一种降低肌球蛋白-5蛋白及其在氰基丙烯酸酯类药物抗性治理中的应用
阅读说明：本技术 一种降低肌球蛋白-5蛋白及其在氰基丙烯酸酯类药物抗性治理中的应用 (Myosin-5 protein reduction and application thereof in cyanoacrylate drug resistance treatment ) 是由 周明国 宋修仕 谷凯鑫 侯毅平 段亚冰 王建新 于 2018-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供肌球蛋白5基因Myo5区段在防治植物真菌病害和/或增强植物的抗病性中的应用。所述肌球蛋白5基因来源于禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌、水稻恶苗病菌、枯萎病菌、稻瘟病菌、灰霉病菌、棉花黄萎病菌或油菜菌核病菌。所述肌球蛋白5基因Myo5区段是以Myo5dsRNA区段、dsRNA区段的联合或以全长或部分Myo5dsRNA进行RNase消化后随机产生15-30nt的siRNA。本发明还提供含有前述肌球蛋白5基因Myo5区段的体外干扰制剂。本发明的肌球蛋白-5Myo5基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性和防治植物病害的特异性等绿色、安全的突出优点。(The invention provides application of a myosin5 gene Myo5 segment in preventing and treating plant fungal diseases and/or enhancing disease resistance of plants. The myosin5 gene is derived from fusarium graminearum, fusarium asiaticum, rice bakanae disease, fusarium wilt, rice blast, botrytis cinerea, verticillium dahliae or sclerotinia sclerotiorum. The myoglobulin 5 gene Myo5 segment is a 15-30nt siRNA generated randomly by RNase digestion with a Myo5dsRNA segment, a combination of dsRNA segments or full-length or partial Myo5 dsRNA. The invention also provides in vitro interfering agents containing the myoglobulin 5 gene Myo5 segment described above. The RNA interference technology of the myosin-5 Myo5 gene has the outstanding advantages of increasing the drug sensitivity of pathogenic fungi, reducing the drug resistance level, interfering the pathogenicity, enhancing the disease resistance of plants, preventing and treating the specificity of plant diseases and the like, and is green and safe.)
【技术领域】
本发明属于基因工程技术领域，镰刀菌肌球蛋白-5基因Myo5、所述基因的 RNAi载体、所述基因Myo5 dsRNA体外制备以及所述基因在防治植物病害的应用。
【背景技术】
氰烯菌酯是我国自主研发的一种氰基丙烯酸酯类新型肌球蛋白抑制剂，具有杀菌活性强、专化性高、可降低镰刀菌DON毒素污染以及对植物具有增产作用等优点。目前，该杀菌剂市场占有率不断提升，已成为防治小麦赤霉病(Fusarium spp.)、水稻恶苗病(F.fujikuroi)和蔬菜根腐病(Fusarium spp.)等主要农作物重要病害的高效选择性杀菌剂之一。虽然目前还未在田间发现植物病原镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性菌株，但在实验室条件下通过紫外诱变和药剂驯化，靶标病原真菌极易产生抗药性，其中中抗和高抗菌株所占比例较大，且表现很高的适合度，说明肌球蛋白抑制剂具有很高的抗性风险。
研究表明，小麦赤霉病菌(Fusarium spp.)对氰烯菌酯产生抗药性的主要原因是杀菌剂的分子靶标肌球蛋白突变引起的杀菌剂与靶蛋白亲和力改变。研究表明，氰烯菌酯作用靶标肌球蛋白-5基因至少在编码135、151、204、216、217、 418、420、424、434、577、580和581位氨基酸的密码子突变可产生不同水平的抗药性。
近十年以来，RNA干扰成为科学研究的热点，该技术在病害防治方面取得了大量的成果，通过寄主诱导的基因沉默(HIGS)或离体体外干扰的方式，特异性干扰病原菌关键基因，可有效阻止病害发生。通过HIGS技术干扰白粉病菌 (Blumeriagraminis)的Avra10基因可提高小麦和大麦对白粉病的抗性(Nowara 等，HIGS:host-induced gene silencing inthe obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis.Plant Cell.2010.(22):3130-3141)。Tinoco等人构建GUS的茎环结构并转化烟草，发现转基因烟草可以抑制串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme) GUS基因的表达(Tinoco等，In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA.BMC Biology.2010.(8):27)。Hu 等人在拟南芥中表达尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)FOW2，FRP1和OPR三个基因的dsRNA，致使尖孢镰刀菌侵染转基因植株的速率显著低于对照组，并且尖孢镰刀菌中FOW2，FRP1和OPR三个基因受不同程度的干扰(Hu等， Down-regulation of Fusarium oxysporum endogenous genes by host-delivered RNA interference enhances disease resistance.Frontiers inChemistry.2015.(3):1-10)。
RNA干扰的靶标基因是决定RNA干扰效应大小的关键。肌球蛋白-5基因(或写作肌球蛋白5基因，myosin-5，myosin5，myo-5，myo5)属于肌球蛋白家族基因，其编码蛋白是一类利用ATP水解为细胞提供动能的马达蛋白，是细胞骨架的重要组成成分，参与细胞物质交流，信号传递，细胞极性等生物学过程。肌球蛋白-5基因在多数植物病原真菌中以单拷贝的形式存在，是真菌维持生命活动不可或缺的关键功能基因，敲除该基因会引起真菌细胞致死现象。因此，通过分子生物学技术手段降低病原真菌肌球蛋白-5基因的表达不仅可以增加植物病原真菌对肌球蛋白抑制剂的敏感性和降低抗药性水平，还能干扰真菌正常的生长发育，降低致病力。同时，肌球蛋白-5基因在不同物种中存在较大遗传分化，针对不同真菌物种肌球蛋白-5基因序列设计RNAi，可以特异性地防治相应的真菌病害。因此，肌球蛋白-5基因是作为RNA干扰的极佳靶标。
【
发明内容
】本发明的目的在于针对肌球蛋白-5基因(Myo5)，提供一种增强真菌对肌球蛋白抑制剂的药敏性或降低抗药性和植物抗病的病原真菌肌球蛋白-5基因 (Myo5)的有效RNA干扰区段，使其能在植物抗病和体外干扰中得以应用；另一个目的是开发Myo5dsRNA核酸农药用于防治真菌引起的植物病害，以及增加真菌对肌球蛋白抑制剂的药敏性。本发明的Myo5基因及其区段可以作为寄主诱导的基因沉默和体外干扰的靶标，利用体外干扰的方法喷施到寄主植物表面，或者通过转基因、植物病毒等基因工程手段导入植物中(包括小麦、玉米、水稻、草莓、葡萄等)，通过RNAi途径沉默真菌的肌球蛋白-5基因表达，从而降低真菌的致病力、增强对氰烯菌酯的药敏性、降低抗药性和增强植物的抗病性，提供一种特异性防治植物病害的颠覆性新技术。
为了实现上述目的，本发明的思路是针对肌球蛋白-5基因序列构建RNAi 载体，筛选有效RNAi区段降低病原菌致病力，从而减轻病害发生；根据基因干扰的原理，喷施Myo5dsRNA或利用转基因技术构建Myo5RNAi植物可直接或 (和)间接诱导镰刀菌、稻瘟病菌和灰霉病菌产生肌球蛋白-5基因的RNA干扰机制，使病原菌生长、发育异常，并增强了对氰烯菌酯的敏感性，为农药减施及开发防治植物病害的核酸农药提供了关键技术。
为此，本发明提供肌球蛋白5基因Myo5区段在防治植物真菌病害和/或增强植物的抗病性中的应用。
以及，肌球蛋白5基因Myo5区段在抑制病原真菌发育和致病力中的应用。
以及，肌球蛋白5基因Myo5区段在提高病原真菌对肌球蛋白抑制剂的药敏性中的应用。
在本发明中，所述肌球蛋白5基因来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、亚洲镰刀菌(F.asiaticum)、水稻恶苗病菌(F.moniliform)、枯萎病菌(F.oxysporum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)或油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
在本发明中，所述肌球蛋白5基因Myo5区段是以Myo5dsRNA区段、dsRNA 区段的联合或以全长或部分Myo5dsRNA进行RNase消化后随机产生15-30nt的 siRNA。
其中，所述Myo5 dsRNA区段是将Myo5基因的cDNA分成8个不同区段得到的，各区段分别命名为Myo5-1(cDNA起止位点1nt-473nt)、Myo5-2(cDNA 起止位点456nt-938nt)、Myo5-3(cDNA起止位点939nt-1455nt)、Myo5-4 (cDNA起止位点1381nt-1915nt)、Myo5-5(cDNA起止位点1828nt-2313nt)、 Myo5-6(cDNA起止位点2253nt-2739nt)、Myo5-7(cDNA起止位点2649nt-3206 nt)和Myo5-8(当来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)或亚洲镰刀菌(F. asiaticum)时对应的cDNA起止位点为3149nt-3645nt，当来源于水稻恶苗病菌(F. moniliform)、枯萎病菌(F.oxysporum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)或油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)时对应的cDNA起止位点3149nt-最终碱基)。
根据一种优选的实施方式，所述dsRNA区段是以Myo5cDNA全长为模板合成的1200bp的Myo5基因dsRNA区段，所述dsRNA区段的序列与其相应模板 U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同。
以来源于镰刀菌的Myo5基因为例，所述dsRNA区段的构建方法是：
(1)将Myo5基因的cDNA分成8个不同区段，分别命名为Myo5-1(cDNA 起止位点:1nt-473nt)、Myo5-2(cDNA起止位点:456nt-938nt)、Myo5-3(cDNA 起止位点:939nt-1455nt)、Myo5-4(cDNA起止位点:1381nt-1915nt)、Myo5-5 (cDNA起止位点:1828nt-2313nt)、Myo5-6(cDNA起止位点:2253nt-2739nt)、 Myo5-7(cDNA起止位点:2649nt-3206nt)和Myo5-8(cDNA起止位点:3149 nt-3645nt)，设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
MRNAi-1F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgggaatatcgagacgcccgaagaac
MRNAi-1R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttctcccgattctccaccagaca
MRNAi-2F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttggtggagaatcgggagatatca
MRNAi-2R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaccctggtcttcttggaactga
MRNAi-3F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccagggtggttatgctgaagtc
MRNAi-3R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtggcgtccttcatggcggaga
MRNAi-4F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgataacaaggttgtttgcgatc
MRNAi-4R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaccggctcttctgatgcgaacg
MRNAi-5F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcgccaacagaatacaacggccc
MRNAi-5R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgacgcctttccttgcgacctcc
MRNAi-6F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgaatttctccagcttcgtgacc
MRNAi-6R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgaagccgcctggcatcactcg
MRNAi-7F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctggatcaccgcaagaggctgacc
MRNAi-7R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgggcttggtggccgtgctggg
MRNAi-8F:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctctggacgagcaccgcctccgcc
MRNAi-8R:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaccagtcatcgtcgtcttccttc
PCR反应总体系50μl：肌球蛋白5cDNA模板1μl，10×LA PCRbuffer 5μl， 10mMdNTP 4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到50μl；PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃30s，35个循环； 72℃延伸10min；
PCR产物经凝胶回收后与商业化的pDONR201供体载体分别混合，形成含有attL1/attL2新位点的入门载体，再将其分别与目的载体pDestination混合发生特异性重组，将反应产物转化大肠杆菌感受态，形成pMyo5RNAi系列的干扰表达载体：pMyo5RNAi-1，pMyo5RNAi-2，pMyo5RNAi-3，pMyo5RNAi-4， pMyo5RNAi-5，pMyo5RNAi-6，pMyo5RNAi-7和pMyo5RNAi-8，所述干扰表达载体分别含有区段Myo5-1、Myo5-2、Myo5-3、Myo5-4、Myo5-5、Myo5-6、Myo5-7 和Myo5-8,dsRNA区段的序列与上述区段U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同。
作为一种优选的实施方式，所述dsRNA区段的联合是以多条前述的dsRNA 区段的组合作为合成区段的模板，使用RNAi Kit试剂盒得到的基因区段。
进一步地，本发明还提供一种体外干扰制剂，所述体外干扰制剂含有上述肌球蛋白5基因Myo5区段。
作为一种可选的实施方式，所述制剂的制备方法如下：
(1)Myo5 dsRNA制剂配制
1)以Myo5cDNA全长为模板，合成4种大小为1200bp的Myo5基因dsRNA Myo5-9(1nt-1200nt)、Myo5-10(901nt-2100nt)、Myo5-11(1801nt-3000nt)、 Myo5-12(2446nt-3645nt)，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，4种Myo5dsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
2)以Myo5-1、Myo5-2、Myo5-3、Myo5-4、Myo5-5、Myo5-6、Myo5-7和Myo5-8 单独、或以不同区段相互组合的方式作为体外干扰dsRNA的合成区段的模板，合成14种Myo5dsRNA，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，14种Myo5dsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
3)以Myo5cDNA全长为模板，使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒合成全长Myo5dsRNA，用RNase III消化后随机产生 15-30nt的siRNA。
本发明还提供上述体外干扰制剂在转基因植物抗病品种培育中的应用。
针对多种不同类型的真菌病害，如小麦(大麦)赤霉病、白粉病，小麦(大麦)锈病，小麦(玉米、水稻)纹枯病，棉花黄萎病菌，油菜菌核病菌等，本发明以这些真菌的Myo5或其同源基因作为靶标基因，在小麦、大麦、玉米、水稻等作物的抗病性状改良以及赤霉病菌、白粉病病原菌、锈病病原菌、稻瘟病病原菌和纹枯病病原菌、棉花黄萎病病原菌、油菜菌核病菌病原菌致病力和抗药性减除中应用。本发明通过实验证实肌球蛋白-5Myo5基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性和防治植物病害的特异性等绿色、安全的突出优点。
【附图说明】
图1为将Myo5基因分成8个不同区段以及相应的真菌pMyo5RNAi载体构建示意图。
图2为氰烯菌酯抗性菌株JT04-1及不同Myo5RNAi菌株在PDA培养基中培养3d的表型。
图3为Myo5RNAi菌株的Southern bolt检测。
图中：JT04-1为阴性对照菌株，有两条带的为单拷贝基因整合转化子。
图4为Myo5RNAi菌株接种豫麦33苗期致病力分析。
对照为菌株JT04-1。
图5为田间喷施25％氰烯菌酯悬浮剂对高抗菌株JT04-1及MyoRNAi转化子防效测定。
图中：不同字母代表样本间具有显著差异(P<0.05)。
图6为Myo5 dsRNA对镰刀菌防效测定。图中所示Myo5dsRNA与siRNA 浓度为40ng/μl。
图7为RNA浓度与抑菌效率分析。
图8为不同真菌中Myosin5基因同源性分析。
图9为拟南芥转化载体示意图。
【
具体实施方式
】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于表示浓度的“％”均为重量百分比，“份”均为重量份。
本发明涉及以下培养基，其组成分别为：
PDA培养基：马铃薯200g煮沸15min取浸出液，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min；
SNA培养基：0.1％KH2PO4,0.1％KNO3,0.05％MgSO4˙7H2O,0.05％KCl, 0.02％葡萄糖和0.02％蔗糖，蒸馏水定容至1000ml。
实施例1镰刀菌Myo5基因的合成与克隆
镰刀菌肌球蛋白-5基因Myo5的合成方法，其具体步骤是：
根据亚洲镰刀菌对氰烯菌酯抗性机制(参见B.Li,Z.T.Zheng,X.M.Liu,Y. Cai,X.W.Mao,M.Zhou,Genotypes and characters of phenamacril-resistance mutants inFusarium asiaticum,Plant Disease,100(2016)1754–1761)，选取抗性镰刀菌株的肌球蛋白-5基因作为模板，用化学合成方法人工合成肌球蛋白-5基因，所述序列编码135，151，204，216，217，418，420，424，434，577，580，581 氨基酸的密码子为氰烯菌酯抗性位点，序列如SEQ No.1所示。
分离获得Myo5基因的序列，NCBI gene数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)公布的登录号FGSG_01410序列相对应。
实施例2 Myo5基因cDNA的分离与克隆
镰刀菌肌球蛋白-5 cDNA的克隆方法，其具体步骤是：
根据实施例1中的肌球蛋白-5基因序列，去除内含子序列，用化学合成方法人工合成肌球蛋白-5基因cDNA，所述序列(DNA序列去除内含子)如SEQ No.2 所示。
实施例3针对Myo5基因cDNA不同区段的RNAi载体的构建和真菌转化
(1)将Myo5基因的cDNA分成8个不同区段，分别命名为Myo5-1(cDNA 起止位点:1nt-473nt)、Myo5-2(cDNA起止位点:456nt-938nt)、Myo5-3(cDNA 起止位点:939nt-1455nt)、Myo5-4(cDNA起止位点:1381nt-1915nt)、Myo5-5 (cDNA起止位点:1828nt-2313nt)、Myo5-6(cDNA起止位点:2253nt-2739nt)、 Myo5-7(cDNA起止位点:2649nt-3206nt)和Myo5-8(Fusarium graminearum和 F.asiaticum cDNA起止位点3149nt-3645nt,F.Moniliform、F.oxysporum、 Magnaporthe oryzae、Botrytis cinerea、Verticilliumdahliae和Sclerotinia sclerotiorum cDNA起止位点3149nt-最终碱基)，设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，以Fusarium graminearum和F.asiaticum为例特异引物序列如下：
MRNAi-1F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGGAATATCGAGACGCCC GAAGAAC
MRNAi-1R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTCCCGATTCTCCACCAGAC A
MRNAi-2F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTGGAGAATCGGGAGATA TCA
MRNAi-2R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCCTGGTCTTCTTGGAACTG A
MRNAi-3F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCAGGGTGGTTATGCTGAAGT C
MRNAi-3R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGGCGTCCTTCATGGCGGAG A
MRNAi-4F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGATAACAAGGTTGTTTGCGAT C
MRNAi-4R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAACCGGCTCTTCTGATGCGAA CG
MRNAi-5F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGCCAACAGAATACAACGGC CC
MRNAi-5R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACGCCTTTCCTTGCGACCTC C
MRNAi-6F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAATTTCTCCAGCTTCGTGAC C
MRNAi-6R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAAGCCGCCTGGCATCACTC G
MRNAi-7F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGATCACCGCAAGAGGCTGA CC
MRNAi-7R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGGGCTTGGTGGCCGTGCTGG G
MRNAi-8F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTGGACGAGCACCGCCTCCGC C
MRNAi-8R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCAGTCATCGTCGTCTTCCTT C
PCR反应总体系50μl：人工合成的肌球蛋白-5基因cDNA 20ng，10×LA PCRbuffer5μl，10mM dNTP 4μl，正反向引物各1μl，LATaq酶0.5μl，加水到 50μl(PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10 min。
PCR产物经凝胶回收后与商业化的pDONR201供体载体分别混合，形成含有attL1/attL2新位点的入门载体，再将其分别与目的载体pDestination(购自 invitrogen公司)混合发生特异性重组，将反应产物转化大肠杆菌感受态，形成 pMyo5RNAi系列的干扰表达载体：
pMyo5RNAi-1，pMyo5RNAi-2，pMyo5RNAi-3，pMyo5RNAi-4， pMyo5RNAi-5，pMyo5RNAi-6，pMyo5RNAi-7和pMyo5RNAi-8(如图1所示)。
(2)利用真菌原生质体转化法(Maier等，Development of a highly efficientgene targeting system for Fusarium graminearum using the disruption ofapolyketide synthase gene as a visible marker.FEMS Yeast Res.2005.(5):653-662)，将步骤(1) 得到的8个RNAi干扰载体分别导入镰刀菌氰烯菌酯抗性菌株JT04-1和敏感菌株2021的原生质体中(得到16株不同的重组菌)，其中，以JT04-1为出发菌株的重组菌分别命名为Myo5RNAi-1，Myo5RNAi-2，Myo5RNAi-3，Myo5RNAi-4， Myo5RNAi-5，Myo5RNAi-6，Myo5RNAi-7和Myo5RNAi-8菌株，以2021作为出发菌株的重组菌分别命名为Myo5RNAi-a，Myo5RNAi-b，Myo5RNAi-c， Myo5RNAi-d，Myo5RNAi-e，Myo5RNAi-f，Myo5RNAi-g和Myo5RNAi-h。以 2021作为出发菌株的重组菌和以JT041作为出发菌株产生的重组菌转化子表型一致，图2展示以JT041作为出发菌株产生的重组菌在PDA培养基上的形态。
实施例4镰刀菌Myo5基因有效RNAi干扰区段的筛选：
(1)表型实验
配置PDA培养基平板，6cm的皿倒7ml相应的培养基，取浓度为5×105个 /ml的实施例3得到的8株菌株以及出发菌株新鲜分生孢子10μl，接种于培养基平板中央，将平板放25℃培养箱，黑暗培养，3d后观察菌落形态，如图2所示。
图2显示：Myo5RNAi-1,Myo5RNAi-2,Myo5RNAi-3,Myo5RNAi-4和 Myo5RNAi-5菌株在PDA培养基上生物量降低最为明显。这说明针对Myo5基因的这5个片段RNAi干扰后可造成菌丝生物量和生长势的降低。
(2)Southern分析
根据实施例3获得的8株Myo5RNAi转化子菌株，提取基因组用NcoI酶切，用探针G418P1P2杂交，预期杂交带分别为6738bp+4225bp,6758bp+4225bpm, 6824bp+4225bp,6862bp+4225bp,6764bp+4225bp,6766bp+4225bp,6908 bp+4225bp,6786bp+4225bp,JT04-1基因组杂交后没有条带，转化子均为单拷贝，且杂交带大小与预期符合，表明该载体已正确导入靶基因中，如图3所示。
(3)药敏性实验：
分别以实施例3得到的16株Myo5基因RNA干扰镰刀菌转化子、氰烯菌酯抗性菌株JT04-1和敏感性菌株2021作为分析样本，设置氰烯菌酯在PDA培养基中的浓度为0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL用于敏感菌株测定；设置氰烯菌酯在PDA培养基中的浓度为0.001、50、100、200、300、400、500、 600μg/mL用于抗性菌株测定，待在0.001浓度下的菌株长至6cm时，利用PDA 平板法测定样本的EC50值。
如表1的结果显示：Myo5基因RNA不同区段RNA干扰后的镰刀菌转化子均表现出EC50值的显著下降，这表明Myo5基因RNA不同区段RNA干扰后均可降低镰刀菌对氰烯菌酯的抗性、增加药敏性(表1)。
表1 Myo5基因RNAi转化子对氰烯菌酯的敏感性分析
(4)苗期接种：
取豫麦33苗的种子，用0.1％升汞消毒5min，无菌水洗3遍后浸泡2h；将种子均匀置于铺有双层无菌滤纸的塑料盒中，每盒放置25粒种子，25℃，90％湿度，12h光照，12h黑暗培养3d，使胚芽鞘长到3cm，用灭菌剪刀快速剪去胚芽鞘尖端，分别向伤口接种5μl(孢子浓度5×105个/mL，取自实施例3以JT04-1为出发菌株获得的8株Myo5RNAi转化子菌株)的孢子液，相同条件培养，7d后调查各苗的病斑长度，结果如表2所示。
表2 Myo5RNAi菌株接种豫麦33苗期致病力
经致病力分析表明，Myo5基因RNA不同区段RNA干扰后均造成镰刀菌致病力下降，表现为病斑长度的显著减小。
图4给出了9株豫麦33苗的病斑部分照片，并标示了病斑长度。照片直观显示了Myo5基因RNA不同区段RNA干扰后麦苗的病斑显著短于对照麦苗。
(5)田间药敏测定
以豫麦33作为田间供试小麦品种，扬花期喷施25％氰烯菌酯悬浮剂，喷施浓度分别设置为0.1g/亩、15g/亩、50g/亩，喷雾24h后分别接种氰烯菌酯高抗菌株 JT04-1及其Myo5基因RNA干扰菌株：Myo5RNAi-1,Myo5RNAi-2,Myo5RNAi-3, Myo5RNAi-4和Myo5RNAi-5。接种后21d调查发病情况，结果如表3，以病穗率表示：
表3田间喷施25％氰烯菌酯悬浮剂对高抗菌株JT04-1及MyoRNAi转化子防效测定
利用Student’s tests和方差分析中的多重比较对接种调查结果进行差异性分析。
分析表明，田间喷施50ml/亩的25％氰烯菌酯悬浮剂可使受RNA干扰菌株的致病力比亲本高抗菌株JT04-1降低了90％～93％，RNA干扰菌株对氰烯菌酯的敏感性显著增加。
图5显示了分别接种6株菌的豫麦33的病穗情况，可以看出Myo5RNAi-1,Myo5RNAi-2,Myo5RNAi-3,Myo5RNAi-4和Myo5RNAi-5组较对照组均有明显的抗病穗效果。
实施例6 Myo5 dsRNA对镰刀菌活体药效测定
(1)Myo5 dsRNA制剂配制
1)以Myo5cDNA全长为模板，合成4种大小为1200bp的Myo5基因dsRNA Myo5-9(1nt-1200nt)、Myo5-10(901nt-2100nt)、Myo5-11(1801nt-3000nt)、 Myo5-12(2446nt-3645nt)，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)，4种Myo5dsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
2)以Myo5-1、Myo5-2、Myo5-3、Myo5-4、Myo5-5、Myo5-6、Myo5-7和Myo5-8 区段对应的dsRNA单独、或以不同区段相互组合的方式(Myo5-1+Myo5-3，Myo5-2+Myo5-4，Myo5-3+Myo5-5，Myo5-4+Myo5-6，Myo5-5+Myo5-7， Myo5-6+Myo5-8)，作为体外干扰dsRNA的合成区段的模板，合成14种 Myo5dsRNA，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi KitAM1626 试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)，14种Myo5dsRNA的序列与相应模板 U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
3)以Myo5cDNA全长为模板，使用Invitrogen公司的RNAi KitAM1626试剂盒合成全长Myo5dsRNA，用RNase III(NEB公司，操作步骤见试剂盒说明书)消化后随机产生15-30nt的siRNA。
以上18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA，用醋酸铵缓冲液(成分：0.1M 醋酸铵、0.75mM EDTA、4％乙二醇、40mM氯化钙)稀释至2.5-320ng/μl。。
(2)Myo5 dsRNA活体药效测定
豫麦33种子消毒后无菌水浸泡2h，均匀铺于含有双层滤纸的塑料盒中， 25℃、90％湿度12h光照，12h黑暗培养至胚芽鞘长至3cm，用剪刀剪去胚芽鞘尖端，分组取样喷施18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA(2.5-320ng/μl) (对照组喷施醋酸铵缓冲液)或18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA与氰烯菌酯(10ng/μl)混合药剂(对照组喷施10ng/μl氰烯菌酯)，自然晾干6h 后，伤口接种5μl(5×105个/mL)的镰刀菌孢子液，相同条件培养，7d后调查病斑长度。
结果如图6所示，18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA均可有效抑制镰刀菌在胚芽鞘的发病；与氰烯菌酯单剂相比，18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的 siRNA与氰烯菌酯的混合物能大幅度降低氰烯菌酯抗性菌株JT04-1在小麦胚芽鞘上的病斑长度，说明18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA在小麦活体上能够增加镰刀菌对氰烯菌酯的敏感性。在siRNA浓度为2.5-320ng/μl范围内，各组均表现出对镰刀菌良好的抑菌能力，其中以Myo5-5、Myo5-11、 Myo5-1+Myo-3dsRNA、Myo5siRNA为例，RNA浓度与抑菌效率关系如图7所示：不同浓度的Myo5dsRNA或siRNA(5-320ng/μl)均可抑制镰刀菌发病抑菌效率越高。其余实验组所得抑菌效率也大致相同。
实施例7 Myo5 dsRNA对稻瘟病菌和灰霉病菌活体药效实验
用本说明书中实施例6的Myo5 dsRNA制剂(18种Myo5dsRNA和1种 15-30nt的siRNA，浓度为40ng/μl)，分别喷施于水稻叶片表面(4叶期)和拟南芥叶片(抽薹期)，对照组喷施0.1M的醋酸铵，12h后分别接种稻瘟病菌孢子液和灰霉病菌孢子液10μl(1×105个/mL)，每菌株接种40个叶片，5天后统计发病率，发病率＝发病叶片数/接种总叶片数。
实验表明，18种Myo5dsRNA和1种15-30nt的siRNA可显著降低稻瘟病菌和灰霉病菌的致病能力，见表4。
表4喷施Myo5dsRNA对稻瘟病菌和灰霉病菌的防治效果
实施例8不同真菌来源Myosin5基因对镰刀菌药效测定
(1)同源比对镰刀菌Myosin5基因在不同真菌中的同源基因，所述真菌包括：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。利用 NCBI在线比对工具BlastN
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastS earch&LINK_LOC＝blasthome)比对分析，分析结果如图7所示，同源性范围为70％-76％。
(2)分别以稻瘟病菌、灰霉病菌、棉花黄萎病菌、油菜菌核病菌的Myo5cDNA 作为模板(选取1nt-1200nt范围)按照实施例6中Myo5 dsRNA制剂配制方法合成 dsRNA，并按照Myo5 dsRNA活体药效测定的方法测定不同来源的dsRNA对镰刀菌的药效，利用Student’stests对接种调查结果进行差异性分析，结果如表5所示，不同来源的Myo5dsRNA均对镰刀菌有较好的抑菌作用，与镰刀菌自身的dsRNA 相比无显著差异，说明不同真菌源的Myo5dsRNA在不同真菌间都具有药效作用。
表5不同真菌源的Myo5dsRNA对镰刀菌药效测定
实施例9Myo5 RNAi转基因植株的抗病性鉴定及杀菌剂的减量应用
(1)植物Myo5RNAi表达载体的构建
以商业化载体pSGRNAi作为骨架，在其35S启动子的下游和35S终止子的上游连入实例二中的Myo5-5正反向序列(Myo5-5 F： CGCCAACAGAATACAACGGCCC；
Myo5-5 R：GACGCCTTTCCTTGCGACCTCC)和intron组成的颈环结构，所得植物表达载体命名为pPlantMyo5RNAi-5，其载体示意图见图8
(2)拟南芥遗传转化过程
利用农杆菌介导的拟南芥转化(参见：Brian W.Tague and Joanna Mantis,InPlanta Agrobacterium-Mediated Transformation by Vacuum Infiltration,2006,323:215-223)将植物表达载体pPlantMyo5RNAi-5转化到拟南芥(哥伦比亚型)中，经过卡那霉素抗性筛选，获得抗性植株。
(3)转Myo5RNAi-5基因拟南芥的抗病性鉴定及杀菌剂的减量应用：
为了检测转Myo5RNAi-5基因拟南芥形成的siRNA能否抑制入侵的镰刀菌的生长及增加镰刀菌对肌球蛋白抑制剂药物敏感性，通过叶片接种的方法检测了转基因植株的抗赤霉病性状，通过接种表型观察与统计，转基因株系的抗赤霉病能力和非转基因对照相比，达到显著差异(P<0.05)。经镰刀菌抗性菌株JT041接种5d后，非转基因对照植株病斑面积为0.98cm2，而转基因植株为0.16cm2防治效果达到84％，喷施10ng/μl氰烯菌酯的野生型拟南芥植株发病为0.93cm2，喷施 200ng/μl氰烯菌酯的野生型拟南芥植株发病为0.51cm2，而喷施10ng/μl氰烯菌酯的转基因植株发病为0.01cm2，病情降低了75～89％，防治效果达到99％，并显著降低了杀菌剂用量，见表6。
表6转Myo5RNAi-4基因拟南芥的抗赤霉病能力鉴定及杀菌剂减量应用
同时，还通过叶片接种法检测了转基因拟南芥对灰霉病的抗病能力，非转基因拟南芥接种2天后病斑面积为1.1cm2，转基因拟南芥病斑面积为0.51cm2，病情降低了54％，喷施10ng/μl的多菌灵后野生型拟南芥发病面积为0.72cm2，喷施40 ng/μl的多菌灵后野生型拟南芥发病面积为0.52cm2，而喷施10ng/μl的多菌灵后转基因拟南芥发病面积为0.36cm2，显著提高了抗病能力并降低了多菌灵用量，见表7。
表7转Myo5RNAi-4基因拟南芥的抗灰霉病能力鉴定及多菌灵减量应用
综上所述，本发明的肌球蛋白-5 Myo5基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性和防治植物病害的特异性等绿色、安全的突出优点。
序列表
<120> 一种降低肌球蛋白-5蛋白及其在氰基丙烯酸酯类药物抗性治理中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3763
<212> DNA
<213> 肌球蛋白-5基因(人工合成)
<400> 1
atggtactgt ataaactgtc ccgtgttggc gcatactttg ctgacaactc ttgtccaatt 60
tatagggaat atcgagacgc ccgaagaaca agggcgccgg tgcagccgcc gatggcgcaa 120
gcggaggcgc gaagcccaag aaggccacct ttgagacaac caaaaagaag gagattggtg 180
tttccgattt gactctcctc agcaaagtat ccaacgaagc catcaacgag aatttgaaga 240
agcgtttcga ggggcgagag atttatacct acatcggcca tgtgttggtc tctgttaacc 300
ccttccgaga cttgggcatc tacaccgacg atgtccttca gagctatatg ggcaagaatc 360
gactagagat gcctccccac gtcttcgcca tcgccgaggc ctcatactac aacatgaagg 420
catacagcga caaccagtgt gtcattattt caggagagtc cggtaccggc aagacagagg 480
cggcaaagcg cattatgcag tacattgcta gtatgtctgg tggagaatcg ggagatatca 540
agcagatcaa ggacatggtg ctggcaacca accccctact cgaatccttc ggaaacgcaa 600
aaacgctacg aaacaacaac tcgtcacgat tcggaaagta cttgcagatt tacttcaaca 660
cacagggtga gtctgtgggt gccgacatca caaactacct cctcgaaggg ctacgagtgg 720
tgggccagat cacaaacgag cgaaacttcc acatcttcta ccaattcgcc aagggtgcgt 780
cgcaacaata ccgagagaca tttggtgttc aaaagcccga gacctacgtc tacaccagtc 840
ggtcaaaatg cttggacgtc gacggcatcg acgatcttgc cgagttcgaa gatacactca 900
atgcaatgaa ggttattggc ctttctcagc ctgagcaaga tcagatcttc cgcatgttgt 960
cagctatcct atggattgga aacattcagt tccaagaaga ccagggtggt tatgctgaag 1020
tcacagatag gtctgtggtt gatttcgccg cttatctgat ggaggttact cccgatcagc 1080
ttatcaaggg catcacaatc cgaatcttga cacctcgaaa cggcgaagtt atcgaatccc 1140
ccgccaaccc cgcccaagcg caggctactc gggatgccct tgcaatggcc atctacagca 1200
accttttcga ctggatcgtc gaacgcatca acaagtctct caaggctcgg caaccaacca 1260
ccaacaccat tggtattcta gatatttatg gatttgaaat attcgagaag aacaggttta 1320
gtcagctgtg cactaattat gtcaacgaaa agttgcagca aatgttcatc cagctcaccc 1380
tcaaggccga gcaggaggag tacgctaggg agcagatcca atggacacct atcaagtatt 1440
ttgataacaa ggttgtttgc gatcttattg agcagattcg acctgttggg atcttctccg 1500
ccatgaagga cgccaccaag actgcgcacg ctgatcctgc tgcttgcgat cgtactttca 1560
tgcagagcat caacggcatg tcccacgctc atctcactcc acgacaagga aactttatta 1620
tcaagcatta cgctggtgat gtcacataca ctgttgaagg tattacagat aagaacaagg 1680
atcagcttct gaagggtctg ctggccctct tccaacacag tggaaacgac ttcgttcata 1740
ctctgttccc tcgccctgtc gacacagata accgaaagca gcctccctct agaggtgacg 1800
atttccgagc ctccgctaat gcccttgttg atactctgat gaagtgccag ccttcttaca 1860
tccgtaccat caagccaaac gagaacaagt cgccaacaga atataacggc cccaatgttc 1920
tccatcagat caagtatctt ggtcttcaag aaaacgttcg catcagaaga gccggtttcg 1980
cataccgtca ggacttcgac aagtttgtcg accgattctt ccttctgtca cccgctactt 2040
cctatgctgg tgaatttacc tgggagggca ccacagaggc tgccgtgaag caaattctta 2100
aggatactag cattcccaaa gaagaatggc agatgggtgt cacaaaggcg tttatcaagg 2160
cccccgagac gttgttcgct ctggagcaca tgcgagatag gtactggcac aacatggcta 2220
ctcgaatcca gcgaatgtgg agggcttacc ttgcctaccg agccgaatct gctacgcgaa 2280
tccagcgatt atggcgcaag aagcggaccg gtgctgaatt tctccagctt cgtgaccaag 2340
gccaccaggt ccttggaggt cgcaaggaaa ggcgtcgtat gagtctgttg ggctctcgac 2400
gtttcctagg tgattatatg ggagtcaacg ctagcactgg ccctggtgcc cagatccgca 2460
acgccgcagg cattggctca aacgaaaagg tagtattctc atgccgtggt gagattttag 2520
aggcaaaatt cggacgttcc agcaaggcca gccctcgcat cattgttgta tccaacagca 2580
aattctacat cattgctcag atgcttgtca acggccagcc gcaaatcacc gtggagaagt 2640
cagttcctct gggagccatc aaatttattg gtgtctcctc agctcgtgat gactggttct 2700
ctctgggtat aggatcaccg caagaggctg accccctgat gaactgcatt ttcaagaccg 2760
aaatgtttac tcagatgcag cgagtgatgc caggcggctt caacctcaag atcgccgaga 2820
cgattgagta cgccaagaag cctggcaagc tgcaacaagt caaggtgctg aaggattcac 2880
aagtcccagc cgattactac aagagtggcg cagtgcactg tcaacctggc gagccaccaa 2940
gctcggtctc gaagcccacg cccaagggca agcctgtgcc tcctcgtcct atcactcgcg 3000
gtaagctgat caagcccgga ggacccaatg gcagaccatc tcgcattcaa ggcaaccgag 3060
ccgccaagcc tcgtccagga ggaggtgcgc gggccgttcc tcagccaccg gctgctgtct 3120
ctgccgctgc ttctattcct gctgctgttc cagctccagc tgctgccaca cacaccgctc 3180
tcccaagcca tgctaaagcg gccagcgctg ctggacgagc accgcctccg cctccccctc 3240
ctgctgcccc agcacggcca ccaagcccac ctagggtgat ggccaaggtt ctatacgact 3300
ttgctggcca acgagagaat gaactctcaa tcgccgcggg tgagatagtc gagattgtgc 3360
agaaggagag caatggtaag tacagtccat cacagtccag atagtatagc taagctgacg 3420
agtttctata ggatggtggt tggccaagaa cccccagacc gcacagcagg cttgggttcc 3480
tgcagcatat gttgaggaac aagccccccc agctccccga gctcctccag ctcctccacg 3540
ctccaagccg acacctcctg cacctccggc taagcgtcct gctgccggcc gtaagccggc 3600
cgagctccag cagcgtgatt ctggcatgag cctcaacacg cccaacggat ccgatagccg 3660
tagcagcacc cctacaccta gcctaggtgg tagtttggct gacgctctcc tagccaggaa 3720
gaacgccatg caaaaggaga aggaagacga cgatgactgg tag 3763
<210> 3
<211> 3645
<212> DNA
<213> 肌球蛋白-5基因cDNA(人工合成)
<400> 3
atgggaatat cgagacgccc gaagaacaag ggcgccggtg cagccgccga tggcgcaagc 60
ggaggcgcga agcccaagaa ggccaccttt gagacaacca aaaagaagga gattggtgtt 120
tccgatttga ctctcctcag caaagtatcc aacgaagcca tcaacgagaa tttgaagaag 180
cgtttcgagg ggcgagagat ttatacctac atcggccatg tgttggtctc tgttaacccc 240
ttccgagact tgggcatcta caccgacgat gtccttcaga gctatatggg caagaatcga 300
ctagagatgc ctccccacgt cttcgccatc gccgaggcct catactacaa catgaaggca 360
tacagcgaca accagtgtgt cattatttca ggagagtccg gtaccggcaa gacagaggcg 420
gcaaagcgca ttatgcagta cattgctagt atgtctggtg gagaatcggg agatatcaag 480
cagatcaagg acatggtgct ggcaaccaac cccctactcg aatccttcgg aaacgcaaaa 540
acgctacgaa acaacaactc gtcacgattc ggaaagtact tgcagattta cttcaacaca 600
cagggtgagt ctgtgggtgc cgacatcaca aactacctcc tcgaagggct acgagtggtg 660
ggccagatca caaacgagcg aaacttccac atcttctacc aattcgccaa gggtgcgtcg 720
caacaatacc gagagacatt tggtgttcaa aagcccgaga cctacgtcta caccagtcgg 780
tcaaaatgct tggacgtcga cggcatcgac gatcttgccg agttcgaaga tacactcaat 840
gcaatgaagg ttattggcct ttctcagcct gagcaagatc agatcttccg catgttgtca 900
gctatcctat ggattggaaa cattcagttc caagaagacc agggtggtta tgctgaagtc 960
acagataggt ctgtggttga tttcgccgct tatctgatgg aggttactcc cgatcagctt 1020
atcaagggca tcacaatccg aatcttgaca cctcgaaacg gcgaagttat cgaatccccc 1080
gccaaccccg cccaagcgca ggctactcgg gatgcccttg caatggccat ctacagcaac 1140
cttttcgact ggatcgtcga acgcatcaac aagtctctca aggctcggca accaaccacc 1200
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cagctgtgca ctaattatgt caacgaaaag ttgcagcaaa tgttcatcca gctcaccctc 1320
aaggccgagc aggaggagta cgctagggag cagatccaat ggacacctat caagtatttt 1380
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cagagcatca acggcatgtc ccacgctcat ctcactccac gacaaggaaa ctttattatc 1560
aagcattacg ctggtgatgt cacatacact gttgaaggta ttacagataa gaacaaggat 1620
cagcttctga agggtctgct ggccctcttc caacacagtg gaaacgactt cgttcatact 1680
ctgttccctc gccctgtcga cacagataac cgaaagcagc ctccctctag aggtgacgat 1740
ttccgagcct ccgctaatgc ccttgttgat actctgatga agtgccagcc ttcttacatc 1800
cgtaccatca agccaaacga gaacaagtcg ccaacagaat ataacggccc caatgttctc 1860
catcagatca agtatcttgg tcttcaagaa aacgttcgca tcagaagagc cggtttcgca 1920
taccgtcagg acttcgacaa gtttgtcgac cgattcttcc ttctgtcacc cgctacttcc 1980
tatgctggtg aatttacctg ggagggcacc acagaggctg ccgtgaagca aattcttaag 2040
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cccgagacgt tgttcgctct ggagcacatg cgagataggt actggcacaa catggctact 2160
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ttcctaggtg attatatggg agtcaacgct agcactggcc ctggtgccca gatccgcaac 2400
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aaggagagca atggatggtg gttggccaag aacccccaga ccgcacagca ggcttgggtt 3360
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gccgagctcc agcagcgtga ttctggcatg agcctcaaca cgcccaacgg atccgatagc 3540
cgtagcagca cccctacacc tagcctaggt ggtagtttgg ctgacgctct cctagccagg 3600
aagaacgcca tgcaaaagga gaaggaagac gacgatgact ggtag 3645
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-1F(人工合成)
<400> 3
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<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-1R(人工合成)
<400> 4
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt ctcccgattc tccaccagac a 51
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-2F(人工合成)
<400> 5
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<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-2R(人工合成)
<400> 6
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<212> DNA
<213> 引物MRNAi-3F(人工合成)
<400> 7
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<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-3R(人工合成)
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 引物MRNAi-4F(人工合成)
<400> 9
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<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-4R(人工合成)
<400> 10
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<212> DNA
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<400> 12
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<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-6F(人工合成)
<400> 13
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<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-6R(人工合成)
<400> 14
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gaagccgcct ggcatcactc g 51
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-7F(人工合成)
<400> 15
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg gatcaccgca agaggctgac c 51
<210> 16
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-7R(人工合成)
<400> 16
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gggcttggtg gccgtgctgg g 51
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-8F(人工合成)
<400> 17
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc tggacgagca ccgcctccgc c 51
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物MRNAi-8R(人工合成)
<400> 18
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ccagtcatcg tcgtcttcct tc 52