具体实施方式

实施例1：MoERS1基因的分离和克隆

稻瘟病菌与水稻互作过程中，会分泌大量的效应子抑制寄主的免疫反应，促进稻瘟病菌侵染。我们前期通过外泌蛋白质组学分析，鉴定到一系列外泌相关基因，包括MoERS1基因，可能作为毒性效应子抑制寄主免疫。为了研究该基因的功能，我们从稻瘟病菌基因组数据库https://fungidb.org/fungidb/app/record/gene中获得编码登录号为MGG_13009的基因预测核酸序列，网站预测的基因组核苷酸序列显示该基因有两段内含子和三段外显子。为了验证这个预测的结果，我们从稻瘟病菌野生型菌株Guy11的cDNA中，利用引物F1/R1和F2/R2分别克隆MoERS1基因，发现F1/R1不能克隆到MoERS1基因，F2/R2成功克隆到了MoERS1基因，大小为645bp（图1中A和B）实验结果表明网站预测的结果有误，MoERS1基因只有一个内含子，因此其cDNA序列会提前终止；同时，我们将克隆到的MoERS1基因的cDNA序列连接到pMD19-T(Takara Co, China)载体上，进行了测序（图1中C），表明网站公布的MoERS1基因的cDNA序列有误；MoERS1基因的cDNA序列见SEQ ID No.2，氨基酸序列见SEQ ID No.1。所用引物序列详见表1。

表1 说明书中所用到的引物

实施例2：MoERS1基因的敲除

1、MoERS1基因敲除载体的构建

以稻瘟病菌野生型菌株Guy11为模板，分别利用引物ERS1-p1-F/ERS1-p2-R和ERS1-p3-F/ERS1-p4-R扩增MoERS1基因的约1 kb上游旁侧序列和约1 kb下游旁侧序列，ERS1-p2/ ERS1-p3引物包含EcoR V酶切位点。利用ERS1-p1-F/ERS1-p4-R，将两段旁侧序列连接起来，克隆的2 kb片段纯化后构建到pMD19-T载体上。潮霉素HPH基因约1.4 kb利用FL1111/FL1112扩增，并用EcoR V将片段插入到pMD-MoERS1质粒中。3.4 kb的片段用ERS1-p1-F/ERS1-p4-R应物扩增用于原生质体转化。所用引物序列详见表1。

上文中的约1kb上游旁侧序列具体为（如SEQ ID No.3所示）：

GTGTGCGTACGACAATGCTTGCCTGTTTGCCCATCTGTCTCGGGCTCCTCGTCATTTGTGTGAAAAGCGTCTGTTTGCAACGACGCAATGAGTCAACAGTACAAATTATAAGCTATAGTGAAGATGAAGCGAATGCCTGGTACGATAAACCTGTCGTGCCAAGGTAGAATTGACGAAGCCTTGCCTTGATCGATCGTCCAAGTTCAACATCATGTGAACAGAGCCCGTATGCAACCTGGTTGGCCCCCGATGCTTGTGCCATTCCTTGGCCCCAAGAACGTCAAGAGTAAAAAGCTAATCGGACACGACGGGTCCGATGAGACATGGTGAGAAGTTAGTGTTAGCTAAGACCAGGGGAGATCGAGAGCTGCAGCCTTGCCCCGCAGAACGGTAAATTCCCCAAACGAGCTAGACCAGTCCCTTCGCTCAAATACGCCCCTGGGCTGACGAGAAGGACCACACATGCCACTATGTACAGGACCCGGTATAATGTAATTGAGAGAAGGCTGCCTAAGCGCTAAACAAAATGGTCCAGTCGGGGCGAATTCAAGGTAAACGAACATACGGAATAATGGAAGAACTGGCTACCAGGAAGGATCATTAACCTCCACCTGCACCCCCTGAAAGACGAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCAGCGGCACAGTCGCCAAGGGTGGTGATTTTCCCCATTCCATCGTTGGCTCTTTCCTGCACGAGCTGATCCACCACTGTTCGAGATTTGATTCCCCTGCCTGGTCGGGCATGGAACTTCTGGTAATGATGTACCGTAGACCGAATGGCCCTCAATGTGGTTCCGCAAATCTGTAAATTGCCATCAGGCAACAGGCGGGCAAGCCGGGTGTACCGATGGCGAACAGGATAAATACCCCTCGACCGTCCTCGACTTGAATCCCAGGTAGAAGGAAGAGACAGCACTCGCCACAGCTCCTCTGACATTCGCTTTCCCATCGCCCACAACATTTGGCCCTGCTCTCATTCCTTGGGTTGATTTTTTTTCTTTTCTTTCGCAAGCACCGAAAACTTTAGTCAAA

上文中的约1kb下游旁侧序列具体为（如SEQ ID No.4所示）：

GCCTGACATAACATTTTGCTGGGTAATCGGTTCAACATGTGAGCATTGCGTGATGTTTACCCTGTATTTTTACAGGTATACAGGGTGGACGTGGAAGCAAACACCCAGCTCCCGTCGGTCTGAGAGCATGAATGCCAATGTTGTGCAGCATGATGGATCGCTGCCTGGTTCTAGAATATATAGCAAGTACCGTACGGAAGACATGCTTCAGATATGGGTACTTCGAATAGATAGCCTGGGTCAGGTAGCACAGATGGGCAGGGTTGGTTCATGAGCACGAGTCAATTTAATGTAAATGATTTGACGATACCCCGGATTACTGCGCCGTTTGGGTTTATGCATGTCGCCTAAACGCAACATGTAGTCCGCAAACGCTCCGTAACCCATGAGAGGCTGCTGCACTTTTGCTGCTTTGTTTGCCAACATCTGAGACCCCCCGACCAGTCATGTCTGCTCGGTTGCATGTGCGTTGCAAGGAATGTCAGTCAACAAAGTCCATCAAACGTGAACCGAATCCAACGTCAACAAGCAATGTTATCTCGCTGCCATCTGCCATCTGCCATCTGGGTATCTGCGCGTCAACCCTGAGCTACTAGCCCCACCGCCTTTGGCCCACGGCTTTTCTCGGTTGGTGGGCGCTAAGTATAATGAATTCGGTCAGCTTTGGCCCCAACCAGGTTGTTTGTTAACAAGCTAGATCCATGTACCAAATGTAAACAAATACTACTCTGAGCCATCACACCGTCAACCGGAACCAGGCTTGCTAGGCACGAAGTAATCATCTCTCGGCAAGGAAGAAGAAAAACAAAAAAAAAAAAACCCTGGCGCGGGCACCGGCGGGGTGATGATGGAATTTTGCGGGAACAAAGATACAGTAGGCAGTCGGACACAAGGCAAGCGAAATGGGCAGGCGGGGCAGCTGTAGCAGTACCATCGATGACGCTTCTTGATAAGGTACTGTGATCAAGCTACCTAGGTACGGTATGGCTTACCGTAGGACGAACGGTG

上文中的约1.4kb潮霉素基因序列具体如下（如SEQ ID No.5所示）：

GGAGGTCAACACATCAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTCCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCATGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCCTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGCCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAG。

2、MoERS1基因敲除突变体的获得

1）培养基的配置

CM培养基配置方法：量取20×硝酸盐(120g硝酸钠,10.4g氯化钾，10.4g七水硫酸镁，30.4g磷酸二氢钾，加蒸馏水溶解至1L) 50ml，1000×微量元素(2.2g七水硫酸锌，1.1g硼酸，0.5g四水氯化锰，0.5g七水硫酸铁，0.17g六水氯化钴，0.16g五水硫酸铜，0.15g二水锰酸钠，5g EDTA四钠，加蒸馏水溶解至100ml) 1ml，维生素溶液(0.01g生物素，0.01g维生素B6，0.01g维生素B1，0.01核黄素，0.01对氨基苯甲酸，0.01烟酸，加蒸馏水溶解至100ml)1ml，称取葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母提取物1g，酪蛋白氨基酸1g，琼脂粉15g，加蒸馏水定量至1L，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

产孢培养基配置方法：用玉米粉和水稻秆配制，称取100g水稻秆加入1L水煮沸30分子，再加入40g玉米粉和15g琼脂粉煮沸20分钟，最后用蒸馏水定容到1L，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

1×STC的配置方法：称取质量体积比为20%的蔗糖，称取50 mM的Tris•Cl PH8.0，50 mM的氯化钙，加蒸馏水定量至1L，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

TB3培养基配置方法：称取3g 酵母提取物，3g Casamino Acids和20%的蔗糖，加蒸馏水定量至1L，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

PTC的配置方法：称取60% PEG4000溶解在1×STC，用细菌过滤器过滤后备用。

酶液的配制：用 0.7 M NaCl 溶液溶解酶(lysing Enzymes from Trichoderma

harzianum, sigma)，酶液浓度为 7.5-10 mg/ml，过滤除菌，现配现用。

2）原生质体的制备(Protoplasting)

a、活化菌株：接种菌丝块于 CM 平板上生长 3-4 d，菌落直径约 3 cm。注意菌株不宜太老

b、切取直径约 3 cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100 ml CM 或 5×YEG 的液体培养基中(含 50 µg/ml Amp)， 28℃、 150 rpm 振荡培养 2 d (36-48 h)。

c、 1-2 层Miracloth过滤收集菌丝，无菌水冲洗两遍，用吸水纸将水稍吸干。

d、将菌丝置于盛有 10-20 ml 酶液(含 50 µg/ml Amp)的 50 ml 离心管中酶解。离心管平躺， 30℃、 60 rpm 振荡 1.5-2 h 酶解。酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体释放情况。

e、以下步骤于 4℃下完成，0.7 M NaCl 溶液，1× STC 先放于 4℃预冷。

f、取出酶解液，加少许 0.7 M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，用 0.7 M NaCl 溶液轻轻冲洗 1-2 次，去残渣，收集滤液于 50 ml 离心管中。

g、离心， 3000 rpm、 4℃离心 10 min。

h、小心弃上清，加 10-20 ml 1×STC 悬浮，用剪去尖头的枪头轻轻吹打，然后3000 rpm、 4℃离心 10 min。

i、重复步骤h两次。

j、加适量(约 300 µl)1×STC 悬浮，计数，使原生质体终浓度为 108 个/ml，分装为 150 µl/管。立即转化或保存于-70℃ (一般不保存,如果需保存的话请加7%的 DMSO)。

3) 稻瘟病菌转化

a、将 2 µg DNA(5-10 µl)加于 150 µl 原生质体中，轻轻混匀，室温静置 25minDNA浓度需足够大，且要干净。

b、分 2-3 次加 1 ml PTC，轻轻混匀，室温静置 25 min。静置时间不宜过长， PTC对原生质体有毒性。加好后去解冻 TB3 固体培养基。

c、把原生质体加到 10 ml 左右熔化后冷却至 45-50℃的 TB3 固体培养基中(含50 µg/ml Amp)，轻轻混匀后倒入培养皿中。置于 28℃、黑暗培养 24 h

Optional: 或原生质体加到 5-10 ml TB3 (含 50 µg/ml Amp)液体中，28℃，轻轻振荡培养过夜。

d、往培养皿中再倒入10 ml含300 µg/ml Hygromycin B/Bleomycin的TB3 固体培养基(含 50 µg/ml Amp)。

e、 28℃下黑暗培养 7-10 d，一般 5 d 后即可看出转化是否成功。

f、待上述转化子菌落直径约 5 mm 时，从菌落上挑取小块菌丝块移置含 150 µg/ml Hygromycin B/Bleomycin 的 CM 固体培养基中进行筛选转化子。

g、进一步采用 PCR 验证转化子和Southern验证，所用内部探针用引物ERS1-p5-F/ERS1-p6-R，HPH探针用FL1111/FL1112扩增。

h、分析突变体的表现型。

通过上述方法成功的在野生型菌株Guy11中获得了MoERS1基因的敲除突变体，命名为ΔMoers1（图2）。ΔMoers1突变体致病力和抑制寄主免疫等表型详见实施列5至实施例8。

实施例3：互补载体的构建

用引物ERS1-p7-F/ERS1-p8-R扩增，包含上游约1.5 kb自身启动子，将片段通过酵母转化插入pYF11载体中（博来霉素抗性），形成pYF11-MoERS1载体。并通过原生质体转化将该载体导入ΔMoers1突变体中，获得ΔMoers1/ MoERS1的互补菌株。转化子首先根据表型来筛选，再用PCR验证，最后根据致病性、生长及其它表型测定验证互补情况。

上文中的约1.5kb启动子序列具体如下（如SEQ ID No.6所示）：

CATATAGGTAGACATATCTTGGGGTATTCGACCCGAAGCTGATCTTTTCTCCCCTCCAAAAACAGTGTGCGGATGTGCCGTCGGTGTAGCGACCGCCGAAGTATCGGGGTTAATAGCGAGACCAGGTCCGACCGGAACTGCCTCCGTCTCGGCGTCATATTCTTACATGAGCGGCAGCGGCTTCTCCGTGGTCTCATCCTTGACGGTCATCAACAAAGCGGCCTCCGGTACCGCAACGCCAAGCTTCATGCCCCAGGTAGACCAACCGAGCCAAATGGTGCCAATCCACAAGAGAGACGTCGAGGAAGACCACGAACCGCCAAAGAGCTTCGAACCGGCTAACAAGGCCGCAGTACAGGCCAGCTCCGGGACGTCGTCTAGTCATTACGGAAATATGCGTATTTCGGGTTGGGTCATATCGGTTGTACCTACATTGTTGGTTGGTCTGATTGTATAGAAAGAAAAGAAGAGAAAGAGGAAAAAGAAAGAAAAAAAAGGGTGAAATACGGGGATCAAGGAAAGTGTGCGTACGACAATGCTTGCCTGTTTGCCCATCTGTCTCGGGCTCCTCGTCATTTGTGTGAAAAGCGTCTGTTTGCAACGACGCAATGAGTCAACAGTACAAATTATAAGCTATAGTGAAGATGAAGCGAATGCCTGGTACGATAAACCTGTCGTGCCAAGGTAGAATTGACGAAGCCTTGCCTTGATCGATCGTCCAAGTTCAACATCATGTGAACAGAGCCCGTATGCAACCTGGTTGGCCCCCGATGCTTGTGCCATTCCTTGGCCCCAAGAACGTCAAGAGTAAAAAGCTAATCGGACACGACGGGTCCGATGAGACATGGTGAGAAGTTAGTGTTAGCTAAGACCAGGGGAGATCGAGAGCTGCAGCCTTGCCCCGCAGAACGGTAAATTCCCCAAACGAGCTAGACCAGTCCCTTCGCTCAAATACGCCCCTGGGCTGACGAGAAGGACCACACATGCCACTATGTACAGGACCCGGTATAATGTAATTGAGAGAAGGCTGCCTAAGCGCTAAACAAAATGGTCCAGTCGGGGCGAATTCAAGGTAAACGAACATACGGAATAATGGAAGAACTGGCTACCAGGAAGGATCATTAACCTCCACCTGCACCCCCTGAAAGACGAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCAGCGGCACAGTCGCCAAGGGTGGTGATTTTCCCCATTCCATCGTTGGCTCTTTCCTGCACGAGCTGATCCACCACTGTTCGAGATTTGATTCCCCTGCCTGGTCGGGCATGGAACTTCTGGTAATGATGTACCGTAGACCGAATGGCCCTCAATGTGGTTCCGCAAATCTGTAAATTGCCATCAGGCAACAGGCGGGCAAGCCGGGTGTACCGATGGCGAACAGGATAAATACCCCTCGACCGTCCTCGACTTGAATCCCAGGTAGAAGGAAGAGACAGCACTCGCCACAGCTCCTCTGACATTCGCTTTCCCATCGCCCACAACATTTGGCCCTGCTCTCATTCCTTGGGTTGATTTTTTTTCTTTTCTTTCGCAAGCACCGAAAACTTTAGTCAAA。

实施例4：效应子MoErs1在水稻中的亚细胞定位观察

1、荧光表达载体的构建

从稻瘟病菌野生型菌株Guy11的基因组中克隆MoERS1的全长基因，包括1.5 kb自身启动子，融合表达荧光蛋白编码基因RFP或者RFP-NLS（核定位序列），通过酵母同源重组导入到pYF11载体中，形成pYF11-MoERS1-RFP和pYF11-MoERS1-RFP-NLS的载体。通过稻瘟病菌原生质体转化，将载体导入到ΔMoers1突变体中，通过实施例2中的稻瘟病菌转化方法获得荧光表达菌株。

2、效应子MoErs1在水稻中的亚细胞定位观察

产孢培养基配置方法详见实施例2。采用稻瘟病菌孢子液注射接种水稻叶片的方法，具体方法如下：

1）首先诱导稻瘟病菌产生分生孢子，将CM培养基上的稻瘟病菌Guy11菌丝块接种到SDC培养基上，28℃黑暗培养4天，然后将表面菌丝刮掉，黑光灯下诱导3天，即可获得分生孢子。

2）温室培养20天的水稻苗用于接种实验，收集上述SDC平板上的分生孢子，浓度为1×10⁵个/ml，注射到水稻叶鞘中，黑暗保湿培养30小时。

3）用医用镊子撕取内表皮显微观察，观察侵染菌丝的BIC定位及在水稻细胞核定位。

实验结果显示MoErs1的融合表达RFP和 RFP-NLS的荧光菌株，侵染叶鞘后，荧光都集中在BICs中（图3中A）。同时，将MoERS1:RFP-NLS的荧光菌株，侵染叶鞘后，荧光能够聚集在水稻的细胞核中（图3中B）。上述证明MoErs1是一类细胞质效应分子，并且在侵染阶段能够被分泌进入水稻细胞中。

实施例5：MoERS1基因缺失突变体致病力测定

1、采用稻瘟病菌孢子液喷雾接种水稻叶片的方法，具体方法如下：

1）首先诱导稻瘟病菌产生分生孢子，具体方法见实施例4中第2项。

2）温室培养14天的水稻苗用于喷雾接种实验，收集上述SDC平板上的分生孢子4ml，浓度为5×10⁴个/ml，并含有总浓度为0.2% (w/v)的明胶，喷洒到水稻叶片上，黑暗保湿培养24小时，随后光暗交替培养5-7天。

3）统计发病面积和病斑数目。

4）每个处理重复三次。

2、采用稻瘟病菌孢子液注射接种水稻幼苗的方法，具体方法如下：

1）首先诱导稻瘟病菌产生分生孢子，具体方法见实施例4中第2项。

2）温室培养20天的水稻苗用于接种实验，收集上述SDC平板上的分生孢子，浓度为1×10⁵个/ml，注射到水稻幼苗茎秆中，黑暗保湿培养24小时，随后光暗交替培养5-7天。

3）统计发病面积和病斑数目。

4）每个处理重复三次。

水稻喷雾接种实验结果结果显示，∆Moers1突变体上病斑较野生型Guy11和实施列3获得的互补菌株显著减少，并且病斑不能正常扩展（图4中A、C、D、F）；叶鞘注射结果显示，∆Moers1突变体只在注射点附近会出现极少数病斑，而野生型和互补菌株病斑正常扩展（图4中B）。进一步观察了接种发病叶片病斑上的菌丝生长情况，发现保湿诱导后，野生型和互补菌株产生的病斑（>80%, n=100）能产生大量分生孢子，而突变体∆Moers1接种的水稻叶片上的病斑不能产生孢子（<20%, n=100）（图4中E）。这一结果说明MoErs1调控稻瘟病菌致病力。

实施例6：MoERS1基因缺失突变体侵染菌丝扩展能力测定

稻瘟病菌侵染实验方法具体见实施例4。为了解释上述∆Moers1突变体致病性下降的原因，即典型病斑数减少和不能正常在病斑处诱导孢子的产生。分别在大麦、洋葱表皮和水稻叶鞘中进行了侵染实验。在大麦上，侵染30 h后，观察了100个附着胞侵染位点，并进行分级统计（I级，只有附着胞，不穿透寄主；II级，能形成一根初生侵染菌丝；III级，能形成2到3根分枝的次生侵染菌丝；IV级，侵染菌丝扩展，超过3根分枝）。在野生型中和互补菌株中，80%侵染位点形成III和IV级侵染菌丝，而在突变体中，只有不到30%的侵染位点形成III和IV级侵染菌丝（图5中A和B）。在水稻叶鞘中，侵染24小时，突变体侵入率显著低于野生型（突变体10%，野生型80%），并且突变体的菌丝在侵染后48 h还不能扩展到邻近细胞，而野生型扩展到了邻近细胞（图5中C）。上述结果说明MoErs1是侵染菌丝生长所必须的，而侵染菌丝的正常扩展是稻瘟病菌典型病斑形成关键。

实施例7：MoERS1基因缺失突变体无法抑制寄主活性氧的积累

DAB（3, 3′-diamino-benzidine）染色方法：稻瘟病菌侵染水稻叶鞘方法具体见实施例4。侵染24小时后的水稻叶鞘，用1 mg/ml的DAB（PH 3.5）染色，室温黑暗条件下染色8小时，再用乙醇/乙酸（94:4）脱色1h，用镊子撕取叶鞘内表皮进行显微观察。

利用DAB对侵染的水稻细胞进行活性氧（ROS）染色观察，实验结果显示在野生型菌株Guy11侵染的水稻叶鞘中，没有ROS的产生，而在∆Moers1突变体侵染的水稻叶鞘细胞中积累了大量的ROS(图6中A和B)。用DPI（diphenyleneiodonium，NADPH氧化酶抑制剂）处理水稻叶鞘，抑制ROS的产生后，再观察侵染菌丝在叶鞘细胞中的生长情况，统计了100个侵染位点，并进行分级统计（I级，只有附着胞，不能形成初生侵染菌丝；II级，形成初生侵染菌丝；III级，形成次生侵染菌丝，但没有扩展到邻近细胞；IV级，侵染菌丝扩展到邻近细胞）。结果显示，DPI处理后，能够回补突变体侵染菌丝扩展缺陷（图6中C和D）。结果表明MoErs1能够抑制寄主活性氧的产生，促进侵染菌丝扩展。

实施例8：水稻中过表达效应子编码基因MoERS1后能够促进稻瘟病菌的侵染

水稻喷雾实验方法具体见实施例5。本发明利用酶切连接的方法将目的基因MoERS1的编码区构建到pCAM2300载体中，引物设计时MoERS1上下游引物分别添加XbaI和PstI酶切位点，扩增MoERS1基因，再将目的基因和载体用限制性内切酶XbaI和PstI进行酶切线性化，通过T4连接酶将载体和片段进行连接，构成pCAM2300- MoERS1的载体。再将MoERS1基因通过该载体由actin启动子启动基因表达，并自带Flag标签，用于后期的验证；构建上述载体后委托武汉伯远生物公司转化获得MoERS1基因过表达的植株；

实验结果，显示野生型菌株Guy11和突变体菌株∆Moers1均能在在MoERS1-OX的过表达植株上发病（图7中A和B），说明MoErs1进入寄主细胞后能够抑制寄主的免疫反应，促进稻瘟病菌的侵染。同时进行叶鞘侵染观察，发现MoERS1-OX的过表达和株系，与TP309一样，稻瘟病菌侵染48小时后，都表现对稻瘟病菌非常的感病，侵染菌丝扩展非常严重（图7中C和D）。这些结果表明，在稻瘟病菌侵染过程中，MoErs1能够抑制水稻的抗病反应，促进稻瘟病菌侵染。

实施例9：利用效应子MoErs1蛋白的表达作为靶标，设计和筛选杀菌剂

在稻瘟病菌野生型菌株Guy11的cDNA中，克隆MoErs1去信号肽的片段(21-214aa)，构建到pET15b载体上(Novagen, Madison, WI, USA)。在大肠杆菌BL21中表达上述载体质粒，用液体LB培养基（含100μg/ml氨苄）37°C摇菌至OD600为0.4-0.8之间。降低培养温度至16°C, 加入0.4 mM IPTG (isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside)诱导MoErs1蛋白的表达。12小时后，5300g离心15分钟收集菌液。沉淀用加入1 mM的裂解液(20 mMTris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 10mM imidazole)悬浮裂解，随后超声破碎，收集上清液即为MoErs1的蛋白。可通过western检测蛋白的表达情况。进一步利用沉滴法获得MoErs1的蛋白晶体结构。

根据MoErs1蛋白晶体结构设计或预测小分子化合物，通过微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）实验验证化合物与MoErs1的结合，进一步通过上述不同的实施案例提供的方法测定化合物对MoErs1功能的抑制作用，确定化合物的抑菌效果。

其中，采用沉滴法和悬滴法获得MoErs1蛋白的晶体结构，具体方法如下：

1.将上述纯化后的MoErs1蛋白浓度调制10 mg/ml，并溶解在20 mM Tris-HCl (pH8.0), 800 mM NaCl, 5 mM DTT溶液中；

2.取1中蛋白0.4 µl，与储蓄液（0.2 M 六水氯化镁, 0.1 M Tris pH 8.5, 3.4 M1,6-乙二醇）混合后，放置在沉滴板中，4℃培养晶体；

3.培养3天后MoErs1能够产生晶体，进一步利用悬滴法优化晶体的培养条件；

4.将1.5 µl纯化后的MoErs1蛋白与等量的储蓄液混合，储蓄液中包括0.05 M醋酸锌，20% PEG3350，生长良好的结晶用于数据分析；

5.在数据收集之前，将晶体转移到含有25%甘油的储液液中进行冷冻保护，然后快速冷冻到液氮中；

6.利用单波长反常衍射法（SAD）分析MoErs1的晶体结构。

本发明利用上述方法获得MoErs1晶体后，围绕MoErs1与水稻半胱氨酸蛋白酶的关键互作位点Loop2、Loop4、Loop8和β11，通过ClusPro 2.0 工具，设计出潜在的与MoErs1结合的小分子化合物。其中设计出的一个具体化合物为FY21001，结构式如下：

采用实施例1中MST方法，验证小分子化合物与上述位点的结合能力。实验结果表明MoErs1蛋白与FY21001有很强的结合能力（Kd=0.28），而且经过进一步实验表明，该化合物对稻瘟病菌致病力具有较强的抑制活性，EC₅₀值为231.07 µM (80.445 µg/mL)，与三环唑的EC₅₀为224.08 µM (42.405 µg/mL)的使用浓度相近，可见其对稻瘟病的防治效果优异，可用于制备杀菌剂。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施案列。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>南京农业大学

<120>源于稻瘟病菌的效应子蛋白MoErs1及其编码基因与用途

<160>30

<170>Patent-In 3.3

<210> 1

<211>214

<212>PRT

<213>Magnaportheoryzae

<220>

<223>序列描述：MoErs1蛋白氨基酸序列

<400> 1

MRTQFSLLGVAALASTVVNAMPSTLEARALPQVSAVAKPRACSSYPTFDPATGEATEFIFYADSTEEPVAPFAGSVVGKLANPNLAIARIGIAVRGDLAKVVTKCFPDGGEEGLRTRTHGDWRRLTLAGGEDENIILIGQGPVAHRPLTPHDHFFANGTQQPGVFMGDNGSTTWAFSRKDASASEPFDQYEIRLLKSADSPLRNGEFRGFVRAA 214

<210>2

<211>645

<212> DNA

<213>Magnaportheoryzae

<220>

<223>序列描述：MoErs1蛋白编码基因核苷酸序列

<400>2

ATGCGCACCCAGTTCTCTCTCCTCGGAGTCGCGGCTCTCGCCAGCACCGTCGTCAACGCCATGCCCTCCACGCTCGAGGCCAGGGCCCTTCCCCAGGTTTCGGCCGTCGCCAAGCCGAGGGCGTGCTCCTCGTACCCGACCTTTGATCCCGCCACCGGCGAGGCTACCGAATTCATATTCTATGCCGACTCGACCGAGGAGCCTGTCGCTCCGTTCGCCGGTAGCGTGGTGGGGAAGTTGGCCAACCCCAACCTGGCCATTGCACGGATCGGAATCGCCGTCCGCGGAGATCTCGCGAAGGTCGTGACCAAGTGCTTCCCCGACGGCGGCGAAGAGGGACTCCGCACCCGCACGCACGGCGACTGGAGACGTCTCACCCTTGCCGGAGGCGAGGACGAAAACATCATCTTGATCGGCCAAGGTCCAGTGGCCCACCGACCCTTGACCCCCCACGATCACTTCTTCGCCAACGGCACGCAGCAGCCCGGCGTCTTTATGGGCGACAACGGATCGACCACCTGGGCCTTCTCGAGGAAGGACGCCAGCGCCAGTGAGCCGTTCGACCAGTACGAGATCCGTCTTCTGAAGAGCGCAGACTCGCCTCTGAGGAATGGAGAGTTCAGGGGCTTTGTGCGTGCTGCTTGA 645

<210>3

<211> 1055

<212> DNA

<213>Magnaportheoryzae

<220>

<223>序列描述：MoErs1蛋白编码基因上游旁侧核苷酸序列

<400>3

GTGTGCGTACGACAATGCTTGCCTGTTTGCCCATCTGTCTCGGGCTCCTCGTCATTTGTGTGAAAAGCGTCTGTTTGCAACGACGCAATGAGTCAACAGTACAAATTATAAGCTATAGTGAAGATGAAGCGAATGCCTGGTACGATAAACCTGTCGTGCCAAGGTAGAATTGACGAAGCCTTGCCTTGATCGATCGTCCAAGTTCAACATCATGTGAACAGAGCCCGTATGCAACCTGGTTGGCCCCCGATGCTTGTGCCATTCCTTGGCCCCAAGAACGTCAAGAGTAAAAAGCTAATCGGACACGACGGGTCCGATGAGACATGGTGAGAAGTTAGTGTTAGCTAAGACCAGGGGAGATCGAGAGCTGCAGCCTTGCCCCGCAGAACGGTAAATTCCCCAAACGAGCTAGACCAGTCCCTTCGCTCAAATACGCCCCTGGGCTGACGAGAAGGACCACACATGCCACTATGTACAGGACCCGGTATAATGTAATTGAGAGAAGGCTGCCTAAGCGCTAAACAAAATGGTCCAGTCGGGGCGAATTCAAGGTAAACGAACATACGGAATAATGGAAGAACTGGCTACCAGGAAGGATCATTAACCTCCACCTGCACCCCCTGAAAGACGAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCAGCGGCACAGTCGCCAAGGGTGGTGATTTTCCCCATTCCATCGTTGGCTCTTTCCTGCACGAGCTGATCCACCACTGTTCGAGATTTGATTCCCCTGCCTGGTCGGGCATGGAACTTCTGGTAATGATGTACCGTAGACCGAATGGCCCTCAATGTGGTTCCGCAAATCTGTAAATTGCCATCAGGCAACAGGCGGGCAAGCCGGGTGTACCGATGGCGAACAGGATAAATACCCCTCGACCGTCCTCGACTTGAATCCCAGGTAGAAGGAAGAGACAGCACTCGCCACAGCTCCTCTGACATTCGCTTTCCCATCGCCCACAACATTTGGCCCTGCTCTCATTCCTTGGGTTGATTTTTTTTCTTTTCTTTCGCAAGCACCGAAAACTTTAGTCAAA 1055

<210>4

<211> 1008

<212> DNA

<213>Magnaportheoryzae

<220>

<223>序列描述：MoErs1蛋白编码基因下游旁侧核苷酸序列

<400>4

GCCTGACATAACATTTTGCTGGGTAATCGGTTCAACATGTGAGCATTGCGTGATGTTTACCCTGTATTTTTACAGGTATACAGGGTGGACGTGGAAGCAAACACCCAGCTCCCGTCGGTCTGAGAGCATGAATGCCAATGTTGTGCAGCATGATGGATCGCTGCCTGGTTCTAGAATATATAGCAAGTACCGTACGGAAGACATGCTTCAGATATGGGTACTTCGAATAGATAGCCTGGGTCAGGTAGCACAGATGGGCAGGGTTGGTTCATGAGCACGAGTCAATTTAATGTAAATGATTTGACGATACCCCGGATTACTGCGCCGTTTGGGTTTATGCATGTCGCCTAAACGCAACATGTAGTCCGCAAACGCTCCGTAACCCATGAGAGGCTGCTGCACTTTTGCTGCTTTGTTTGCCAACATCTGAGACCCCCCGACCAGTCATGTCTGCTCGGTTGCATGTGCGTTGCAAGGAATGTCAGTCAACAAAGTCCATCAAACGTGAACCGAATCCAACGTCAACAAGCAATGTTATCTCGCTGCCATCTGCCATCTGCCATCTGGGTATCTGCGCGTCAACCCTGAGCTACTAGCCCCACCGCCTTTGGCCCACGGCTTTTCTCGGTTGGTGGGCGCTAAGTATAATGAATTCGGTCAGCTTTGGCCCCAACCAGGTTGTTTGTTAACAAGCTAGATCCATGTACCAAATGTAAACAAATACTACTCTGAGCCATCACACCGTCAACCGGAACCAGGCTTGCTAGGCACGAAGTAATCATCTCTCGGCAAGGAAGAAGAAAAACAAAAAAAAAAAAACCCTGGCGCGGGCACCGGCGGGGTGATGATGGAATTTTGCGGGAACAAAGATACAGTAGGCAGTCGGACACAAGGCAAGCGAAATGGGCAGGCGGGGCAGCTGTAGCAGTACCATCGATGACGCTTCTTGATAAGGTACTGTGATCAAGCTACCTAGGTACGGTATGGCTTACCGTAGGACGAACGGTG 1008

<210>5

<211> 1349

<212> DNA

<213>

<220>

<223>序列描述：潮霉素编码基因核苷酸序列

<400>5

GGAGGTCAACACATCAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTCCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCATGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCCTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGCCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAG 1349

<210>6

<211> 1576

<212> DNA

<213>Magnaportheoryzae

<220>

<223>序列描述：启动子核苷酸序列

<400>6

CATATAGGTAGACATATCTTGGGGTATTCGACCCGAAGCTGATCTTTTCTCCCCTCCAAAAACAGTGTGCGGATGTGCCGTCGGTGTAGCGACCGCCGAAGTATCGGGGTTAATAGCGAGACCAGGTCCGACCGGAACTGCCTCCGTCTCGGCGTCATATTCTTACATGAGCGGCAGCGGCTTCTCCGTGGTCTCATCCTTGACGGTCATCAACAAAGCGGCCTCCGGTACCGCAACGCCAAGCTTCATGCCCCAGGTAGACCAACCGAGCCAAATGGTGCCAATCCACAAGAGAGACGTCGAGGAAGACCACGAACCGCCAAAGAGCTTCGAACCGGCTAACAAGGCCGCAGTACAGGCCAGCTCCGGGACGTCGTCTAGTCATTACGGAAATATGCGTATTTCGGGTTGGGTCATATCGGTTGTACCTACATTGTTGGTTGGTCTGATTGTATAGAAAGAAAAGAAGAGAAAGAGGAAAAAGAAAGAAAAAAAAGGGTGAAATACGGGGATCAAGGAAAGTGTGCGTACGACAATGCTTGCCTGTTTGCCCATCTGTCTCGGGCTCCTCGTCATTTGTGTGAAAAGCGTCTGTTTGCAACGACGCAATGAGTCAACAGTACAAATTATAAGCTATAGTGAAGATGAAGCGAATGCCTGGTACGATAAACCTGTCGTGCCAAGGTAGAATTGACGAAGCCTTGCCTTGATCGATCGTCCAAGTTCAACATCATGTGAACAGAGCCCGTATGCAACCTGGTTGGCCCCCGATGCTTGTGCCATTCCTTGGCCCCAAGAACGTCAAGAGTAAAAAGCTAATCGGACACGACGGGTCCGATGAGACATGGTGAGAAGTTAGTGTTAGCTAAGACCAGGGGAGATCGAGAGCTGCAGCCTTGCCCCGCAGAACGGTAAATTCCCCAAACGAGCTAGACCAGTCCCTTCGCTCAAATACGCCCCTGGGCTGACGAGAAGGACCACACATGCCACTATGTACAGGACCCGGTATAATGTAATTGAGAGAAGGCTGCCTAAGCGCTAAACAAAATGGTCCAGTCGGGGCGAATTCAAGGTAAACGAACATACGGAATAATGGAAGAACTGGCTACCAGGAAGGATCATTAACCTCCACCTGCACCCCCTGAAAGACGAGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCAGCGGCACAGTCGCCAAGGGTGGTGATTTTCCCCATTCCATCGTTGGCTCTTTCCTGCACGAGCTGATCCACCACTGTTCGAGATTTGATTCCCCTGCCTGGTCGGGCATGGAACTTCTGGTAATGATGTACCGTAGACCGAATGGCCCTCAATGTGGTTCCGCAAATCTGTAAATTGCCATCAGGCAACAGGCGGGCAAGCCGGGTGTACCGATGGCGAACAGGATAAATACCCCTCGACCGTCCTCGACTTGAATCCCAGGTAGAAGGAAGAGACAGCACTCGCCACAGCTCCTCTGACATTCGCTTTCCCATCGCCCACAACATTTGGCCCTGCTCTCATTCCTTGGGTTGATTTTTTTTCTTTTCTTTCGCAAGCACCGAAAACTTTAGTCAAA 1576

<210>7

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

ATGCGCACCCAGTTCTC 17

<210>8

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

TCAGACCGACGGGAGCTGGG 20

<210>9

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>9

ATGCGCACCCAGTTCTC 17

<210>10

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>10

TCAAGCAGCACGCACAAAG 19

<210>11

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

GTGTGCGTACGACAATGCTTG 21

<210>12

<211>48

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>12

CAGCAAAATGTTATGTCAGGCGATATCTTTGACTAAAGTTTTCGGTGC 48

<210>13

<211>48

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>13

GCACCGAAAACTTTAGTCAAAGATATCGCCTGACATAACATTTTGCTG 48

<210>14

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>14

CACCGTTCGTCCTACGGTAAG 21

<210>15

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>15

GAGGCTACCGAATTCATATTC 21

<210>16

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>16

CAGTACGAGATCCGTCTTCTG 21

<210>17

<211>58

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>17

ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTTCATATAGGTAGACATATCTTGG 58

<210>18

<211>54

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>18

CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACAGCAGCACGCACAAAGCC 54

<210>19

<211>58

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>19

ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTTCATATAGGTAGACATATCTTGG 58

<210>20

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>20

GTCCTCGGAGGAGGCCATGACCGACGGGAGCTGGGTG 37

<210>21

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>21

CACCCAGCTCCCGTCGGTCATGGCCTCCTCCGAGGAC 37

<210>22

<211>52

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>22

CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACGGCGCCGGTGGAGTGG 52

<210>23

<211>58

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>23

ACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTCAAATTGGTTCATATAGGTAGACATATCTTGG 58

<210>24

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>24

GTCCTCGGAGGAGGCCATGACCGACGGGAGCTGGGTG 37

<210>25

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>25

CACCCAGCTCCCGTCGGTCATGGCCTCCTCCGAGGAC 37

<210>26

<211> 118

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>26

CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACTTAAACCTTTCTCTTCTTCTTAGGAACCTTTCTCTTCTTCTTAGGAACCTTTCTCTTCTTCTTAGGGGCGCCGGTGGAGTGG 118

<210>27

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>27

GGAGGTCAACACATCAATG 19

<210>28

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>28

CTCTATTCCTTTGCCCTCG 19

<210>29

<211>30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>29

ACGCGTCGACATGCCCTCCACGCTCGAGGC 30

<210>30

<211>26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>30

AACTGCAGAGCAGCACGCACAAAGCC 26