟南芥生长情况。具体实验结果如下：在经过25mM ZnSO4溶液或者5mM CdCl2溶液处理后，对照野生型拟南芥叶片几乎多呈黄色，而含本发明目的基因的拟南芥转基因植株生长良好，叶片多呈绿色，如图3所示。说明本发明的TmZRC1S基因可提高植物的锌镉抗性。
实施例6 转TmZRC1S基因拟南芥的锌镉富集
将收获的纯合2代种子和野生拟南芥种子灭菌后播种于MS固体培养基上，10~14天后移出水培，用1/2 Hoagland营养液培养(每3天更换一次营养液)，接着加入不同浓度的重金属（250μM ZnSO4或50μM CdCl2）培养3天，收获植株，先用去离子水清洗杂质，再用5 mMCaCl2浸泡15min，接着用水清洗3次，吸水纸吸干表面水分后分为地上部和根部分别置于信封中，最后放入烘箱中，先105℃杀青15min，然后65℃烘干至恒重。以不加任何重金属为对照，每个处理3个重复。用ICP-MS (Agilent 7700 ICP-MS, USA)测定野生型和转基因植株地上部和根部锌、镉含量，如表1所示。
表1 重金属离子处理后野生型与转TmZRC1S基因拟南芥的锌镉含量
实验结果表明，转TmZRC1S基因拟南芥植株地上部锌含量显著高于野生型植株，是野生型植株的3.74倍；根部锌含量有同样的趋势，转化株系根部锌含量相对野生型植株显著增加80%。转TmZRC1S基因拟南芥植株地上部镉含量是野生型植株的3.36倍，转化株系根部镉含量相对WT增加25%。说明本发明的TmZRC1S基因可提高植物富集锌镉的能力。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcattct ctcgttctgc acgtatcatc actctgctgg tcattgactc tctgttcttc 60
ctgttggaga tcatcgttgg ttactctgtc cactctcttg cacttgttgc tgactccttc 120
cacatgctga acgacgtctt ctccctgctg gttgcattgt gggcaatcaa gctggcacgt 180
cagaagtcca cctcctccta cacctacggt tggcaacgtg ctgaagtcct tggtgcactg 240
atcaacggtg tcttcttgct tgcactgtgt ctgtccatct tcctggaagc aatccagcgt 300
ttcttcgaac cacaggaaat ctctactcct tggttggtcc ttggtgttgg ttctgctggt 360
cttgcatcca acatcctggg tttgttcttg ttccatgatc atggtcactc tcatggtggt 420
aactcccatg aacacgatct tgagtcctct cttgttggtg aggagtctgc tgctgctggt 480
catgagcacc acaaacacac tcgtggtctg cgtggtcaca tccatgatcc tgctgaagat 540
gatcgtggtg acatcgacga catcctgcct gacatcgttg gtcgtaaacg tgcatactct 600
cgttcctgcc atcagaacca caaccatgca aagccaaagg agaacaagtc ctctcactcc 660
catcagaacc tgaacatgcg tggtgtcttc ctgcatgttc ttggtgatgc actgggtaac 720
gttggtgtca tgtccgttgc tggtgctctg cttcttctgc ctgagaccat ctggtggcgt 780
catctgctgg acccatccat ctctctgctg atcaccatga tcatcttctc ctctgcactg 840
ccactgtgca agtctgcatc caaaatcttg cttcaaggtg ttcctaaggg tatctctctg 900
gaggaagtca aagaagacat cgcatccatc caaggtgtcg aatccgtcca cgaactgcac 960
atctggcaac tgtccgacgt caagatgatc gcatctctgc acatccagat cgcattcgat 1020
cctgagtgcg aaggtggtgg tcgttacatg caacttgcaa acgcagtccg tacctgcctt 1080
catgcatacg gtatccactc ctccaccatt cagcctgagt acaccaaaga agaggaagct 1140
gctgcatctc gtactggctc tactcgtggt ggcactgaag aagaggctgc atgtctgttg 1200
gaatgtggtg atggttgcgt tgacggtaag tgctgtgcac ctggttctgg tgctcctggt 1260
gatgaagtca tcggttaa 1278
<210> 2
<211> 425
<212> PRT
<213> 黑孢块菌(Tuber melanosporum)
<400> 2
Met Ala Phe Ser Arg Ser Ala Arg Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Asp
1 5 10 15
Ser Leu Phe Phe Leu Leu Glu Ile Ile Val Gly Tyr Ser Val His Ser
20 25 30
Leu Ala Leu Val Ala Asp Ser Phe His Met Leu Asn Asp Val Phe Ser
35 40 45
Leu Leu Val Ala Leu Trp Ala Ile Lys Leu Ala Arg Gln Lys Ser Thr
50 55 60
Ser Ser Tyr Thr Tyr Gly Trp Gln Arg Ala Glu Val Leu Gly Ala Leu
65 70 75 80
Ile Asn Gly Val Phe Leu Leu Ala Leu Cys Leu Ser Ile Phe Leu Glu
85 90 95
Ala Ile Gln Arg Phe Phe Glu Pro Gln Glu Ile Ser Thr Pro Trp Leu
100 105 110
Val Leu Gly Val Gly Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ile Leu Gly Leu
115 120 125
Phe Leu Phe His Asp His Gly His Ser His Gly Gly Asn Ser His Glu
130 135 140
His Asp Leu Glu Ser Ser Leu Val Gly Glu Glu Ser Ala Ala Ala Gly
145 150 155 160
His Glu His His Lys His Thr Arg Gly Leu Arg Gly His Ile His Asp
165 170 175
Pro Ala Glu Asp Asp Arg Gly Asp Ile Asp Asp Ile Leu Pro Asp Ile
180 185 190
Val Gly Arg Lys Arg Ala Tyr Ser Arg Ser Cys His Gln Asn His Asn
195 200 205
His Ala Lys Pro Lys Glu Asn Lys Ser Ser His Ser His Gln Asn Leu
210 215 220
Asn Met Arg Gly Val Phe Leu His Val Leu Gly Asp Ala Leu Gly Asn
225 230 235 240
Val Gly Val Met Ser Val Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu Thr
245 250 255
Ile Trp Trp Arg His Leu Leu Asp Pro Ser Ile Ser Leu Leu Ile Thr
260 265 270
Met Ile Ile Phe Ser Ser Ala Leu Pro Leu Cys Lys Ser Ala Ser Lys
275 280 285
Ile Leu Leu Gln Gly Val Pro Lys Gly Ile Ser Leu Glu Glu Val Lys
290 295 300
Glu Asp Ile Ala Ser Ile Gln Gly Val Glu Ser Val His Glu Leu His
305 310 315 320
Ile Trp Gln Leu Ser Asp Val Lys Met Ile Ala Ser Leu His Ile Gln
325 330 335
Ile Ala Phe Asp Pro Glu Cys Glu Gly Gly Gly Arg Tyr Met Gln Leu
340 345 350
Ala Asn Ala Val Arg Thr Cys Leu His Ala Tyr Gly Ile His Ser Ser
355 360 365
Thr Ile Gln Pro Glu Tyr Thr Lys Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ser Arg
370 375 380
Thr Gly Ser Thr Arg Gly Gly Thr Glu Glu Glu Ala Ala Cys Leu Leu
385 390 395 400
Glu Cys Gly Asp Gly Cys Val Asp Gly Lys Cys Cys Ala Pro Gly Ser
405 410 415
Gly Ala Pro Gly Asp Glu Val Ile Gly
420 425