一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法
阅读说明：本技术 一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法 (Method for detecting bioactive substances based on gold surface modified cucurbit [7] uril ) 是由 梁峰 武启发 王亚奇 曾艳 于 2021-07-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法,利用金表面修饰葫芦[7]脲,结合电流-电压检测手段或电化学阻抗谱测试手段,根据引入生物活性物质后产生的电化学阻抗或跨膜电流的变化信息,实现对生物活性物质的测定。本发明利用金表面修饰葫芦[7]脲构建电化学传感器,采用电化学方法利用主客作用来实现对待测生物活性物质的识别；所得传感器性质稳定、重复性好,灵敏度高、选择性好,适合推广应用。(The invention discloses a method for detecting bioactive substances based on gold surface modified cucurbit [7] urils, which utilizes the gold surface modified cucurbit [7] urils to combine with a current-voltage detection means or an electrochemical impedance spectrum test means and realizes the determination of the bioactive substances according to the change information of electrochemical impedance or transmembrane current generated after the bioactive substances are introduced. The invention uses gold surface modified cucurbit [7] uril to construct an electrochemical sensor, and adopts an electrochemical method to realize the identification of the bioactive substances to be detected by using the host-guest action; the obtained sensor has stable property, good repeatability, high sensitivity and good selectivity, and is suitable for popularization and application.)
技术领域
本发明属于超分子材料及其检测技术领域，涉及一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法。
背景技术
生物活性分子是指对生命现象具有重要影响的少量或微量物质，包括肽类、核酸、蛋白质、氨基酸、酶和维生素等。作为蛋白质的组成成分，氨基酸和肽类具有丰富的功能性侧链基团，这使得它们在生理过程中的作用极为重要。然而由于生物活性分子一般都具有多样性、复杂性，在生命体中许多有效成分的含量可能又极其低微，而在传统的研究模式中，生物活性分子的有效成分的分离提取与检测实验往往是脱节的，使得对微量生物活性分子的检测手段存在费时费力等问题。
目前，电化学方法用于检测氨基酸及其他生物活性分子已展示出简单、灵敏、成本低、检测快速等优势。然而，在超分子快速识别生物活性分子的电化学技术中，由于超分子主体与生物活性分子的结合大多都是基于主客结合能力，这就使得基于超分子主客作用能够识别的生物活性分子比较单一、适用的生物活性分子种类少、且往往需要专业的操作人员进行检测。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法，该方法可实现对多种氨基酸、多肽的高灵敏度测试及对多种蛋白质的特异性识别；且涉及的测试方法简单、操作方便，适用性广，重复性好；适合推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于金表面修饰葫芦[7]脲检测生物活性物质的方法，包括如下步骤：利用金表面修饰葫芦[7]脲，分别结合电流-电压检测手段或电化学阻抗谱测试手段，根据引入生物活性物质后产生的跨膜电流或电化学阻抗变化，建立跨膜电流或电化学阻抗变化与生物活性物质之间的关系，实现对生物活性物质的测定；其中金表面修饰葫芦[7]脲为基于葫芦[7]脲和金纳米球的自组装纳米通道膜或葫芦[7]脲修饰金电极。
上述方案中，所述生物活性物质为氨基酸、多肽或蛋白质。
上述方案中，所述基于葫芦[7]脲和金纳米球的自组装纳米通道膜包括基底(可羟基化基底)及依次设置在其表面的若干层葫芦[7]脲修饰金纳米球层和聚甲基丙烯酸甲酯表层；其中葫芦[7]脲修饰金纳米球层具有金纳米球粒子堆积形成的多孔结构，葫芦[7]脲采用浸渍自组装工艺包覆在金纳米球粒子表面，金纳米球的粒径为13-16nm。
上述方案中，所述基底可选择硅基底或石英片基底等。
上述方案中，所述基于葫芦[7]脲和金纳米球的自组装纳米通道膜通过对硅片基底依次进行表面羟基化改性、巯基改性、金纳米颗粒组装、葫芦脲修饰、聚甲基丙烯酸甲酯旋涂改性和薄膜脱除步骤而成；其中表面羟基化改性依次置于NaOH溶液和HNO3溶液中进行浸泡处理，再进行洗涤、干燥实现；巯基改性步骤通过将羟基化改性硅片置于巯基硅烷溶液中浸泡，水洗、干燥实现；所述金纳米颗粒组装过程通过加入金纳米球溶液中浸泡、洗涤、干燥实现；葫芦脲修饰步骤通过置于葫芦[7]脲(2～5×10-3M)溶液中浸泡、洗涤、干燥实现；聚甲基丙烯酸甲酯旋涂改性步骤采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液；膜脱除步骤通过浸泡在氢氟酸溶液中断开巯基硅烷中的硅氧键实现。
上述方案中，所述NaOH溶液的浓度为0.08～0.12mol·L-1；HNO3的浓度为0.08～0.12mol·L-1；巯基硅烷溶液的浓度为3～5wt％，溶剂为丙酮或甲苯；金纳米球溶液的浓度为(2.08-5.85)×10-9mol/L，最大紫外吸收峰为520nm，对应的吸光度为0.98；葫芦[7]脲溶液的浓度为2～5×10-3M；聚甲基丙烯酸甲酯溶液的浓度为10～12wt％，溶剂为氯苯或四氢呋喃；氢氟酸溶液的浓度为1～5wt％。
优选的，重复金纳米颗粒组装、葫芦脲组装步骤，所得葫芦[7]脲修饰金纳米球层的层数为1-4层。
本发明通过在硅片基底上修饰巯基硅烷连接金纳米球，再利用金纳米球与葫芦脲之间的静电相互作用进行层层组装，形成若干个具有多孔结构的葫芦[7]脲修饰金纳米球层，表面旋涂聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以便于将金纳米颗粒和葫芦脲的组装体从基底上取下来构建纳米通道膜，实现其对蛋白质的高效、特异性识别。
上述方案中，所述葫芦[7]脲修饰金电极通过将葫芦[7]脲溶液滴加金电极表面，置于0-4℃条件下过夜干燥，等电极表面上溶剂挥发后形成了一层均匀的葫芦[7]脲修饰层。
优选的，所述金电极进行表面修饰前进行预处理，依次包括抛光(三氧化二铝粉末)、清洗、表面活化、二次清洗和干燥步骤。
上述方案中，所述表面活化步骤采用食人鱼溶液(98％硫酸:30％过氧化氢＝7:3)，活化处理时间为10-20min。
上述方案中，所述葫芦[7]脲溶液的浓度为6.0-6.4×10-6mol/L。
本发明通过在金圆盘电极表面修饰上葫芦[7]脲分子，另一端的羰基可以特异性地结合客体分子，将溶液中的待测分子富集到电极表面，在电化学交流阻抗(EIS)图谱中可以准确而灵敏地观察到信号的变化，通过电荷转移电阻Rct的变化对多种单一氨基酸或多肽进行高灵敏度的定量检测。
优选的，采用葫芦[7]脲修饰金电极和电化学阻抗谱测试方法，根据测得的电化学阻抗的变化实现对单一氨基酸或多肽的定量检测；采用基于葫芦[7]脲和金纳米球的自组装纳米通道膜和电流-电压检测手段根据跨膜电流的变化，实现对溶菌酶的特异性检测。
上述方案中，所述氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸或脯氨酸；多肽为多肽F-V-N或多肽P-K-V等。
上述方案中，所述电流-电压检测方法采用的工艺条件包括：采用基于葫芦[7]脲和金纳米球的自组装纳米通道膜，将其组装在电流-电压检测体系的外导线部位，采用的电解液由KCl和PBS缓冲液混合而成，其中KCl的浓度为0.08-0.12mol/L，PBS缓冲液的浓度为0.01-0.05mol/L，连接电流计仪器和Ag/AgCl电极，设定扫场电压为-2V～+2V，测试引入蛋白质后的传输电流值(I-V)；测试温度为室温。
上述方案中，所述溶菌酶(或细胞色素C、牛血清蛋白等其他蛋白质)引入电解质溶液中，其在电解质溶液中的浓度为10-5-10-6mol/L。
上述方案中，所述电化学阻抗谱测试方法(EIS)采用的工艺条件包括：采用三电极体系，参比电极为饱和甘汞(SCE)电极，对电极为铂(Pt)电极，电解质溶液为含有0.08-0.12mol/L KCl、4-6mmol/L K3[Fe(CN)6]和4-6mmol/LK4[Fe(CN)6]的混合溶液；初始电位设置为0.19-0.20V，频率范围为0.1Hz～100KHz；测试温度为室温。
上述方案中，所述电化学阻抗谱测试方法测试步骤中，采用的氨基酸或多肽溶液的浓度为0.01～20nmol/L；三电极体系固定在电解质溶液中；氨基酸(或多肽)溶液滴加至电解质溶液中，其中氨基酸(或多肽)溶液与电解质溶液的体积比为1:(1250～1875)。
上述方案中，对蛋白质(溶菌酶)的响应性能主要是通过跨膜电流大小考察的。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明通过制备葫芦[7]脲分子修饰的金圆盘电极或利用葫芦[7]脲和金纳米球构建自组装的纳米通道膜，通过利用主客作用来实现对待测物的识别原理制备的传感器性质稳定、重复性好；其中结合葫芦[7]脲分子修饰的金圆盘电极和电化学阻抗谱测试手段可实现对多种类型的氨基酸和多肽的高灵敏度识别；结合葫芦[7]脲和金纳米球构建自组装的纳米通道膜和电流-电压检测手段可实现溶菌酶的快速的原位检测。
2)本发明首次提出在基板上依次构建多层具有多孔结构的葫芦[7]脲修饰金纳米球层通过聚甲基丙烯酸甲酯旋涂技术成膜，随着修饰层数的增加，增加蛋白质过膜接触作用，有望进一步提高蛋白质的检测精度。
3)本发明基于金表面修饰葫芦[7]脲和电化学检测技术的生物活性物质检测方法，具有灵敏度高、选择性好、适应性广等优点，且涉及的操作简单，适合推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1、对比例1～2中所述葫芦[7]脲-金纳米球自组装纳米通道膜的制备工艺示意图；
图2为本发明实施例、对比例1～2制备葫芦[7]脲-金纳米球构建自组装通道膜旋涂PMMA装置及膜转移的过程；
图3为本发明实施例1对硅片修饰过程中的亲疏水性质的变化图；
图4为本实施例所得PMMA复合膜的SEM图；
图5为本实施例所得PMMA复合膜的EDS图；
图6为实施例1、对比例1～2中分别在10μM和100μM浓度条件下牛血清蛋白、细胞色素C、溶菌酶的I-V曲线变化图。
图7为本发明实施例2-8所述葫芦[7]脲修饰金电极的制备与传感过程示意图；
图8为本发明实施例2-8所述葫芦[7]脲修饰金圆盘电极前后的交流阻抗图谱对比图；
图9为本发明实施例2所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度苯丙氨酸作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图10为本发明实施例3所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度色氨酸作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图11为本发明实施例4所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度组氨酸作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图12为本发明实施例5所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度赖氨酸作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图13为本发明实施例6所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度脯氨酸作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图14为本发明实施例7所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度多肽F-V-N作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
图15为本发明实施例8所得葫芦[7]脲修饰金圆盘电极与不同浓度多肽P-K-V作用后的(a)交流阻抗图和(b)Rct值与底物浓度的线性关系图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种利用葫芦[7]脲-金纳米球的纳米通道膜检测溶菌酶的方法，其工艺流程图见图1，包括如下步骤：
1)将洗净的硅片在0.1mol·L-1的NaOH溶液中浸泡6min，然后在0.1mol·L-1的HNO3溶液中浸泡12min，进行表面羟基化改性，再用过量的去离子水洗涤硅片，并在N2气流下干燥；
将上述所得羟基化改性硅片浸入5wt％巯基硅烷的丙酮溶液中，室温下浸泡12h，然后用去离子水洗去多余的巯基硅烷，并在氮气流中干燥；
2)将步骤1)所得硅片在4℃条件下浸泡在金纳米球溶液中(金纳米球的粒径为13-16nm，浓度为3.97×10-9mol/L，最大紫外吸收峰为520nm，对应的吸光度为0.98)中24h，进行第一层金颗粒的组装，然后用过量的去离子水洗涤硅片，并在N2气流下干燥；
将经上述步骤组装所得硅片浸泡在葫芦[7]脲(3×10-3M)液中2h，利用葫芦脲和金纳米球之间的静电交互作用组装第二层，然后同样用去离子水水洗，氮气吹干；
重复以上步骤3次，每次浸泡时间2h，交错修饰，得到具有4层结构组装体；
3)将步骤2)所得负载有葫芦脲和金纳米球组装体的硅片固定在载玻片上；用胶头滴管取0.5mL浓度为10wt％的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的氯苯溶液，在250r/min的转速下，均匀地滴在硅片表面，旋涂2min，使PMMA溶液在硅片上平铺均匀；然后在1000r/min的转速条件下旋涂15min以去除多余的溶剂；
4)将经步骤3)旋涂处理的硅片浸泡在浓度为2wt％的氢氟酸溶液2h，以断开巯基硅烷中的硅氧键，得到葫芦[7]脲与金纳米球层层组装的PMMA复合膜，并浸泡于去离子水中保存；
5)将制备好的PMMA复合膜夹在聚四氟乙烯模具中，以KCl和PBS缓冲液的混合液为电解质溶液，其中KCl的浓度为0.1M，PBS溶液的浓度为0.01M(pH＝7.0)，具体配制步骤为：分别取提前配置好的23mL0.2mol/L NaH2PO4和77mL Na2HPO4，混合后取60mL并加水稀释至200mL，再加入1.4912g KCl摇匀；连接电流计仪器和Ag/AgCl电极，通过设定扫场电压(-2V到+2V)，测试相应的蛋白质传输电流值(I-V)；其中采用的测试温度为25℃，每次测试均重复5次，然后取电流的平均值；将0.015g的溶菌酶分别溶解于10mL的0.1M KCl 0.01M PBS(pH＝7.0)电解质溶液，配制成100μM的蛋白质溶液，随后分别稀释至10μM；测试(0.1M KCl0.01M PBS(pH＝7.0)作为空白溶液)通道对浓度为10μM和100μM牛血清蛋白的响应性能。
图3为本实施例对硅片修饰过程中的亲疏水性质的变化图，结果表明：未修饰的硅片，由于经过前处理后表面有大量羟基，测试接触角为32.5°±1°；修饰巯基硅烷后，浸润性改变，接触角增大为46.5°±1°；随着金纳米颗粒和葫芦脲的不断修饰，界面越来越亲水，接触角越来越小；同时可进一步证明金纳米颗粒和葫芦脲的组装体在基底上的成功构建。
图4为本实施例所得复合膜的SEM图，可以看出所得硅片上均匀分布着金纳米颗粒。
图5为本实施例所得PMMA复合膜的EDS图，经组装之后制备的膜与纯的PMMA膜和相比，出现了新的N1s、S2p、Au4f的特征峰。
对比例1
一种利用葫芦[7]脲-金纳米球的纳米通道膜检测细胞色素C的方法，该方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤5)中分别配置浓度为10μM和100μM的胞色素C溶液(0.0009g的细胞色素C)，分别测试通道对浓度为10μM和100μM胞色素C的响应性能。
对比例2
一种利用葫芦[7]脲-金纳米球的纳米通道膜检测牛血清蛋白的方法，该方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤5)中分别配置浓度为10μM和100μM的牛血清蛋白溶液(0.0664g牛血清蛋白)，分别测试通道对浓度为10μM和100μM牛血清蛋白的响应性能。
图6为实施例1～3中，分别在10μM和100μM浓度条件下牛血清蛋白、细胞色素C、溶菌酶的I-V曲线变化图，结果表明：当测试溶菌酶溶液的时候，跨膜电流减小，而对于其他两种蛋白质则没有明显的变化，说明本发明所得组装膜对溶菌酶具有特异性识别作用。
实施例2
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测苯丙氨酸的方法，流程示意图见图7，具体包括如下步骤：
1)电极的预处理：金电极(GE)用平均粒径为0.05μm的三氧化二铝粉末进行抛光；依次用超纯水、无水乙醇和超纯水分别在超声条件下清洗5min；然后将食人鱼溶液(98％硫酸:30％过氧化氢＝7:3)滴在清洗后的电极表面活化处理10min，置于超纯水中超声清洗5min，用氮气干燥，得干净的金电极；
2)电极的修饰：选用的金电极(GE)直径为3mm，葫芦[7]脲分子(CB[7])空腔直径为0.73nm，根据50％的覆盖率计算，向电极表面滴加5μL浓度为6.2×10-6M的CB[7]溶液，利用金与葫芦脲端口羰基的识别能力，将葫芦脲固定在金电极表面，随后将电极置于4℃条件下过夜，即得CB[7]修饰的GE电极；
3)电化学测试选用三电极体系，参比电极为饱和甘汞(SCE)电极，对电极为铂(Pt)电极，电解质溶液为含有0.1M KCl、5mM K3[Fe(CN)6]和5mM K4[Fe(CN)6]的溶液；
4)称取0.0124g的L-Phe(苯丙氨酸)溶解于5mL的超纯水，配制成浓度为1.5×10-2M的氨基酸水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM；将步骤3)所述三电极体系固定在7.5mL电解质溶液中，具体配制步骤为：分别称取质量为1.491g的KCl、0.3292g的K3[Fe(CN)6]、0.4223g的K4[Fe(CN)6]溶解于200mL蒸馏水摇匀，再加入5μL上述不同浓度的氨基酸溶液，25℃室温条件下进行EIS测试，其中控制初始电位设置为0.195V，频率范围为0.1Hz～100KHz。
图8为本实施例所得金圆盘电极修饰葫芦脲前后的电化学交流阻抗进行对比图，结果表明：在含有0.1M KCl、5mM K3[Fe(CN)6]和5mM K4[Fe(CN)6]的电解质溶液中，裸电极Bare-GE(金电极)的电荷转移电阻Rct大约为190Ω，而葫芦[7]脲修饰的金电极体系(CB[7]负载的GE)中电荷转移电阻Rct显著降低至58Ω。
图9为本实施例所得改性金电极与不同浓度苯丙氨酸作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与氨基酸浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测苯丙氨酸(L-Phe)的线性拟合方程为Rct＝294.79lg CPhe(pM)+152.552，R2＝0.9970；检测下限(LOD)为1.18pM。
实施例3
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测色氨酸的方法，其检测方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0153g的L-Trp(色氨酸)溶解于5mL的超纯水，配制成1.5×10-2M的氨基酸水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM。
图10为本实施例所得改性金电极与不同浓度色氨酸作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与氨基酸浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测色氨酸(L-Trp)的线性拟合方程为Rct＝90.112lg CTrp(pM)+225.487，R2＝0.9870；检测下限(LOD)为1.63pM。
实施例4
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测组氨酸的方法，其检测方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0116g的L-His(组氨酸)溶解于5mL的超纯水，配制成1.5×10-2M的氨基酸水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM。
图11为本实施例所得改性金电极与不同浓度组氨酸作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与氨基酸浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测组氨酸(L-His)的线性拟合方程为Rct＝115.787lg CHis(pM)+164.952，R2＝0.9650；检测下限(LOD)为1.81pM。
实施例5
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测赖氨酸的方法，其检测方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0110g的L-Lys(赖氨酸)溶解于5mL的超纯水，配制成1.5×10-2M的氨基酸水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM。
图12为本实施例所得改性金电极与不同浓度赖氨酸作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与氨基酸浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测赖氨酸(L-Lys)的线性拟合方程为Rct＝51.244lg CLys(pM)+138.67，R2＝0.9650；检测下限(LOD)为1.83pM。
实施例6
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测脯氨酸的方法，其检测方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0110g的Pro(脯氨酸)溶解于5mL的超纯水，配制成1.5×10-2M的氨基酸水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM。
图13为本实施例所得改性金电极与不同浓度脯氨酸作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与氨基酸浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测脯氨酸(Pro)的线性拟合方程为Rct＝17.051lg CPro(pM)+172.237，R2＝0.9930；检测下限(LOD)为1.28pM。
实施例7
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测多肽F-V-N的方法，其检测方法与实施例1大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0284g的多肽F-V-N溶解于5mL的超纯水中，超声5分钟使其完全溶解，配制成浓度为1.5×10-2M的三肽水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM；将三电极体系固定在7.5mL的电解质溶液中，加入5μL对应的三肽溶液行EIS测试。
图14为本实施例所得改性金电极与不同浓度多肽F-V-N作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的多肽。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与多肽浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测F-V-N的线性拟合方程为Rct＝194.505lg CFVN(pM)+105.602，R2＝0.9670；检测下限(LOD)为1.73pM。
实施例8
一种利用葫芦[7]脲修饰金电极检测多肽P-K-V的方法，其检测方法与实施例6大致相同，不同之处在于：步骤4)中称取0.0257g的多肽P-K-V溶解于5mL的超纯水中，超声5分钟使其完全溶解，配制成浓度为1.5×10-2M的三肽水溶液，随后分别稀释至20nM，10nM，5nM，1.5nM，0.5nM，0.1nM，0.01nM。
图15为本实施例所得改性金电极与不同浓度多肽F-V-N作用后的交流阻抗图和Rct值与底物浓度的线性关系图，其中从等效电路模拟数据中读出对应的电荷转移电阻Rct值，用此电阻值定量溶液中的氨基酸。结果表明：本发明所述检测体系所得Rct值与多肽浓度的对数呈良好的线性关系，在10pM～20nM浓度范围内，检测P-K-V的线性拟合方程为Rct＝59.692lg CPKV(pM)+128.494，R2＝0.9710；检测下限(LOD)为1.71pM。
上述结果表明，本发明所设计的金表面葫芦[7]脲的主客体识别电化学检测氨基酸和多肽的方法以及葫芦[7]脲和金纳米球层层自组装膜对蛋白质的检测方法可以实现对多种氨基酸、多肽、蛋白质的高灵敏检测以及对氨基酸和多肽的定量分析；葫芦[7]脲和金纳米球构建的纳米通道膜能特异性识别溶菌酶：本发明对现有基于葫芦[7]脲修饰金圆盘电极的检测技术可进一步拓宽适用氨基酸种类；葫芦[7]脲和金纳米球构建的纳米通道膜随着层数的增加有望进一步提高溶菌酶的检测精度；可有效解决现有生物活性分子检测技术的局限性与不足，对体内生物活性分子的检测应用有着十分重要的借鉴意义。
上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。